Особенности свободно-радикального окисления в условиях моделирования перитонита у предварительно стрессированных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Особенности свободно-радикального окисления в условиях моделирования перитонита у предварительно стрессированных животных

03.01.04 - биохимия

Нусратов Мушфиг Исмаил оглы

Челябинск - 2011



Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Камилов Феликс Хусаинович

доктор медицинских наук, профессор Шаповалов Петр Яковлевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет им. Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «____»_______________г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "____" ____________ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Н.В. Тишевская



Актуальность

Перитонит, как воспалительный процесс, в основном вызывается в результате абдоминальной инфекции (Арцимович Н.Г. и соавт., 2001; Яковлев С.В., 1999). Вследствие ряда анатомо-физиологических особенностей брюшины очаг воспаления может сравнительно легко делокализоваться. Известно, что брюшинный покров примерно равен по площади кожному покрову (Брискин Б.С. и соавт., 2000). Поэтому воспаление, развивающееся в брюшной полости, быстро приводит к накоплению токсинов как бактериального, так и небактериального (эндогенного) происхождения, способных избирательно или в различных сочетаниях вызывать осложнения вплоть до полиорганной недостаточности, приводящей к летальному исходу (Яковлев М.Ю., 1993). В прогностическом отношении хирурги вернулись к позициям, которые еще в 1926 г. сформулировал С.И. Спасокукоцкий: "При перитонитах операция в первые часы дает до 90% выздоровлений, в первый день - 50%, позже третьего дня - всего 10%". Таким образом, эффективное лечение перитонита, как правило, подразумевает хирургическое вмешательство, что само по себе является стрессорным фактором (Weinert C., Meller W., 2007; Boer R et al.,2008; Шальков Ю.Л., 2010). Вместе с тем, стресс-реакция может возникнуть в динамике развития воспалительного заболевания вследствие цитокин-зависимой активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, что позволяет ограничивать активность лейкоцитарных клеток очага (Корнева Е.А.,1993; Blalock J., 1984; Волчегорский И.А. и соавт., 1993). Но при определённых условиях стресс-реакция может не ограничить, а наоборот усилить воспалительную реакцию. Это предположение базируется на способности стрессорных гормонов одновременно с подавлением продукции провоспалительных цитокинов повышать чувствительность к ним тканей-мишеней (Волчегорский И.А. и соавт., 1998). Кроме того, при стрессе могут усиливаться такие звенья свободно-радикального окисления как перекисное окисление липидов (ПОЛ) и окислительная модификация белков. Между тем, данные экспериментальных и клинических исследований однозначно свидетельствуют о причастности процессов свободно-радикального окисления к развитию осложнений при воспалительной патологии (Zhang R et al., 2002). Этим объясняется эффективность применения антиоксидантной терапии у больных с перитонитом (Козинец В.А., 2010). Известно, что продукты ПОЛ оказывают многостороннее регуляторное влияние на воспалительный процесс. С одной стороны такие продукты ПОЛ как 2-алкенали и 4-гидроксиалкенали выступают в роли хемоаттрактантов для нейтрофильных гранулоцитов (Волчегорский И.А. и соавт.,2000;Hattori H et al.,2010). С другой стороны гидроперекиси ненасыщенных жирных кислот снижают экспрессию молекул адгезии (VCAM-1, ELAM), ослабляя поступление моноцитов в очаг воспаления (Ambravaneswaran V et al., 2010). Напротив, карбонилированные белки усиливают экспрессию этих адгезивных молекул и способствуют моноцитарной / лимфоцитарной инфильтрации воспалительного очага (Postea O et al., 2010). Поэтому, за счёт дополнительного усиления липопероксидации и окисления белков, стрессорные воздействия могут модифицировать выраженность провоспалительных изменений в брюшине.

Известно, что поступление в воспалительный очаг полиморфно - ядерных лейкоцитов и мононуклеаров обеспечивается различными классами хемокинов (Маянский Д.Н.,1991). Вероятно, различные продукты свободно-радикального окисления могут выступать в роли селективных хемоаттрактантов для определённых категорий лейкоцитарных клеток. В связи с этим уместно предположить, что стрессорные воздействия за счёт изменения соотношения между липопероксидацией и окислением белков, способны модифицировать характер лейкоцитарной инфильтрации при перитоните. Однако до сих пор правомерность этого положения не подтверждена экспериментально. Ранее было показано, что предварительные ежедневные одночасовые иммобилизации на протяжении трех суток усиливали лейкоцитарную инфильтрацию при экспериментальном перитоните (Волчегорский И.А. и соавт., 2000). Однако по-прежнему неизвестен характер влияния этого режима повторных стрессорных воздействий на свободно-радикальное окисление в воспалительном очаге и внутренних органах. Безусловно, представляется актуальным изучение соотношения между различными продуктами свободно-радикального окисления и характером лейкоцитарной инфильтрации при септическом перитоните. септический перитонит инфильтрация

Цель исследования

Установить особенности модифицирющего действия стрессорных воздействий на уровень липопероксидации и карбонилирования белков в брюшине и внутренних органах при экспериментальном перитоните.

Задачи исследования

1. Изучить особенности состояния свободно-радикального окисления и характер лейкоцитарной инфильтрации в брюшине ложнооперированных животных.

2. Изучить соотношение между продуктами липопероксидации и окислением белков во внутренних органах ложнооперированных животных.

1. Изучить особенности свободно-радикального окисления и характера лейкоцитарной инфильтрации в брюшине при экспериментальном септическом перитоните.

2. Изучить соотношение между липопероксидацией и окислением белков во внутренних органах в условиях септического перитонита.

3. Изучить тособенности состояния свободно-радикального окисления и лейкоцитарной инфильтрации в брюшине при ежедневных одночасовых иммобилизациях, а также в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне повторных иммобилизаций.

4. Изучить состояние свободно-радикального окисления во внутренних органах при ежедневных одночасовых иммобилизациях, а также в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне повторных иммобилизаций.

Научная новизна

Впервые установлено, что увеличение содержания окислительно-модифицированных белков в брюшине ассоциируется с формированием лейкоцитарного инфильтрата в условиях септического перитонита. Установлено, что предварительное воздействие повторных одночасовых иммобилизаций усугубляет усиление окислительной деструкции белков, вызванное септическим перитонитом. Обнаружено, что повторные стрессорные воздействия характеризуются увеличением содержания молекулярных продуктов ПОЛ, ассоциированным с развитием моноцитарной инфильтрации брюшины. Показано, что развитие моноцитарной инфильтрации брюшины сопряжено с увеличением содержания циркулирующих моноцитов и снижением количества моноцитов в костном мозге. Развитие провоспалительных изменений в печени при ежедневных одночасовых иммобилизациях ассоциируется с увеличением содержания окислительно-модифицированных белков, как в органе, так и в микросомах. Обнаружено, что при септическом перитоните и при ежедневных стрессорных воздействиях соотношение между липопероксидацией и окислением белков имеет органоспецифический характер. Для предварительного действия повторных одночасовых иммобилизаций характерно повышение содержания карбонилированных белков в головном мозге и в почках. При септическом перитоните увеличивается содержание карбонилированных белков в головном мозге и в печени. В почках снижение содержания карбонилированных белков ассоциируется со снижением содержания белка в органе.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты позволяют обосновать представление о провоспалительных эффектах продуктов свободно-радикального окисления белков брюшины при септическом перитоните. На основании выполненных исследований возможно объяснение механизма провоспалительного действия предшествующих стрессорных эпизодов. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых путей фармакологической коррекции септического перитонита, предусматривающих использование антиоксидантов.

Положения, выносимые на защиту

1. Усиление свободно-радикального окисления сопровождает развитие лейкоцитарной инфильтрации брюшины у ложнооперированных животных, а также при септическом перитоните и повторных стрессорных воздействиях.

2. Соотношение между уровнем липопероксидации и окислением белков у ложнооперированных животных, а также при септическом перитоните и повторных стрессорных воздействиях имеет органоспецифический характер.

3.Характерное для септического перитонита, воспроизводимого на фоне предварительных стрессорных воздействий, усиление окислительной деструкции белков в брюшине и в крови сопряжено с усугублением лейкоцитарной инфильтрации брюшины.

Апробация работы

Основные положения работы изложены и представлены на VIII международном конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2007), Всероссийской научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2007), Пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008), 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, 2009), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня ро-ждения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 - в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Вестник Южно-Уральского государственного университета, №4, 2008, Вестник уральской медицинской академической науки, № 2/1 (29), 2010 г.).

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 218 источников: 95 - на русском языке и 123 - иностранных. Работа содержит 26 таблиц, 1 рисунок.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на 350 лабораторных крысах массой 150 - 250 г. обоего пола. Использовались беспородные животные. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными (Кополадзе Р.А.,1998), отражёнными в “Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985).

Для создания экспериментального перитонита использована модель лигирования и последующего однократного пунктирования слепой кишки - cecal ligation and perforation (CLP) (Wichterman K.A., 1980).

В ходе исследования животные были распределены по следующим группам:

1. Интактные животные (Контроль)

2. Ложнооперированные животные (срединная лапаротомия без перфорации слепой кишки)

3. Животные, у которых моделировался септический перитонит (CLP-перитонит)

4. Животные, подвергнутые трехкратным ежедневным одночасовым иммобилизациям.

5. Животные, у которых процедура ложной операции осуществлялась через 24 часа после завершения повторных одночасовых иммобилизаций.

6. Животные, у которых экспериментальный перитонит моделировался через 24 часа после завершения повторных одночасовых иммобилизаций.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов (Шиффовых оснований) определяли спектрофотометрически методом (Львовская Е.И. и соавт.,1991). Определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ производили спектрофотометрическим методом по Львовской Е.И. с соавт. (1998). Для количественного выражения содержания первичных (Е₂₃₂/Е₂₂₀) вторичных (Е₂₇₈/Е₂₂₀) и конечных продуктов (Е₄₀₀/Е₂₂₀) ПОЛ использовались условные единицы окисления (у.е.о.).

Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов (базальный уровень и при индукции окислительной модификации белков Fe²⁺ / H₂O₂, для оценки активности антиоксидантной системы) по методу Е.Е. Дубининой (1995).

Цитозольную фракцию и микросомы печени выделяли методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в микросомах и цитозоле определяли по методу Лоури c соавторами (Lowry O.U. et al., 1951). В микросомах печени определяли скорость О-деалкилирования высокоспецифичного субстрата для изоформы цитохрома Р450 СYP1A1 7-этокси- (ЭРОД) резоруфина флюориметрическим методом по скорости образования резоруфина (Burke M.D. et al, 1985). Суммарную РНК клеток печени выделяли с помощью набора для выделения РНК фирмы Вектор-Бест. Относительное содержание мРНК CYP1A1 определяли методом полуколичественной ОТ-ПЦР. Амплификацию проводили с парами праймеров, специфичными к нуклеотидным последовальностям CYP1A1. Раздел работы по изучению активности и относительного содержания мРНК CYP1A1 выполнен совместно с руководителем лаборатории биохимии чужеродных соединений НИИ Молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, д.б.н., профессором А.Ю. Гришановой.

Изучение периферической крови и перитонеальных смывов проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992) и включало в себя подсчет лейкоцитов в камере Горяева, изучение лейкоцитарой формулы в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Кариоциты костного мозга и лимфоидных органов (также как и лейкоциты крови) подсчитывали в камере Горяева после ресуспендирования в 0,1% растворе метиленового синего в 3% уксусной кислоте. В мазках-отпечатках костного мозга, окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывали количество малодифференцированных клеток грануло-моноцитарного ряда, нейтрофилов, моноцитов-макрофагов и лимфоцитов. Аналогичным образом изучалась морфология клеток на мазках-отпечатках селезёнки.

Данные обрабатывались методами вариационной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). О достоверности различий средних величин судили по критериям непараметрической статистики (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1969): Манна-Уитни (U). О различиях в распределении судили по критериям Колмогорова-Смирнова (л) и Вальда-Вольфовица (WW). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs) и Кенделлу (rk). Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ “Statistica 6.0 for Windows”.

Результаты исследования и их обсуждение

Особенности свободно-радикального окисления в брюшине и внутренних органах ложнооперированных животных

Среди биохимических показателей высокой чувствительностью к стрессу обладает система свободнорадикального окисления. Поэтому правомерно ожидать определённые изменения показателей ПОЛ и окислительной модификации белков у ложнооперированных животных.

В перитонеальных смывах ложнооперированных животных наблюдалось статистически значимое увеличение содержания изопропанол- растворимых Шиффовых оснований (с 0,05±0,004 у.е.о., в контрольной группе до 0,1±0,02 в опытной Р=0,032U, n=13) при одновременном снижении уровня Fe²⁺/аскорбат индуцированного ПОЛ, определяемого по содержанию изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов (с 2,16±0,24 у.е.о.; n=8 до 1,43±0,16 у.е.о; n=7; P=0,037U). Это свидетельствует о снижении окисляемости фосфолипидов, что указывает на низкий уровень антиоксидантной защиты. При этом зарегистрировано появление в перитонеальных смывах нейтрофильных гранулоцитов (до 5,5±3,28 % от общего количества лейкоцитов, Р=0,018U ). В цитологических препаратах контрольных животных эта разновидность лейкоцитарных клеток не обнаружена.

Таблица 1. Влияние ложной операции на содержание молекулярных продуктов ПОЛ и карбонилированных белков во внутренних органах (M±m)

Показатель	Контроль (n=11)	Ложная Операция (n=32)	Р
Головной мозг
ШО [г]	0,043±0,007	0,072±0,01	0,037U
КДиСТ [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	0,96±0,041	1,24±0,03	0,006U
ОМБ	0,57±0,01	0,38±0,02	0,037U
Печень
КДиСТ [и]	1,11±0,02	0,717±0,01	0,037U
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	38,71±2,71	42,44±1,66	0,016U
Почки
КДиСТ [и]	0,119±0,014	0,229±0,06	0,015WW
ДК [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,474±0,185	1,573±0,099	0,015WW
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	25,1±3,17	33,97±2,19	0,016U
Селезенка
ОМБ	38,13±5,47	27,99±3,27	0,015WW
Тимус
ДК [г]	0,749±0,025	0,465±0,014	0,006U
КДиСТ [г]	0,153±0,05	0,07±0,008	0,006U
ШО [г]	0,035±0,005	0,046±0,003	0,048U
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	46,73±4,24	73,17±4,99	0,016U

Примечания к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ); ШО - шиффовы основания (конечные продукты ПОЛ) буквенные подиндексы [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта; ОМБ - продукты окислительной модификации белка. Количество продуктов ПОЛ выражено в единицах индекса окисления, продуктов ОМБ - в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни. WW - критерий Вальда-Вольфовица.

Отмечена положительная корреляционная зависимость между количеством инфильтрировавших брюшину нейтрофилов и уровнем изопропанол - растворимых Шиффовых оснований (Rs= 0,576; P=0,034). По показателям лейкоцитарной формулы между контрольными и ложнооперированными животными отсутствовали статистически значимые различия.

В большинстве исследованных органах ложнооперированных животных наблюдалось изменение значений различных показателей свободнорадикального окисления (таблица 1). В селезёнке отмечено снижение содержания карбонилированных белков. В тимусе изменилось соотношение между различными категориями гептан - растворимых продуктов ПОЛ: наблюдалось снижение содержания диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряжённых триенов при одновременном увеличении содержания Шиффовых оснований и содержания карбонилированных белков в ответ на индукцию.

В печени и почках ложнооперированных животных наблюдался прирост содержания карбонилированных белков в ответ на введение индуктора (таблица 1). В почках наблюдалось увеличение содержания изопропанол-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов при одновременном увеличении окисляемости липидов. В печени, напротив, снижалась окисляемость липидов, и не было обнаружено усиления ПОЛ.

В головном мозге отмечено увеличение окисляемости липидов и содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований (таблица 1).

Полученные результаты по состоянию свободно-радикального окисления во внутренних органах ложнооперированных животных хорошо согласуются с представлениями о хирургическом стрессе как о факторе, провоцирующем нарушения гомеостаза и иммуносупрессии (Ono S, Mochizuki H.,2003).

Особенности свободно-радикального окисления в брюшине и внутренних органах при CLP-перитоните

При септическом перитоните на фоне развития нейтрофильной инфильтрации брюшины (количество нейтрофилов увеличилось с 5,5±3,28 % у ложнооперированных животных (n=6) до 42,6±9,31 % от общего количества лейкоцитов при CLP - перитоните (n=6), Р=0,01U), наблюдалось снижение гептан-растворимых диеновых конъюгатов (с 0,366±0,014 у.е.о. у ложнооперированных животных до 0,307±0,023 в группе «перитонит», Р=0,032U, n = 11 и 32 соответственно), при одновременном увеличении содержания карбонилированного белка в перитонеальном экссудате (с 6,29±1,1 мкМ / г белка у ложнооперированных животных до 10,94±1,89 в группе «перитонит», Р=0,042U, n = 11 и 32 соответственно). При этом отмечена отрицательная корреляционная связь между количеством нейтрофилов в воспалительном очаге и содержанием гептан-растворимых диеновых конъюгатов (Rs= -0,448;P=0,042). Кроме того, отмечено наличие положительной корреляционной связи между содержанием этой категории продуктов ПОЛ и содержанием циркулирующих нейтрофилов (Rs = 0,534; P=0,042).

Таблица 2. Влияние экспериментального перитонита на содержание молекулярных продуктов ПОЛ и карбонилированных белков во внутренних органах (M±m)

Показатель	Ложная Операция (n=11)	Перитонит (n=32)	Р
Головной мозг
ДК [и]	0,730±0,061	2,94±0,191	0,02WW
ДК [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,037±0,92	0,906±0,102	0,03WW
КДиСТ [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,24±0,03	0,875±0,03	0,017U
ОМБ	0,299±0,028	0,869±0,123	0,044U
Печень
ОМБ	7,95±0,89	21,07±1,35	0,006U
Почки
ДК [г]	0,661±0,058	0,48±0,06	0,02WW
ШО[и]	0,020±0,003	0,025±0,002	0,02WW
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	17,43±2,03	13,49±1,21	0,044U
Селезёнка
ДК [г]	0,533±0,058	0,635±0,051	0,03WW
ШО [г]	0,02±0,005	0,04±0,007	0,046U
ОМБ	27,99±3,321	6,92±0,099	0,017U
Тимус
ДК [г]	0,465±0,03	0,965±0,08	0,014U
ШО [г]	0,046±0,008	0,11±0,021	0,03WW

Примечания к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ); ШО - шиффовы основания (конечные продукты ПОЛ) буквенные подиндексы [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта; ОМБ - продукты окислительной модификации белка. Количество продуктов ПОЛ выражено в единицах индекса окисления, продуктов ОМБ - в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни. WW - критерий Вальда-Вольфовица.

Скорее всего, данная категория продуктов ПОЛ оказывает ингибирующее действие на миграцию нейтрофилов в воспалительный очаг, и в данном случае не увеличение, а снижение липопероксидации способствует поступлению нейтрофилов в воспалительный очаг. Полученные данные свидетельствуют, что при экспериментальном септическом перитоните развиваются типичные признаки экссудативно-деструктивного воспаления в виде увеличения количества нейтрофилов в воспалительном очаге.

При моделировании септического перитонита в вилочковой железе отмечено увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов и Шиффовых оснований (таблица 2). В селезёнке (таблица 2), помимо увеличения содержания первичных и конечных гептанофильных продуктов липопероксидации, наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков. В почках количество гептан-растворимых диеновых конъюгатов снижалось на фоне прироста содержания изопропанол-растворимых Шиффовых оснований. Одновременно снижалось и количество карбонилированных белков при индукции. В печени (таблица 2) наблюдалось усиление окислительной деструкции белков, но уровень липопероксидации в органе не претерпел статистически значимых изменений. В головном мозге наблюдался прирост содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов при одновременном снижении содержания продуктов ПОЛ в ответ на индукцию.

Вполне возможно, что характерное для группы «перитонит» усиление окислительной модификации белков отражает напряжение барьерной функции печени в отношении антигенов и токсинов интестинального происхождения.

Особенности свободно-радикального окисления в брюшине и внутренних органах при ложной операции у стрессированных животных

Предварительные стрессорные воздействия сопровождались развитием моноцитарной инфильтрации в брюшине на фоне дополнительного увеличения содержания молекулярных продуктов ПОЛ в перитонеальных смывах ложнооперированных животных (таблица 3). Это проявлялось в увеличении изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Кроме того, в плазме крови наблюдалось увеличение содержания гептан - растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов.

Обращает на себя внимание наличие положительной корреляционной зависимости между изопропанол-растворимыми диеновыми конъюгатами и количеством моноцитов в перитонеальных смывах (Rs=0,627; P=0,032). Следует отметить прямую корреляционную зависимость между содержанием этой категории продуктов ПОЛ в перитонеальных смывах и количеством циркулирующих моноцитов (Rs=0,581; P=0,041).

Таблица 3. Содержание продуктов липопероксидации, моноцитов / макрофагов в крови и перитонеальных смывах стрессированных животных при ложной операции (M±m)

Показатель	Ложная операция (n=7)	Стресс + Ложная операция (n=7)	P
ДК [и] в перитонеальных смывах (у.е.о.)	0,68±0,015	0,769±0,087	0,028WW
КДиСТ [г] в плазме крови (у.е.о.)	0,302±0,028	0,570±0,044	0,016 U
Моноциты/макрофаги в перитонеальных смывах (х109/л)	6,69±0,92	29,63±7,72	0,033 U
Моноциты в крови (х109/л)	0,43±0,04	1,18±0,23	0,006 U

Примечание к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ); буквенные подиндексы [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта;U - Критерий Манна - Уитни, WW - критерий Вальда-Вольфовица



Полученные результаты свидетельствуют о способности повторных стрессорных воздействий модифицировать характер лейкоцитарной инфильтрации брюшины.

Ложная операция у стрессированных животных сопровождалась усилением свободнорадикального окисления в вилочковой железе (таблица 4). Это проявлялось в увеличении содержания всех категорий гептан-растворимых продуктов ПОЛ. В селезенке отмечено снижение уровня Fe⁺² / аскрбат-индуцированного ПОЛ, что свидетельствует о снижении окисляемости фосфолипидов, а также о низкой эффективности антиоксидантных систем.

В головном мозге отмечено снижение содержания карбонилированных белков при индукции Fe⁺² / H₂O₂, но при этом наблюдалось увеличение окислительной модификации белка на базальном уровне. Кроме того, наблюдалось снижение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов, при одновременном возрастании содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ. В печени наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков при индукции. И увеличивалось содержание изопропанол-растворимых Шиффовых оснований (таблица 4). В почках ложнооперированных животных при стрессе не обнаружено изменений свободно-радикального окисления.

Таблица 4. Показатели свободнорадикального окисления во внутренних органах при ложной операции у стрессированных животных

Показатель	Ложная Операция (n=32)	Стресс + Ложная операция (n=32)	Р
Головной мозг
ДК [г]	0,587±0,022	0,814±0,01	0,011U
КДиСТ [г]	0,251±0,041	0,53±0,03	0,011U
ДК [и]	0,728±0,01	0,462±0,02	0,004U
КДиСТ [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,24±0,02	0,94±0,01	0,007U
ОМБ	0,382±0,04	0,489±0,05	0,02WW
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	1,572+0,211	0,575±0,07	0,006U
Печень
ШО [и]	0,025±0,007	0,07±0,004	0,008U
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	45,45±0,014	34,8±0,06	0,015WW
Селезёнка
ДК [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,058±0,17	0,99±0,07	0,037U
Тимус
ДК [г]	0,465±0,08	0,559±0,068	0,017U
КДиСТ [г]	0,07±0,005	0,09±0,003	0,028U
ШО [г]	0,046±0,004	0,055±0,002	0,044U

Примечания к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ); ШО - шиффовы основания (конечные продукты ПОЛ) буквенные подиндексы [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта; ОМБ - продукты окислительной модификации белка. Количество продуктов ПОЛ выражено в единицах индекса окисления, продуктов ОМБ - в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни. WW - критерий Вальда-Вольфовица.

Таким образом, у стрессированных животных последующая процедура ложной операции не привела к усилению окисления белков ни в одном из исследуемых органов за исключением головного мозга. В связи с этим уместно обратить внимание на отсутствие статистически значимых изменений по содержанию карбонилированных белков в сыворотке крови и брюшине у ложнооперированных животных. Вполне возможно, что ложная операция сама по себе предупреждает развитие окислительной деструкции белков или купирует развитие этого процесса.

Так, у неоперированных животных после завершения ежедневных иммобилизаций в вилочковой железе было отмечено увеличение содержания карбонилированных белков (таблица 5).



Таблица 5. Свободно-радикальное окисление во внутренних органах животных при повторных стрессорных воздействиях

Показатель	Контроль (n=7)	Повторные ммобилизации (n=7)	P
Печень
ОМБ	4,171±0,399	6,883±0,543	0,003U
ДК [г]	0,621±0,005	0,704±0,033	0,003 U
КДиСТ [г]	0,145±0,021	0,187±0,051	0,02 U
Почка
ОМБ	1,921±0,207	2,048±0,311	0,003U
Тимус
ОМБ	27,48±3,01	57,12±7,61	0,018U

Примечания к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ) буквенные подиндексы [г] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые гептановой ОМБ - окислительная модификация белка. Количество продуктов ПОЛ выражено в единицах индекса окисления, продуктов ОМБ - в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни.

Для печени при повторных иммобилизациях характерно одновременное усиление липопероксидации и окисления белков. В почках также отмечено увеличение содержания карбонилированных белков (таблица 5).

В микросомах печени также наблюдалось усиление карбонилирования белков на фоне снижения содержания микросомального белка (рисунок 1). Это обстоятельство негативно отразилось на активности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. После завершения повторных стрессорных воздействий наблюдалось снижение активности изоформы цитохрома Р450 CYP1A1. Одновременно отмечено снижение содержания мРНК этой изоформы. Причём при стрессорных воздействиях отмечалось усиление карбонилирования белков как в гомогенатах органа, так и в микросомальной фракции. Усиление окислительной деструкции белков в микросомах сопроваждалось снижением уровня СYP1A1- зависимого монооксигенирования. В то же время, среди белков, подвергнутых окислению, могут быть и компоненты Ah-рецепторного cигнального пути, обеспечивающего экспрессию изоформы цитохромаР450 CYP1A1(Cибиряк С.В. и соавт., 2003).

Рисунок 1. Влияние повторных трехкратных иммобилизаций на состояние микросомальной фракции печени

Примечание к рисунку: данные представлены в процентах от соответствующего показателя контрольной группы (для карбрнилированных белков микросом - в мкМ/г белка). * - статистически значимые отличия (критерий U Манна - Уитни)



Особенности свободно-радикального окисления в брюшине и внутренних органах при CLP - перитоните у стрессированных животных

Предварительные ежедневные иммобилизации существенно повлияли на клеточный состав воспалительного экссудата при экспериментальном перитоните. Это проявлялось в снижении количества нейтрофильных гранулоцитов при одновременном увеличении количества лимфоцитов (таблица 6). Перитонит, воспроизводимый на фоне иммобилизационного стресса, сопровождался повышенным содержанием циркулирующих лейкоцитов.

Таблица 6. Показатели лейкоцитарного звена системы крови и карбонилирования белков перитонеальных смывов при CLP - перитоните у стрессированных животных

Показатель	1 Ложная операция (n=8)	2 Перитонит (n=7)	3 Стресс+ Перитонит (n=10)
Перитонеальные смывы
Лейкоциты (х109/л)	69,17±3,96	74,50±4,16	86,46±6,81
Нейтрофилы (%)	5,5±3,28	42,6±9,31 P1,2=0,014U	22,83±1,87 P2,3=0,017U
Моноциты (%)	10,25±3,06	16,2±2,05	11,5±1,11 P2,3=0,03U
Лимфоциты (%)	84,25±6,25	41,2±5,01 P1,2=0,014U	65,677±4,431 P2,3=0,017U
ОМБ	0,7±0,023	0,77±0,064 P1,2=0,044U	0,97±0,072 P2,3=0,044U
ОМБ (индукция Fe2+ / H2O2)	2,53±0,201	1,49±0,201 P1,2=0,022U	1,41±0,112
Кровь
Лейкоциты (х109/л)	6,9±1,3	6,6±0,9	8,17±0,771 P2,3=0,023WW
Нейтрофилы палочкоядерные (%)	5,6±1,6	14,4±1,9 P1,2=0,036U	16,33±0,951
Нейтрофилы сегментоядерные (%)	14,0±8,58	22,8±2,1 P1,2=0,044WW	27,0±2,113
Моноциты (%)	4,8±0,49	10,0±0,8	6,33±0,523
Лимфоциты (%)	75,6±9,45	52,8±4,46 P=0,044WW	50,33±4,44
Плазма крови
ОМБ	0,542±0,098	0,470±0,056	0,760±0,064 P2,3=0,047U

Примечание к таблице: ОМБ - продукты окислительной модификации белка. Количество продуктов ОМБ выражено в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни. WW - критерий Вальда-Вольфовица.

Дополнительное воздействие воспалительного фактора привело к увеличению циркулирующих нейтрофилов и снижению содержания циркулирующих лимфоцитов.

Перитонит, воспроизводимый после завершения повторных стрессрных эпизодов, характеризовался выраженным усугублением окислительной деструкции белков в очаге воспаления (таблица 6). Это проявлялось более высоким содержанием базального уровня карбонилированных белков в группе «стресс+перитонит» по сравнению с группой «перитонит». Важно подчеркнуть, что усиление окисления белков наблюдалось и в плазме крови (таблица 6), где отмечено более высокое содержание базального уровня карбонилированных белков в группе «стресс+перитонит» по сравнению с группой «перитонит».

В связи с этим уместно обратить внимание на наличие положительной корреляционной связи между количеством лимфоцитов, инфильтрировавших брюшину, и уровнем карбонилированных белков в крови (Rs= 0,642;P=0,031) и в воспалительном очаге (Rs=0,576;P=0,034).

Перитонит, моделируемый после завершения предварительных ежедневных иммобилизаций, характеризуется снижением липопероксидации в иммунных органах (таблица 7). Это проявлялось в снижении содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов в тимусе и в селезёнке. В печени наблюдалось снижение содержания карбонилированных белков при одновременном увеличении содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Важно отметить, что одновременно наблюдалось двухкратное увеличение окисляемости фосфлипидов, свидетельствующее о более высокой обеспеченности органа субстратами липопероксидации. В почках наблюдалось снижение окисляемости фосфолипидов при отсутствии статистически значимых изменений по показателям базального уровня ПОЛ. При этом отмечено возрастание содержания карбонилированных белков. Вероятно, при дефиците субстратов липопероксидации главной мишенью для свободных радикалов становятся белки. Это представление может быть правомерным и в отношении головного мозга, где на фоне повышенного уровня окислительно - модифицированных белков отмечено снижение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований.

Основным итогом выполненного исследования можно считать обнаруженный факт усугубления предварительными стрессорными воздействиями воспалительного процесса в брюшине. Полученные результаты свидетельствуют о способности повторных стрессорных воздействий модифицировать клеточный состав инфильтрата при септическом перитоните. Прежде всего, это связано с собственными провоспалительными эффектами ежедневных иммобилизаций, проявляющихся в формировании моноцитарной инфильтрации перитонеальной полости.

В настоящее время установлено, что направленность регуляторных эффектов стресса по отношению к воспалению определяется характером господствующей адаптационной стратегии (Волчегорский И.А. и соавт., 2000).

Таблица 7. Показатели свободно-радикального окисления во внутренних органах при моделировании перитонита у стрессированных животных (M±m)

Показатель	1 Ложная операция (n=11)	2 Перитонит (n=23)	3 Стресс+ Перитонит (n=11)
Печень
ДК [и]	0,45±0,084	0,356±0,03	0,513±0,04 Р2,3=0,028U
ДК [и] (индукция Fe2+ / H2O2)	0,988±0,02	1,021±0,01	2,15±0,02 Р2,3=0,006U
ОМБ	5,652±0,8	15,87±2,06	7,1±0,9 Р2,3=0,017U
Почки
ДК [г]	0,66±0,06	0,478±0,03	0,502±0,09 Р2,3=0,0035WW
КДиСТ [и] (индукция Fe2+ / аскорбат)	1,57±0,34	1,9±0,09	1,39±0,04 Р2,3=0,01U
ОМБ	3,1±0,5	1,83±0,24	3,1±0,20 Р2,3=0,044U
Селезёнка
ДК [г]	0,533±0,15	0,634±0,07	0,537±0,03 Р2,3=0,01U
ДК [и] (индукция Fe2+ / H2O2)	1,05±0,041	1,03±0,16	1,1±0,08 Р2,3=0,01U
Тимус
ДК [г]	0,46±0,024	0,963±0,071	0,482±0,08 Р2,3=0,01U

Примечания к таблице: ДК - диеновые коньюгаты (первичные продукты ПОЛ), КД и СТ - кетодиены и сопряженные триены (вторичные продукты ПОЛ); ШО - шиффовы основания (конечные продукты ПОЛ) буквенные подиндексы [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта; ОМБ - продукты окислительной модификации белка. Количество продуктов ПОЛ выражено в единицах индекса окисления, продуктов ОМБ - в мкмоль/г белка. U - критерий Манна-Уитни. WW - критерий Вальда-Вольфовица.

Стрессорные воздействия с господствующей толерантной стратегией адаптации обладают способностью повышать чувствительность организма к действию флогогенных факторов. Ранее было показано, что при данном режиме повторных стрессорных воздействий доминирует толерантная стратегия адаптации (Волчегорский И.А.,Цейликман В.Э.,Колесников О.Л.,1998), что проявляется повышенной чувствительностью к действию провоспалительных цитокинов. Следует отметить, что на фоне предварительного стресса ограничивается нейтрофильная инфильтрация, характерная для экспериментального перитонита, и усиливается моноцитарно/лимфоцитарная инфильтрация воспалительного очага. Скорее всего, это связано с различной природой хемокинов в том и в другом случае. Выделяют два основных класса хемокинов-б (например IL-8 ) и-в (например макрофагальный воспалительный белок-I). б -Хемокины опосредуют преимущественно хемотаксис нейтрофилов, в-хемокины-моноцитов и лимфоцитов. При стрессе, также как и при экспериментальном перитоните, наблюдалось усиление свободнорадикального окисления. Известно, что продукты свободно-радикального окисления обладают бактерицидным действием и вносят свой вклад в элиминацию инфекционных агентов при септическом перитоните. Кроме того, они выступают в роли хемоаттрактантов для лейкоцитарных клеток. Предварительные стрессорные воздействия оказывают аддитивное действие на перитонит-зависимое усиление окисления белков в воспалительном очаге. Вполне возможно, что это способствует реализации провоспалительных эффектов стресса применительно к экспериментальному перитониту.



Выводы

1. Нейтрофильная инфильтрация брюшины у ложнооперированных животных ассоциируется с увеличением содержания изопропанол- растворимых Шиффовых оснований и с органо-специфическим изменением содержания продуктов липопероксидации и окисления белков.

2. Развитие экссудативно-деструктивного воспаления при септическом перитоните ассоциируется с увеличением содержания карбонилированных белков и со снижением содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов в брюшине.

3. При септическом перитоните увеличивается содержание карбонилированных белков в головном мозге и в печени. В почках снижение содержания карбонилированных белков ассоциируется со снижением содержания белка в органе.

4. Моноцитарная инфильтрация брюшины при повторных иммобилилизациях, которая развивается на фоне увеличения содержания моноцитов в циркулирующей крови и мобилизацией костномозговых моноцитов, сопряжена с увеличением содержания изопропанол- растворимых диеновых конъюгатов. При повторных иммобилизациях развитие лимфоцитарной инфильтрации в печени ассоциируется усилением окисления белка в органе и в микросомах и снижением содержания мРНК изоформы цитохрома Р450 CYP1A1.

5. Наблюдаемое при моделировании экспериментального перитонита на фоне предварительных стрессорных воздействий усиление лейкоцитарной инфильтрации, а также преобладание в воспалительном очаге лимфоцитов ассоциируется с увеличением содержания карбонилированных белков в брюшине и сыворотке крови. Предварительное действие повторных иммобилизаций сопровождается повышением содержания карбонилированных белков в головном мозге и в почках.



Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Борисенков, А.В. Нейротропные и гепатотропные эффекты иммунопрепарата беталейкина / Борисенков А.В, Нусратов М.И., Сысаков Д.А., Цейликман В.Э., Синицкий А.И. / Здоровье и образование в XXI веке. Научные труды VIII международного конгресса.- 2007.- С.156.- РУДН, Москва.

2. Сысаков, Д.А. Влияние иммобилизационного стресса и пирогенала на чувствительность к 2,3,7,8 тетрахлор - р - дибензодиоксину / Сысаков Д.А., Синицкий А.И., Нусратов М.И., Чарная Л.Ф., Маляр К.В., Тимофеева Т.Г. / Вятский медицинский вестник №4, 2007. Материалы Всероссийской научно - практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии», посвященной 20-летию Кировской государственной медицинской академии. - с.140.

3. Цейликман, В.Э. Биохимические стратегии адаптации в условиях хронического стресса / Цейликман В.Э., Цейликман О.Б., Лавин Е.А., Нусратов М.И., Лаптева И.А., Романов Д. А. / Вестник ЮРГУ образования здоровья и физической культуры.- №14.- 2008.- С.56.

4. Цейликман, В.Э Механизм супрессии CYP1A1 - зависимого монооксигенирования при стрессорных воздействиях с повышенной устойчивостью к гипоксии / Цейликман В.Э., Гришанова А.Ю., Нусратов М.И. /Патогенез. Материалы Пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция».-2008.-№3.-С.93.

5. Нусратов, М.И. Влияние повторных эпизодов иммобилизационного стресса на клеточный состав воспалительного очага и реакции системы крови при экспериментальном перитоните / Нусратов М.И., Иванов П.В./ Материалы Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица, 5-8 октября 2009 г. Челябинск с.62-63.

6. Tseilikman, V.E. Stress-induced hepatitis and sensitivity to pro-inflammatory cytokines and glucocortikoids / European journal of Immunology Supplement 1/09. / V.E.Tseilikman, O.B. Tseilikman, M.I. Nusratov, S.V.Popov, D.A.Kozochkin./ Immunity for life Immunology for health Abstracts 2^nd European congress of Immunology September 13-16, 2009 Berlin, Germany.

7. Цейликман, В.Э. Модифицирующее влияние хронического стресса на реакцию лейкоцитарного звена системы крови и процессы свободнорадикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните / Цейликман В.Э., Нусратов М.И., Попов С.В., Плеханова Е.В., Деев Р.В. / Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. - № 2/1 (29), 2010 г.

Размещено на Allbest.ru

...