Актуальность проблемы. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК), или мезенхимальные стромальные клетки-предшественники являются стволовыми клетками взрослого организма, которые локализуются в костном мозге, жировой ткани, а также в ряде других тканей и органов. Эти клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом, являются самообновляющейся популяцией клеток, поддерживающих свое недифференцированное состояние, а также способны к дифференцировке в определенные типы клеток под действием дифференцировочных стимулов [Fridenstein A.J. et al., 1976; Caplan A.I., 1994; Prockop D.J., 1997, 2003; Bruder S.P. et al., 1997; Pittenger M.F. et al., 1999; Bianco P. et al., 2001; Barry F.P. et al., 2004; Fibbe W.E., 2002; Grove J.E. et al., 2004; Wagner W. et al., 2005]. В свою очередь, мультипотентность МСК определяет выполняемую ими уникальную функцию формирования, поддержания и репарации тканей, а также лежит в основе современных технологий тканевой инженерии. В связи с этим, со времен открытия этих клеток А.Я. Фриденштейном интерес к ним непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении функционирования МСК in vivo и in vitro.

Одним из таких вопросов является функциональное состояние клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода. Парциальное давление кислорода во внеклеточной среде, обуславливающее концентрацию внутриклеточного кислорода, является одним из существенных факторов, определяющих жизнедеятельность любой клетки, в том числе, стволовой. Поддержание этого параметра в узких пределах является важнейшим компонентом гомеостаза и необходимо для предупреждения в клетке повреждений различного характера. Наиболее частым нарушением постоянства газового состава среды является снижение парциального давления кислорода во внеклеточной среде, или гипоксия. МСК могут оказываться в условиях пониженного содержания кислорода, обусловленного экзогенными факторами, рядом патофизиологических механизмов, а также ограниченным кровоснабжением имплантированных систем доставки клеток-предшественников (носителей) в место повреждения при применении современных репаративных технологий. Пониженное содержание кислорода может оказывать модифицирующее влияние на характеристики мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, отражающие их морфофункциональное состояние, такие как их жизнеспособность, способность к пролиферации, дифференцировочный потенциал, а также морфологические и иммунофенотипические показатели, что, в свою очередь, может влиять на протекание репаративных процессов в ткани. В противовес долгой истории изучения гипоксии на организменном уровне, гипоксическое воздействие на культивируемые клетки исследовано значительно меньше. В частности, работы, посвященные воздействию пониженного содержания кислорода на культивируемые МСК, немногочисленны, затрагивают какие-либо отдельные характеристики клеток-предшественников, а их результаты зачастую противоречивы [Lennon D. P. et al., 2001; Salim A. et al., 2004; Ren H. et al., 2006; Pacary E. et al., 2006; Malladi P. et al., 2006; Lin Q. et al., 2006]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование функционального состояния мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в условиях пониженного содержания кислорода является актуальной задачей клеточной биологии.

Цель исследования: изучение влияния пониженного содержания кислорода на морфо-функциональное состояние мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс на разных этапах культивирования.

Задачи исследования:

Характеристика мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс. МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались высокой степенью гетерогенности, которая выражалась в существовании в культуре разных клеточных типов, отличающихся по морфологии и скорости пролиферации. Используя в качестве критериев для классификации особенности организации цитоплазмы клеток, а также их форму и размер, в культурах МСК костного мозга крыс возможно было выделить три основных клеточных типа. Клетки первого типа обладали однородной по оптической плотности цитоплазмой, имели веретеновидную, треугольную или звездчатую форму, и небольшой размер. Клетки второго типа характеризовались неоднородной по оптической плотности цитоплазмой и различались по размеру и форме. Клетки третьего типа характеризовались негомогенной цитоплазмой с хорошо заметной исчерченностью, они имели полигональную, округлую или неправильную форму без отростков или с большим количеством отростков, часто располагающихся на противоположных полюсах клетки, а их размеры варьировали в очень широких пределах. МСК первого и второго типов активно пролиферировали, в то время как клетки третьего типа отличались сниженной пролиферативной активностью.

Длительные культуры МСК (К1, К2, К3) были получены от трех животных в ходе субкультивирования клеток в течение более чем 30 пассажей и, фактически, представляли собой отдельные клеточные линии со стабильными морфологическими и иммунофенотипическими характеристиками. Следует отметить, что каждая из полученных длительных культур стромальных клеток-предшественников после длительного культивирования состояла, в отличие от культур МСК на ранних пассажах, из морфологически однотипных клеток, однако сами культуры отличались друг от друга по доминирующему клеточному типу.

Несмотря на нормированные условия культивирования (состав среды культивирования, количество сыворотки в среде, используемый культуральный пластик, начальная плотность посадки), получаемые клеточные популяции различались по пролиферативной активности. Однако общей тенденцией было поддержание более высокой скорости пролиферации клеток в течение первых пассажей и ее значительное снижение, в среднем, к 4 пассажу. Среднее для различных культур число удвоений популяции за 96 часов культивирования составляло 1,9 для первого пассажа, 1,7 - для второго, 1,3 - для третьего и 0,7 для четвертого, а среднее время удвоения популяции насчитывало 64 и 66 часа на первом и втором пассажах, увеличиваясь до 150 часов уже на третьем пассаже. Следует отметить, что на ранних этапах культивирования преобладали клетки первого и второго типов, в то время как доля клеток третьего типа не была превалирующей, а спад пролиферативной активности сопровождался доминированием в культурах медленно делящихся распластанных клеток третьего типа. При дальнейшем субкультивировании это, так называемое, “пролиферативное торможение” сменялось подъемом пролиферативной активности, сопровождающимся появлением и последующим доминированием в культурах однородных по морфологии клеток. Пролиферативная активность МСК при дальнейшем культивировании не только стабилизировалась, но и увеличивалась по сравнению с первичными культурами и культурами на ранних пассажах. Этот факт, вероятно, мог быть обусловлен, с одной стороны, большей гомогенностью культур, а с другой стороны, адаптацией клеток к условиям культивирования. Время удвоения популяций во всех трех длительно поддерживаемых культурах возрастало по сравнению со временем удвоения популяций, характерным для первичных культур и культур на ранних пассажах, было стабильным и составляло, в среднем, 21 час.

Для исследуемых клеток была характерна экспрессия участвующих в процессах адгезии, миграции, рециркуляции, организации внеклеточного матрикса поверхностных молекул, выявляемых на мезенхимальных стромальных клетках-предшественниках и указывающих на их функциональную вовлеченность в межклеточные взаимодействия и взаимодействия с внеклеточным матриксом. Так, на начальных этапах культивирования от 98,0 до 99,9 % клеток в различных культурах экспрессировали маркер CD90 (Thy-1). Такая же высокая степень экспрессии была характерна и для поверхностного антигена CD29 - в1 интегриновой цепи. Для 92,3 - 99,5 % клеток и для 96,9 - 99,7 % клеток была характерна экспрессия маркеров CD54 (рецептор в2 интегринов) и CD44 (рецептор гиалуроновой кислоты и других лигандов, играющих важную роль в организации внеклеточного матрикса) соответственно. Маркер CD73 (мембраносвязанная экто-5'-нуклеотидаза) экспрессировали от 61,9 до 94,6 % клеток. Количество клеток, положительных по маркеру CD106 (рецептор в1 интегринов) варьировало в широких пределах и составляло от 3,3 до 47,1 %. В полученных популяциях МСК костного мозга крыс незначительная доля клеток на ранних пассажах несла на своей поверхности общий лейкоцитарный антиген CD45 и характерный для моноцитов и макрофагов маркер CD11b, экспрессия которых не определялась при дальнейшем культивировании. Описанный иммунофенотип сохранялся и в случае длительного культивирования МСК в течение достаточно долгого времени после преодоления пролиферативного торможения. Изменения в экспрессии некоторых маркеров в двух из трех длительно поддерживаемых культурах МСК наблюдались только после более чем 200 удвоений популяций.

При оценке дифференцировочного потенциала клеток-предшественников было показано, что во всех культурах МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования количество клеток, в которых определялась активность ЩФ, увеличивалось в ответ на остеогенные стимулы по сравнению с контролем, где доля положительных на ЩФ клеток также выявлялась, но была ниже (Рис.1а, б). Следует отметить, что доля положительных на ЩФ клеток в культурах МСК без воздействия остеогенных стимулов возрастала с увеличением времени культивирования клеток на протяжении одного пассажа, то есть при увеличении количества клеток за счет деления, а значит, увеличения их плотности и числа контактов между ними. Таким образом, вероятно, в культурах МСК имела место спонтанная инициация дифференцировки в остеогенном направлении или, по крайней мере, ее начальных этапов. Интересно, что клетки, в которых выявлялась спонтанная или индуцированная активность ЩФ, в культурах МСК были морфологически гетерогенны. Однако, четкой корреляции между морфологическим типом клеток и степенью окрашивания на щелочную фосфатазу отмечено не было.

Рис.1 Дифференцировочные потенции МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлено гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы в клетках 3 пассажа, х100 (а, б), окрашивание минерализованных компонентов матрикса клеток 6 пассажа, х100 (в, г) и приобретение адипоцитарного фенотипа клетками 1 пассажа, х400 (д, е) в отсутствие (спонтанная дифференцировка) (а, в, д) и при воздействии (индуцированная дифференцировка) (б, г, е) дифференцировочных стимулов.

Для МСК на начальных этапах культивирования была показана способность к минерализации матрикса в ответ на остеогенные стимулы, что, в отличие от активности щелочной фосфатазы, не было отмечено в случае отсутствия остеогенных стимулов (Рис.1в, г). При этом минерализация матрикса МСК происходила не ранее чем через три недели культивирования клеток в среде с остеогенными стимулами.

В отличие от остеогенного направления дифференцировки, для МСК костного мозга крыс был не характерен спонтанный адипогенез. В ходе индуцированной адиподифференцировки клетки-предшественники приобретали характерную для адипоцитов форму, располагались в виде отдельных кластеров и накапливали в цитоплазме жировые включения, которые сначала имели небольшой размер, а затем сливались, формируя большие липидные капли (Рис.1д, е). Интересно, что способность к адипогенезу была наилучшей у клеток первого пассажа. Вероятно, адипогенный потенциал МСК снижается при культивировании. Напротив, при длительном культивировании две из трех исследуемых культур сохраняли способность к увеличению активности щелочной фосфатазы в среде с остеогенными стимулами, после 200 удвоений популяций. Этот факт согласуется с представлениями о том, что длительно поддерживаемые культуры МСК долго сохраняют способность к остеогенной дифференцировке, однако перестают дифференцироваться в адипоциты, что может говорить о потере мультипотентности при старении культур [Digirolamo C. M. et al., 1999; Muraglia A. et al., 2000]. С другой стороны, согласно ряду исследований, прогениторные клетки взрослого организма способны давать более чем 80 удвоений популяции в случае МСК человека и более чем 120 удвоений популяции в случае культур МСК грызунов, без признаков изменения фенотипа, изменения длины теломер, потери дифференцировочного потенциала и других признаков старения [Jiang Y. et al., 2002; Reyes M. et al., 2001], а число удвоений популяции стволовых клеток из мышечной ткани мышей может достигать 200 без появления каких-либо признаков старения клеток и потери функциональной состоятельности [Deasy B. M. et al., 2005].

Таким образом, полученные культуры МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования характеризовались экспрессией свойственных для клеток-предшественников поверхностных антигенов; возможностью реализации свойственных для МСК костного мозга дифференцировочных потенций; морфологической гетерогенностью, выражающейся в существовании в культуре различных типов клеток; высокой пролиферативной активностью и последующим ее спадом, происходившем, в среднем, к четвертому пассажу и сопровождающимся доминированием в культурах крупных распластанных медленно пролиферирующих клеток. При дальнейшем субкультивировании МСК костного мозга крыс, наряду с сохранением характерного для клеток-предшественников иммунофенотипа, их пролиферативная активность восстанавливалась, увеличивалась и стабилизировалась, что сопровождалось снижением степени гетерогенности культур МСК и формированием гомогенной клеточной популяции с определенными морфологическими характеристиками. Это, вероятно, объясняется субселекцией обладающей индивидуальными (в том числе, вероятно, в отношении сохранения дифференцировочного потенциала) морфофункциональными характеристиками популяции клеток, устойчивой к условиям культивирования, в том числе высокому, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде.

Влияние гипоксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. При оценке морфологических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо - и гипоксии было обнаружено, что в условиях 5% О₂ в культурах МСК снижалось количество варьирующих по размеру и разнородных по морфологическим особенностям крупных, распластанных, медленно делящихся клеток. В культивируемых в гипоксических условиях популяциях МСК увеличивалась доля формирующих островки однотипных клеток небольшого размера с однородной по оптической плотности цитоплазмой. Таким образом, гипоксия снижала степень гетерогенности культур МСК (Рис.2).

Рис.2 Морфологическая гетерогенность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии. Представлены двухпараметрические гистограммы распределения клеток по размеру (ось ординат) и гранулярности (ось абсцисс) для клеток 4 пассажа, а также микрофотографии (х200) для клеток 2 пассажа после инкубации в течение 96 часов в нормоксии (а) и гипоксии (б).

В ряде исследований крупные распластанные клетки рассматривались как зрелые МСК, которые теряют часть своего дифференцировочного потенциала [Prockop D. J. et al., 2001; Sekiya I. et al., 2002]. С другой стороны, снижение доли крупных распластанных медленно делящихся клеток в условиях пониженного содержания кислорода позволяет предположить, что именно концентрация кислорода является фактором, регулирующим количество таких клеток в популяции МСК. Допуская, что особенности морфологии и подавление пролиферативной активности in vitro клеток третьего типа отражают степень их повреждения в условиях повышенного, по сравнению со средой in vivo, содержания кислорода, можно предположить, что приближение газового состава среды культивирования к таковому in vivo обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества поврежденных таким образом клеток.

В случае длительно культивируемых МСК после гипоксического воздействия в течение четырех суток в К1 (линии, потерявшей способность к остеогенной дифференцировке) наблюдалось преобладание клеток, образующих длинные тонкие отростки. В случае К2 и К3 (линий, сохраняющих способность к остеогенной дифференцировке) модифицирующего влияния гипоксии на морфологические характеристики клеток отмечено не было.

При оценке пролиферативной активности МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо - и гипоксии в течение 96 часов было показано, что пониженное содержание кислорода стимулирует пролиферацию клеток (Рис.3). Усиление пролиферативной активности МСК в условиях пониженного содержания кислорода наблюдалось в каждом эксперименте как в случае первичных культур, так и в субкультурах в течение первых четырех исследованных пассажей. В среднем, пролиферация клеток в условиях гипоксии была в 2,5 раза активнее по сравнению с нормоксией.

Рис.3 Пролиферация МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и гипоксии (5% О₂). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для различных культур в зависимости от пассажа и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Манна-Уитни для Р1, P2 и Р3 и по t-критерию для Р2.

Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, демонстрирующих возможность стимуляции пролиферации недифференцированных клеток в условиях пониженного содержания кислорода [Lennon D. P. et al., 2001; Ren H. et al., 2006; Bosch P. et al., 2006; Grayson W. L. et al., 2006].

Изменение пролиферативного ответа клеток в условиях гипоксии, очевидно, может быть связано с регуляторным влиянием активирующихся при гипоксии определенных сигнальных путей, а также транскрипционного фактора HIF-1 на механизмы, контролирующие клеточный цикл. Активация транскрипционного фактора HIF-1б является универсальным ответом клеток на гипоксию и была описана в различных типах клеток [Kaelin W. G., 2002; Semenza G. L., 2001, 2004; Wenger R. H., 2000, 2001, 2002; Bruick R. K., 2003]. С другой стороны, в ряде экспериментов было показано, что высокое содержание HIF-1б может коррелировать со сверхэкспрессией белков-маркеров пролиферации фаз S-G2 клеточного цикла, таких как циклин А и Ki-67, и с активацией клеточной пролиферации [Bos R. et al., 2004; Gardner L. B. et al., 2003]. Другой механизм активации пролиферации МСК при гипоксии может быть связан с индукцией SAP-киназных каскадов (JNK и р38), активируемых обычно в ответ на стрессовые факторы и приводящих к стимуляции пролиферативной активности клеток. Так, в ряде экспериментов доказывается участие этих сигнальных путей в активации клеточной пролиферации [Scott P. H. et al., 1998; Das M. et al., 2001]. С другой стороны, индукция стресс-активируемых протеинкиназ была продемонстрирована на многих клетках при помещении их в гипоксические условия [Tobiume K. et al., 2000; Alfranca A. et al., 2002]. Следует отметить, что факторы, обуславливающие степень стимуляции пролиферативной активности клеток-предшественников, остаются невыясненными. Возможно, что степень стимуляции МСК гипоксией может в какой-то мере определяться коммитированностью клеток в составе популяции МСК. В этой связи интересно, что, например, подвергавшиеся гипоксическому воздействию гематопоэтические стволовые клетки демонстрировали неодинаковый пролиферативный ответ в зависимости от степени дифференцированности [Gardner L. B. et al., 2003].

Стимуляция пролиферативной активности в условиях пониженного содержания кислорода не наблюдалась в случае длительно культивируемых МСК костного мозга крыс (Рис.4). Гипоксия подавляла пролиферацию клеток в К1 (линии, потерявшей способность к остеогенной дифференцировке) и не оказывала существенного влияния на пролиферативную активность клеток линий К2 и К3 (линии, сохраняющие способность к остеогенной дифференцировке).

Рис.4 Пролиферация длительно культивируемых МСК костного мозга крыс в нормоксии и гипоксии (5% О₂). Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для культур К1, К2, К3 и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 8 экспериментов, различия достоверны для р<0,01 по критерию Манна-Уитни для К1.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 - 4 пассажах, культивируемых в нормо - и гипоксии в течение 96 часов показала, что для МСК в условиях пониженного содержания кислорода характерно снижение количества поврежденных клеток, главным образом, за счет подавления процессов апоптоза (Рис.5). В некоторых культурах суммарное число поврежденных клеток в условиях гипоксии было в 2,5 раза меньше по сравнению с нормоксией, а в среднем, этот показатель составил 1,5 раза.

Антиапоптотическое действие гипоксии на клетки согласуется с активацией в гипоксических условиях PI3-киназы [Alvarez-Tejado M. et al., 2002], что, в свою очередь, ведет к отмене ингибирования функций антиапоптотического белка Bcl-xL проапоптотическим белком Bad, а также к индукции транскрипционного фактора NF-кB, который обеспечивает усиление активности ряда антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-xL и IAP2), наряду с подавлением функции проапоптотического белка Bax, и индукция которого также может быть достигнута через другие сигнальные пути, активируемые при гипоксии [Greijer A. E. et al., 2004].

Рис.5 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и гипоксии (5% О₂). Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+) и некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 5-6 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

а.

б.

в.

Рис.6 Жизнеспособность длительно культивируемых МСК костного мозга крыс после 96 часов экспозиции в нормоксии и гипоксии (5% О₂). Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+), некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для культур К1 (а), К2 (б), К3 (в), а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 8 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

Пониженное содержание кислорода оказывало различные эффекты на длительно культивируемые МСК: только в одной из культур - наименее подверженной влиянию гипоксии и наиболее длительно поддерживающей остеогенный дифференцировочный потенциал - наблюдалось протективное действие гипоксии на клетки, в то время как доля поврежденных клеток возрастала при воздействии гипоксии в двух других культурах (Рис.6).

Таким образом, эффекты снижения парциального давления кислорода на длительно культивируемые МСК отличались от таковых для клеток на ранних пассажах и зависели от полученной линии клеток. Такая вариабельность согласуется с представлениями о том, что при длительном культивировании клеток происходит субселекция популяции, устойчивой и приспособленной к повышенному, по сравнению с условиями in vivo, содержанию кислорода в среде, которое, на определенных этапах культивирования может действовать как фактор отбора. Случайность такой субселекции определяет индивидуальные особенности клеточной популяции, в том числе, в отношении ее чувствительности к гипоксии.

При исследовании влияния гипоксии на иммунофенотип МСК костного мозга крыс, было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода, поддерживаемого в течение 96 часов, сохраняется экспрессия характерных для клеток-предшественников поверхностных маркеров (CD90⁺, CD45^-, CD54⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD106⁺, CD11b^-, CD29⁺). Эта тенденция была характерна как для клеток на начальных этапах культивирования, так и для длительно культивируемых МСК.

При оценке влияния гипоксии на остеогенный дифференцировочный потенциал МСК костного мозга крыс было показано, что в условиях пониженного содержания кислорода число недифференцированных клеток было больше по сравнению с нормоксией как в среде без остеогенных стимулов, так и в среде, содержащей остеогенные дифференцировочные стимулы (Рис.7). Таким образом, гипоксия, вероятно, подавляла, по крайней мере, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников.

При анализе адипогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс было отмечено, что дифференцирующиеся клетки обнаруживались только в случае инкубирования МСК в среде, содержащей адипогенные дифференцировочные стимулы как в нормоксии, так и в гипоксии. При этом количество формирующихся кластеров адипоцитов было одинаково в обоих случаях. Более того, количество формирующихся адипоцитов в пределах одного кластера также не зависело от содержания кислорода в среде (Рис.8). Таким образом, гипоксия не оказывала существенного влияния на адипогенную дифференцировку МСК костного мозга крыс.

Рис. 7 Остеогенная дифференцировка МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлена средняя доля негативных по ЩФ клеток после 96 часов экспозиции МСК в нормоксии и гипоксии (5% О₂) и стандартная ошибка среднего. СД, ИД - спонтанная и индуцированная дифференцировка. Данные репрезентативного эксперимента для клеток третьего пассажа.

Рис.8 Адипогенная дифференцировка МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования. Представлено среднее количество адипоцитов в кластере после 14 суток инкубирования с адипогенными стимулами в нормоксии и гипоксии (5% О₂) и стандартная ошибка среднего. Данные репрезентативного эксперимента для клеток первого пассажа.

Таким образом, 96-часовое воздействие гипоксии (5% О₂) оказывало стимулирующее влияние на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс на начальных этапах культивирования, что выражалось в снижении степени гетерогенности культур МСК, стимуляции их пролиферации, цитопротективном действии, сохранении характерного для МСК фенотипа, а также торможении, по крайней мере, начальных этапов процессов дифференцировки в остеогенном направлении, что может рассматриваться как сохранение их менее коммитированного состояния.

Стимулирующий эффект гипоксии на МСК на ранних пассажах может объясняться снижением интенсивности окислительного стресса, в котором оказываются клетки в течение первых пассажей после выделения. Снижение концентрации кислорода до 5% обуславливает, с одной стороны, помещение клеток в среду, приближенную к естественным условиям in vivo, что обеспечивает меньшее напряжение антиоксидантных механизмов, и, с другой стороны, активацию ряда сигнальных путей. Таким образом, снижение in vitro концентрации кислорода в среде до 5%, по-видимому, не является “истинным" гипоксическим воздействием для культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников, что говорит об актуальности исследования морфофункционального состояния культивируемых МСК при значительно более выраженном снижении парциального давления кислорода в среде.

Влияние аноксии на мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс. При оценке морфологических характеристик МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо - и аноксии в течение 96 часов было обнаружено, что аноксия существенно не влияет на морфологическую картину культур МСК. Количество крупных распластанных клеток было примерно одинаковым как в нормоксичских культурах, так и в культурах МСК в условиях аноксии.

Оценка пролиферации МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования при их экспозиции в нормо - и аноксии в течение 96 часов, вопреки ожиданиям, показала, что в условиях аноксии не происходит ингибирования пролиферативной активности мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (Рис.9).

Рис.9 Пролиферация МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования в нормоксии и аноксии. Представлено среднее значение прироста количества клеток (в разах) в рандомически выбранных фиксированных полях зрения в разных культуральных флаконах для различных культур и стандартная ошибка среднего, суммарные данные 7 экспериментов, различия недостоверны, р>0,01 по критерию Манна-Уитни для P2-P4 и по t-критерию для Р1.

Аноксия приводила либо к незначительной стимуляции пролиферативной активности МСК костного мозга крыс, либо не оказывала на нее никакого эффекта, в среднем, обуславливая в 1,2 раза большую пролиферативную активность по сравнению с нормоксическими условиями.

Оценка жизнеспособности МСК костного мозга крыс на 1 - 4 пассажах, культивируемых в нормо - и аноксии в течение 96 часов показала, что аноксия незначительно увеличивает суммарный процент поврежденных клеток в культурах, что происходит, главным образом, за счет активации процессов апоптоза (Рис.10).

В среднем, количество апоптотических клеток в культурах МСК костного мозга крыс статистически достоверно возрастало в два раза при их культивировании в условиях аноксии в течение 96 часов, в то время как доля некротических клеток в этих же условиях увеличивалась в 1,2 раза. Суммарный процент поврежденных как некротически, так и апоптотически клеток, в условиях аноксии был также в 1,2 раза выше по сравнению с нормоксией, что может говорить о значительной устойчивости клеток-предшественников костного мозга крыс к аноксическим условиям.

Рис.10 Жизнеспособность МСК костного мозга крыс на начальных этапах культивирования после 96 часов экспозиции в нормоксии и аноксии. Представлено среднее количество апоптотических (AnnV+) некротических (PI+) клеток, суммарный процент поврежденных клеток для различных культур на 1-4 пассажах, а также стандартная ошибка среднего, суммарные данные 11-12 экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток.

Несмотря на относительную устойчивость мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс к 96-часовой аноксии, более длительная экспозиция клеток в аноксических условиях приводила к существенному снижению их жизнеспособности (Рис.11). Так, суммарный процент поврежденных клеток возрастал с 22% после первой недели культивирования до более чем 50% через неделю, а к концу третьей недели практически все клетки в культуре гибли, в то время как в нормоксических и гипоксических условиях суммарный процент поврежденных клеток оставался относительно стабильным и составлял в среднем 10%. Основным механизмом гибели клеток при длительной аноксии являлся некроз, хотя доля апоптотических клеток также возрастала значительно, что могло свидетельствовать о существенном вкладе вторичного постапоптотического некроза.

Превалирование процессов некроза над процессами апоптоза в случае длительной экспозиции клеток в аноксии представляется естественным: запрограммированная клеточная гибель, в отличие от некроза, требует затрат энергии, поэтому вариант гибели обусловлен в том числе энергетическим состоянием клетки [Leist M. et al., 1997].

Таким образом, несмотря на отсутствие явно выраженного повреждающего характера аноксии при ее относительно недолговременном воздействии, увеличение времени пребывания клеток-предшественников в аноксических условиях приводило к потере их жизнеспособности. Напротив, цитопротекторное действие гипоксии, наблюдаемое при ее кратковременном воздействии, подтверждалось при увеличении времени экспозиции клеток в гипоксии.

Механизмы регуляции численности клеток в условиях гипоксии, а также на начальных стадиях аноксии, видимо, связаны с апоптозом, в то время как массовая гибель клеток в более жестких аноксических условиях, главным образом, связана с некрозом.

Рис. 11 Жизнеспособность МСК на начальных этапах культивирования в нормоксии, гипоксии и аноксии в течение 21 суток. Представлен средний процент поврежденных клеток в культурах и стандартное отклонение в нормоксии, гипоксии и аноксии после 1,2 и 3 недель культивирования.

Как и в случае гипоксии, мезенхимальные стромальные клетки-предшественники костного мозга крыс сохраняли свой иммунофенотип при экспозиции в аноксии в течение 96 часов (CD90⁺, CD45^-, CD54⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD106⁺, CD11b^-, CD29⁺).

При исследовании остеогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс было показано, что аноксия подавляла, по крайней мере, начальные этапы как спонтанной, так и направленной остеогенной дифференцировки клеток-предшественников. Тем не менее, следует отметить, что в культурах МСК при их экспозиции в аноксии определенная доля клеток, в которых выявлялась активность ЩФ, все же детектировалась, что, вероятно, говорит об отсутствии полной блокады внутриклеточных механизмов, ответственных за дифференцировку клеток-предшественников в остеобласты. Полагают, что одним из таких механизмов является экспрессия ключевого для процессов остеогенной дифференцировки транскрипционного фактора Runx2, ингибирование которого в случае аноксии, но не гипоксии было показано в одной из работ [Salim A. et al., 2004]. Учитывая, что более длительное культивирование МСК в условиях аноксии приводило к нарушению их жизнеспособности, дальнейшая дифференцировка этих клеток в остеогенном направлении становилась невозможной.

Анализ адипогенного дифференцировочного потенциала МСК костного мозга крыс показал, что на начальных этапах культивирования МСК в аноксии часть клеток вступала на путь дифференцировки в адипоциты: в цитоплазме дифференцирующихся клеток начинали накапливаться липидные капли, клетки приобретали более сферическую форму и формировали кластеры. Однако при дальнейшей экспозиции в условиях аноксии происходила гибель дифференцирующихся клеток. Видимо, в условиях аноксии основным лимитирующим дифференцировку фактором являлось нарушение клеточной жизнеспособности, а не блокирование процессов дифференцировки.

Таким образом, в условиях 96-часовой аноксии в культурах МСК костного мозга крыс не происходило изменения морфологии и иммунофенотипа клеток, ингибирования их пролиферации, значительного увеличения количества поврежденных клеток, а также сохранялась возможность начальных этапов их остеогенной и адипогенной дифференцировки. Жизнеспособность клеток-предшественников при аноксии определялась временем их пребывания в этих условиях, а основным повреждающим механизмом МСК на начальных этапах аноксии являлся апоптоз, а при более длительном воздействии - некроз.

Суммируя полученные данные, следует повторить, что 96-часовая экспозиция гетерогенной на начальных этапах культивирования популяции мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга крыс в условиях снижения концентрации кислорода in vitro до 5%, то есть до значений, не являющихся гипоксическими in vivo, приводило к стимулирующему эффекту, заключающемуся в модуляции ряда морфофункциональных характеристик клеток-предшественников. Этого эффекта не наблюдалось при выраженном понижении содержания кислорода в среде, которое, тем не менее, не приводило и к значительному повреждению клеток, наблюдаемому в случае более длительной экспозиции, что расширяет представления об устойчивости клеток-предшественников взрослого организма, в частности, к недостатку кислорода в среде.