Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Антибиотическое действие дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis против Phytophthora infestans и Fusarium oxysporum

06.01.07 -- Защита растений

Терпиловский Максим Александрович

Кинель-2012

Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Каменек Людмила Кирилловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Кинчарова Марина Николаевна

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха

Защита состоится 16 февраля 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.058.01 при ФГБОУ ВПО «Самарская государственная сельскохозяйственная академия».

Адрес: 446442, Самарская область, г. Кинель, пгт. Усть-Кинельский, ул. Учебная, 2, ФГБОУ ВПО Самарская ГСХА, диссертационный совет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО Самарской государственной сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, профессор Марковская Галина Кусаиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность работы. В последнее время уделяется все больше внимания развитию экологически безопасных методов борьбы с возбудителями заболеваний сельскохозяйственных культур (Сорокина и др., 1999; Штерншис и др., 2000).

Использование нехимических средств борьбы (биологических, хозяйственных, агротехнических) отвечает концепции интегрированной защиты растений. Важное место в ряду этих средств занимают биопрепараты. Они отличаются специфичностью действия и экологической безопасностью, не вызывают резистентности у фитопатогенных микроорганизмов и не нарушают внутриэкосистемные взаимосвязи.

Для разработки биопрепаратов, отвечающих всем основным критериям эффективности и безопасности, необходим отбор активных, конкурентных, технологически выгодных штаммов микроорганизмов, являющихся антагонистами возбудителей заболеваний культур. Создание на основе полученных агентов биологических препаратов, имеющих широкий спектр действия, является очень актуальным (Соколов, 1990; Боронин, 1998; Романовская и др., 2002).

В настоящее время широко используются перспективные препараты для биологического контроля вредителей на основе различных подвидов спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis. Преимуществами бактериальных биопрепаратов по сравнению с химическими являются: отсутствие загрязняющих остатков, высокая специфичность действия, обусловливающая их безопасность для нецелевых организмов и сравнительно низкая стоимость процедур, требуемых для регистрации их в качестве средств защиты растений (Добрица и соавт., 2001). Кроме того, B. thuringiensis является естественным компонентом микрофлоры почв и, следовательно, применение бациллы в защитных мероприятиях существенно не нарушает видовую структуру биоценозов.

B. thuringiensis присвоен статус вполне безопасного организма (GRAS, generally regarded as safe) Управлением по контролю над качеством продовольствия и лекарственных средств США (Харвуд, 1992). На основе этого микроорганизма создано большое количество инсектицидов, которые составляют 90% биопрепаратов, используемых в сфере защиты растений (Вершинина и Алимова, 2000; Захаренко, 2003).

Известно, что основным токсическим компонентом В. thuringiensis являются белковые дельта-эндотоксины с молекулярной массой от 30 до 130 кДа. Подвиды В. thuringiensis синтезируют дельта-эндотоксины, имеющие высокую гомологичность по аминокислотному составу и различающиеся по специфичности действия на насекомых и микроорганизмы. Другие токсины, а также споры бактерий, оказывают синергетическое действие на активность препаратов (Каменек, 1998). Созданы препараты, не содержащие спор в своем составе, а включающие лишь выделенные и очищенные дельта-эндотоксины (препараты серии Дельта). Их использование предотвращает нежелательное обсеменение агроценозов спорами бактерий. Препараты имеют высокую активность и специфичность в отношении насекомых-вредителей (Каменек, 1998). Действие имеет двухступенчатый характер и приводит к разобщению окислительного фосфорилирования и дыхания на сопрягающих мембранах митохондрий клеток (Каменек и Штерншис, 1985).

Помимо инсектицидного действия дельта-эндотоксины проявляют активность в отношении некоторых бактерий (Юдина и Бурцева, 1997; Каменек и соавт., 2005). Полагают, что механизмы антимикробного и энтомопатогенного действия имеют общие черты. Было установлено также, что дельта-эндотоксин обладает цитостатическим действием на ряд фитопатогенных грибов родов Fusarium, Bipolaris, Phytophthora, Alternaria, Risoctonia (Тюльпинева, 2003; Гришечкина и соавт., 2002), вызывающих многочисленные инфекционные заболевания растений. Единая клеточная структура эукариот позволяет сделать предположение об общей природе воздействия дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на клетки насекомых и клетки грибных фитопатогенов. Фитофтороз -- одна из самых опасных и наиболее распространенных болезней картофеля и томатов. Возбудители заболевания -- грибы-оомицеты вида Phytophthora infestans. Поражение фитофторозом сельскохозяйственных культур приводит к значительным потерям урожая и ухудшению экологической ситуации, за счет применения большого количества химических пестицидов.

Создание более эффективных препаратов на основе B. thuringiensis для борьбы с фитофторозом позволит снизить количество используемых химических препаратов. Однако особенности антифунгального действия дельта-эндотоксинов малоизучены.

Целью данного исследования явилось изучение особенностей антибиотического действия дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на возбудителей заболеваний сельскохозяйственных растений на примере Phytophthora infestans и Fusarium oxysporum. В задачи исследования входило:

ѕ Охарактеризовать внешние морфологические изменения клеток оомицетов P. infestans и грибов F. oxysporum под действием различных концентраций дельта-эндотоксина B. thuringiensis;

ѕ Определить действие дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на жизнеспособность спор оомицетов P. infestans и несовершенного грибов F. oxysporum;

ѕ Выявить влияние дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на инфицирующую способность культур P. infestans;

ѕ Изучить антибиотическое действие дельта-эндотоксина против возбудителя фитофтороза P. infestans в лабораторных условиях на рассаде томатов; Определить биологическую эффективность применения дельта-эндотоксина против фитофтороза.

Положения, выносимые на защиту:

ѕ Дельта-эндотоксины B. thuringiensis вызывают стойкие патологические изменения в мицелии оомицетов P. infestans и несовершенных грибов F. oxysporum;

ѕ Жизнеспособность и инфицирующая способность спор P. infestans и F. oxysporum под влиянием дельта-эндотоксинов B. thuringiensis значительно снижаются;

ѕ Дельта-эндотоксины B. thuringiensis оказывают выраженную антибиотическую активность и сдерживают развитие фитофтороза пасленовых культур.

Научная новизна работы. Установлено выраженное антифунгальное действие дельта-эндотоксина B. thuringiensis в отношении возбудителя фитофтороза Phytophthora infestans, а также возбудителя трахеомикозного увядания Fusarium oxysporum. Выявлены и оценены внешние патологические изменения в клетках культур грибов P. infestans и F. oxysporum под действием дельта-эндотоксинов, а также влияние последних на инфицирующую способность культур P. infestans, развитие и распространенность фитофтороза.

Практическая значимость. Проведенные эксперименты позволяют рекомендовать бактерии B. thuringiensis к применению в качестве биопрепарата для борьбы с фитопатогенными грибами P. infestans, возбудителями фитофтороза картофеля, а также -- F. oxysporum, возбудителя трахеомикозного увядания. Использование токсинов не ограничивается указанными патогенами, ввиду более широкого ряда специфичности в отношении целого ряда грибов.

Внедрение результатов исследования. Ряд положений и выводов работы используются в учебном процессе на кафедре общей и биологической химии экологического факультета Ульяновского государственного университета.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на XV, XVI и XVIII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008, 2009, 2011), II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), Международной научной конференции «Проблемы защиты растений в условиях современного сельскохозяйственного производства» (Санкт-Петербург, 2009), XIV Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология -- наука XXI века» (Пущино, 2010), II Всероссийской, 55 научно-практической конференции «Россия Молодая» (Кемерово, 2010), Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2011) и на Международном Конгрессе по патологии беспозвоночных и микробиологическому контролю (Канада, Галифакс, 2011).

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было подготовлено 16 публикаций, из которых 3 -- в изданиях, рецензируемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Работа изложена на 141 странице, содержит 23 рисунка, 12 таблиц. Список литературы включает 298 источника, из них 241 иностранный источник.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Подробно охарактеризована бактерия B. thuringiensis как перспективный антимикробный агент. Рассмотрены факторы токсичности бактерии, особенности дельта-эндотоксинов -- их специфичности, структуры, морфологии, синтеза, молекулярной организации, механизма действия на клетки эукариот. Дана характеристика возбудителей заболеваний -- оомицета Phytophthora infestans и несовершенного гриба Fusarium oxysporum.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Культивирование фитопатогенных грибов

В экспериментах использовали штамм фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum ВКМ F-845 (из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Всероссийская коллекция микроорганизмов) и оомицета Phytophthora infestans шт. 2 (из коллекции кафедры микробиологии Казанского федерального университета).

Культуры грибов высевали на питательные среды (использовали картофельно-глюкозный агар и модифицированную среду Комада) (Caten and Jinks, 1968; Билай, 1980).

Для приготовления картофельно-глюкозного агара 200 г очищенного и промытого водой картофеля нарезали ломтиками, заливали 1 л водопроводной воды, варили 30 мин. Отвар фильтровали через вату и доводили до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляли 2% агара, нагревали до его растворения и устанавливали нейтральную реакцию среды для Phytophthora infestans (pH 7,0) (Шлегель, 1987; Merker, 1998).

Состав среды Комада был следующим (%): 10-водный тетраборат натрия (Na₂B₄O₇·10H₂O) -- 0,1%; гидрофосфат калия (K₂HPO₄) -- 0,1; хлорид калия (KC1) -- 0,05; 7-водный сульфат магния (MgSO₄·7H₂O) -- 0,05; Fe-Na-ЭДТА -- 0,001; D-галактоза -- 2; L-аспарагин -- 0,2; агар-агар -- 1,5. Устанавливали кислую реакцию среды для культивирования Fusarium oxysporum (pH 5,6). Среды стерилизовали при 1 атм в течение 20 мин (Komada, 1976).

2.2 Чувствительность P. infestans и F. oxysporum к дельта-эндотоксину B. thuringiensis

Культивирование на питательной среде (in vitro, по методу Bobek и Situ, 2003). Растворы дельта-эндотоксина B. thuringiensis различных концентраций смешивали с равным объемом суспензий (брали аликвоту 0,3 мл) спорангиев P. infestans и F. oxysporum до конечных концентраций токсина 400 и 800 мкг/мл и суспензии -- 2Ч10³ спорангиев (конидий)/мл и инкубировали в течение разных промежутков времени (6, 12 и 18 ч). Конидии инкубировали в дистиллированной воде.

После инкубации растворы суспензий переносили на чашки Петри с питательной средой и культивировали в течение 5-7 суток. Затем подсчитывали колонии грибов. Условия культивирования соответствовали оптимальным для выбранных культур.

Метод листовых дисков (in vivo, по методу Reis и соавт., 2005). Растения картофеля сорта выращивали в теплицах (18-30°C) в пластиковых контейнерах различного объёма (0,5-10 л), заполненных 0,4-9 кг высушенного смешанного грунта (садовый грунт : удобрение : вермикулит, 3:1:1). Ежедневно производили полив растений водой в объёме 20% от всего контейнера. Затем из здоровых листьев без видимых поражений вырезали диски диаметром 1,5 см и погружали адаксиальной стороной листа в воду (Reis et al., 2005).

Диски обрабатывали свежим инокулятом в объеме 20 мл. Инокулят представлял собой суспензию спорангиев, смешанную с раствором дельта-эндотоксина, до конечной концентрации последнего 400 или 800 мкг/мл. После чего инкубировали в течение 7 суток в чашках Петри. В экспериментах использовали 7-суточную культуру P. infestans шт. 2. Для приготовления суспензии делали смывы дистиллированной водой в стерильных условиях. Концентрацию суспензии измеряли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Её конечная концентрация составляла 2Ч10³ спорангиев/мл. В чашках Петри инкубировали по 4 листовых диска в условиях 14-часового светового дня при температуре 18-20°C. Спустя 6-7 дней оценивали процент пораженной фитофторозом поверхности диска по 6-балльной шкале: 0 баллов -- признаки поражения отсутствуют, 1 балл -- некроз листовой поверхности, 2 балла -- 5% поражено, 3 балла -- 6-20%, 4 балла -- 21-50%, 5 баллов -- поражено более 50% поверхности диска (39) (Sozzi et al., 1992; Reis et al., 2005).

Повторность экспериментов была трехкратной. Все полученные результаты усредняли для последующего анализа.

Выращивание рассады томатов. Для изучения антифунгального действия дельта-эндотоксина был проведен эксперимент по выращиванию рассады томатов. В связи с тем, что семена сорта Ракета имели очень хорошие показатели всхожести и скорости прироста под влиянием дельта-эндотоксина, этот сорт был выбран для данного исследования. Известно, что томаты сорта Ракета слабо поражаются корневыми гнилями и фитофторозом (Хватыш, 2003).

Семена до посадки предварительно обрабатывали дельта-эндотоксином (Елькина и соавт., 2002). Подготовленный для эксплуатации, увлажненный торфяной грунт Микропарник (Россия) укладывали в пластиковые контейнеры и производили посев семян. Семена высевали по схеме 3х5, на глубину 1-1,5 см. После посева почву накрывали пленкой, чтобы она не высыхала. Укрытие снимали сразу после появления всходов.

Рассаду томатов обрабатывали смесью дельта-эндотоксина в концентрациях 0,001% и 0,005% с периодичностью 1 и 2 в неделю, распылением 30 мл его на наземную часть растений и почву. В контроле растения опрыскивали 30 мл воды 1-2 раза в день.

Инфицирование растений осуществляли путем распыления на наземную часть грибной суспензии P. infestans в концентрации 10⁵ КОЕ/мл. Условия выращивания способствовали развитию фитофтороза: высокая влажность (70-80%) и умеренная температура (18-21°С).

Схему опыта можно представить следующим образом:

1. Ракета без обработок (контроль);

2. То же + заражение;

3. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,001%, обработка 1 раз в неделю;

4. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,005%, обработка 1 раз в неделю;

5. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,001%, обработка 1 раз в неделю + искусственное заражение;

6. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,005%, обработка 1 раз в неделю + искусственное заражение;

7. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,001%, обработка 2 раза в неделю + искусственное заражение;

8. » + дельта-эндотоксин в концентрации 0,005%, обработка 2 раза в неделю + искусственное заражение.

Степень пораженности растений фитофторозом определяли по шкале британского фитопатологического общества (James, 1971):

Развитие болезни (%) вычисляли по формуле (1):

,(1)

где ?(a Ч b) - сумма произведений числа пораженных растений на соответствующий им балл развития болезни;

H - общее число учетных растений, шт.; К - высший балл шкалы учета.

Распространенность болезни (%) определяли по формуле (2):

,(2)

где n - количество больных растений в варианте, шт.

Биологическую эффективность (%) препаратов вычисляли (3):

,(3)

где Р_К - показатель развития болезни в контроле, Р_О - показатель развития болезни в опыте (Твердюков, 1993). Повторность опытов была 3-кратной. У рассады измеряли длину и толщину стебля, а также количество листьев. Интервал учетов составлял 2 дня.

2.3 Методы световой микроскопии

Мицелий и спорангии грибов P. infestans и F. oxysporum инкубировали с препаратами дельта-эндотоксина B. thuringiensis при 17С (P. infestans) и 28С (F. oxysporum) различных концентраций -- 200 и 400 мкг/мл. Через разные промежутки времени (30, 60 мин и 6, 12, 18 ч) клетки осторожно промывали дистиллированной водой и тотчас фиксировали. Обработанный материал подвергали исследованиям методами световой микроскопии. Просматривали под световым микроскопом марки Carl Zeiss Axiastar Plus (Германия; увеличение Ч1000) (Теппер и соавт., 1979; Билай, 1980).

2.4 Методы статистической обработки результатов

Все полученные результаты обрабатывались и анализировались с помощью методов математической статистики. Оценивали достоверность всех полученных различий в экспериментах по сравнению с контролем. Использовали критерии достоверности Стьюдента или Фишера. Статистическую обработку проводили в программном пакете STATISTICA 6.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Активность дельта-эндотоксинов B. thuringiensisв отношении клеток грибов P. Infestans и F. oxysporum

Известно, что подвиды бактерии B. thuringiensis синтезируют ферменты -- хитиназы и целлюлазы, -- с которыми связывают некоторые аспекты антифунгальной активности B. thuringiensis. Однако действие самих дельта-эндотоксинов малоизучено.

Микроскопирование позволило выявить особенности действия дельта-эндотоксинов B. thuringiensis в отношении культур клеток грибов P. infestans и F. oxysporum.

Представленные ниже микрофотографии (рис. 1) показывают характер патологических изменений мицелия грибов P. infestans и F. oxysporum под действием дельта-эндотоксинов B. thuringiensis (в концентрации 200 и 400 мкг/мл) спустя различное время инкубирования. Заметно набухание клеток и значительное выделение секретируемых пузырьков, выраженная вакуолизация клеток, изменение структуры цитоплазмы и гибель клеток.



Рис. 1. Патологические изменения мицелия фитопатогенного гриба P. infestans, вызванные дельта-эндотоксином B. thuringiensis (концентрация 200 мкг/мл, увеличение 1000)

1 -- контрольный мицелий гриба P. infestans спустя 30 мин инкубирования; 2 -- вакуолизация участков мицелия гриба P. infestans, наблюдаемая спустя 30 мин инкубирования в среде, содержащей дельта-эндотоксины B. thuringiensis; 3 -- контрольный мицелий гриба P. infestans через 60 мин инкубирования; 4 -- гипертрофия и вакуолизация клеток гриба P. infestans, отмеченные через 60 мин инкубирования в среде, содержащей дельта-эндотоксины B. thuringiensis; 5 -- контрольный мицелий гриба P. infestans спустя 6 часов инкубирования; 6 -- образование пор и выход клеточного содержимого гриба P. infestans в среду спустя 6 часов инкубирования в присутствии дельта-эндотоксинов B. thuringiensis.

Как видно из фотографий, концентрация дельта-эндотоксина 400 мкг/мл вызывала более выраженные изменения в клетках исследуемых грибов. Так, при данной концентрации дельта-эндотоксина вакуолизация инкубированных клеток Phytophthora infestans происходила раньше и была более заметной, чем при концентрации 200 мкг/мл; а выход клеточного содержимого Fusarium oxysporum в среду наблюдался уже через 60 минут после начала инкубирования.

В контроле, где клетки инкубировались в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было (рис. 1).

Различия во времени появления патологических изменений мицелия, а также их выраженности у грибов Phytophthora и Fusarium, вероятно, обусловлены особенностями метаболизма и строением клеточной стенки: клеточная стенка грибов P. infestans помимо б- и в-глюканов содержит в целлюлозу, а стенка грибов Fusarium -- хитин.

3.2 Воздействие дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на жизнеспособность спор фитопатогенных грибов P. infestans и F. oxysporum

Инкубирование спор фитопатогенных грибов P. infestans и F. oxysporum в растворах дельта-эндотоксинов различных концентраций с последующим пересевом на питательную среду выявило выраженное антифунгальное действие кристаллических белков B. thuringiensis.

Так, инкубирование спор P. infestans с дельта-эндотоксинами B. thuringiensis в концентрациях 400 и 800 мкг/мл в течение 6 часов способствовало снижению числа КОЕ на 38 и 80%, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 2).

Рис. 2. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis на число КОЕ грибов P. infestans (время инкубирования -- 6 и 12 ч)

Наиболее эффективной в подавлении числа выросших колоний фитопатогенных грибов P. infestans была концентрация дельта-эндотоксина 800 мкг/мл -- в 2,1 раза снижала число КОЕ по сравнению с концентрацией 400 мкг/мл и в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 2).

Длительное инкубирование спор фитопатогенных грибов P. infestans (12 ч) в присутствие дельта-эндотоксинов оказывало более выраженное влияние на их жизнеспособность. Так, дельта-эндотоксины B. thuringiensis в концентрациях 400 и 800 мкг/мл снижали число колоний на 73 и 81%, соответственно, по сравнению с контролем (рис. 2). Активность в отношении фитопатогенных грибов F. oxysporum была выше той, которую проявляли дельта-эндотоксины B. thuringiensis против P. infestans. Уже через 6 ч инкубирования отмечали значительное снижение числа колоний по сравнению с контролем (рис. 3-4).

Рис. 3. Влияние дельта-эндотоксина на рост колоний F. oxysporum на питательной среде (инкубирование в течение 6 ч): 1 -- рост колоний F. oxysporum в контроле; 2 -- влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis на число колоний F. oxysporum (концентрация 400 мкг/мл); 3 -- влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis на число колоний F. oxysporum (концентрация 800 мкг/мл).

Дельта-эндотоксин в концентрациях 400 и 800 мкг/мл снижал число выросших колоний в 3,7 и 14 раз, соответственно, по сравнению с контролем. При этом отмечали практически полное ингибирование роста грибов F. oxysporum на питательных средах дельта-эндотоксином в концентрации 800 мкг/мл (рис. 4).

Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis на число КОЕ грибов P. infestans (время инкубирования -- 12 ч)

3.3 Влияние дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на инфицирующую способность культур P. infestans

Фитофтороз поражает такие важнейшие паслёновые культуры, как картофель и томаты. Способность возбудителя к приобретению резистентности усложняет задачу борьбы с ним. Химические средства быстро теряют свою эффективность, поэтому роль биометода здесь очень велика. Дельта-эндотоксины B. thuringiensis проявляют активность в отношении ряда фитопатогенных грибов, из которых наиболее опасным и вредоносным является вид P. infestans.

В экспериментах кристаллические белки B. thuringiensis достоверно снижали распространенность и развитие заболевания фитофторозом у листьев картофеля (рис. 5-6).

Инкубирование инокулята с дельта-эндотоксинами B. thuringiensis позволило снизить процент поражения листовой поверхности, а также избежать появления выраженных симптомов заболевания (рис. 5).

Длительное инкубирование инокулирующей суспензии с дельта-эндотоксинами выявило повышение активности последних и, как следствие, снижение развития и распространенности заболевания, выраженности его симптомов (рис. 5).

После 12-часовой инкубации наблюдалось значительное снижение развития и распространенности заболевания: концентрация дельта-эндотоксина 400 мкг/мл снижала развитие заболевания до 6%, т.е. в 3,4 раза по сравнению с контролем; а концентрация 800 мкг/мл -- в 6,4 раза (рис. 6).

Кроме того, снижалась и распространенность фитофтороза под действием белковых дельта-эндотоксинов. Так, после 12 часов инкубации инокулирующей суспензии в присутствии дельта-эндотоксинов и инфицирования листьев наблюдалось снижение распространенности фитофтороза на листьях картофеля в 2,0 раза под влиянием концентрации белка 400 мкг/мл и в 3,7 раза -- под действием концентрации 800 мкг/мл.



Рис. 5. Влияние дельта-эндотоксинов B. thuringiensis на развитие и распространенность заболевания фитофторозом у листьев картофеля (длительность инкубирования инокулята -- 6 ч) 1 -- контрольные листья картофеля; 2 -- инфицированные необработанные листья картофеля;3 -- инфицированные обработанные листья картофеля (инокулят инкубировался в течение 6 ч с препаратом дельта-эндотоксинов концентрации 400 мкг/мл); 4 -- инфицированные обработанные листья картофеля (инокулят инкубировался в течение 6 ч с препаратом дельта-эндотоксинов концентрации 800 мкг/мл).

Увеличение времени инкубирования позволило сделать вывод о том, что наиболее высокая эффективность подавления заболевания дельта-эндотоксинами B. thuringiensis наблюдалась спустя 18 часов выдерживания инокулята с препаратом белка.

Развитие заболевания снижалось до 3 и 2% под влиянием концентраций дельта-эндотоксинов 400 и 800 мкг/мл, соответственно.

В экспериментах наиболее активной в отношении фитопатогенных грибов концентрацией дельта-эндотоксина была 800 мкг/мл. При этом важно отметить, что концентрация дельта-эндотоксина B. thuringiensis оказывала значительный сдерживающий эффект уже через 6 часов. С увеличением времени инкубирования происходил дальнейший слабовыраженный рост активности белка (рис. 6).

Рис. 6. Влияние дельта-эндотоксина B. thuringiensis на развитие заболевания фитофторозом у листьев картофеля в опытах in vivo

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что дельта-эндотоксин является очень эффективным противогрибковым агентом. Создание антифунгальных препаратов на основе дельта-эндотоксина B. thuringiensis для борьбы с фитопатогенными грибами представляется очень перспективным.

3.4 Применение дельта-эндотоксина B. thuringiensis для защиты растений томатов от фитофтороза

Установлено, что дельта-эндотоксин обладает цитостатическим действием на ряд фитопатогенных грибов родов Fusarium, Bipolaris, Phytophthora, Alternaria, Risoctonia, вызывающих многочисленные инфекционные заболевания растений (Тюльпинева, 2003). В этой связи, представляется необходимым исследование влияния этого агента на фитопатогенные грибы вида P. infestans.

Исследование влияния дельта-эндотоксина на фитофтороз осуществлялось на рассаде томатов сорта Ракета.

В таблицах представлены результаты влияния обработок дельта-эндотоксином на развитие здоровых и инфицированных растений томатов L. esculentum. Рассматривали следующие показатели: длина и толщина стебля, количество листьев. Помимо этого, оценивали распространенность и развитие заболевания, а также эффективность дельта-эндотоксина.

Обработки растений дельта-эндотоксином были начаты на 9 сутки выращивания рассады (9 сутки со дня посева семян) и проводились с периодичностью один и два раза в неделю.

Предварительное искусственное заражение растений суспензией гриба P. infestans производили на 12 сутки выращивания рассады (3 сутки после начала обработок дельта-эндотоксином). Симптомы поражения стали заметны на 21 сутки выращивания (9 сутки после начала обработок). На верхней стороне листьев образовывались бурые пятна, располагавшиеся преимущественно на краю листовой пластинки, а на нижней -- беловатый налет. На стеблях появлялись темно-бурые полосы и образовывались перетяжки. Ткани корней чернели. При ежедневном поливе и умеренном увлажнении грунта на его верхнем слое появлялся едва заметный беловатый налет.

Учеты длины стебля начали проводить на 9 сутки выращивания рассады.

фитопатогенный гриб эндотоксин клетка

3.4.1 Влияние дельта-эндотоксина на рост стебля томатов

Результаты обработки растений томатов дельта-эндотоксином по сравнению с контролем стали заметны уже на 6 сутки после начала обработок (15 сутки со дня посева семян). Показатели роста искусственно инфицированных и обработанных токсином растений на данном этапе не отличались от таковых для контроля.

По данным на 18 сутки выращивания рассады (9 сутки после начала обработок эндотоксином) средняя длина стебля здоровых растений, обработанных дельта-эндотоксином обеих концентраций, превышала длину стебля контрольных растений на 18,8% (при использовании концентрации 0,001%) и 22,3% (при использовании концентрации 0,005%).

На 18 сутки выращивания рассады (6 сутки со дня заражения) отмечено отставание в развитии зараженных, но не обработанных эндотоксином растений томатов, что является особенностью фитопатогенного действия P. infestans.

По данным, полученным на 12 сутки после начала обработок растений эндотоксином (21 сутки выращивания рассады), показатели длины стебля у растений, обработанных раствором дельта-эндотоксина, были существенно выше контрольных на 42,2% (при использовании концентрации 0,001%) и 43,1% (при использовании концентрации 0,005%). Разные концентрации токсина примерно равноценны по эффективности (табл. 1).

Выявлено достоверное отставание в росте длины стебля у зараженных необработанных растений по сравнению с контрольными на 16,6% на 12 сутки после начала обработок дельта-эндотоксином (21 сутки выращивания рассады (табл. 2).

Установлено, что на 12 сутки после начала обработок растений дельта-эндотоксином (21 сутки выращивания) применение последнего в концентрации 0,001%, при обработках один и два раза в неделю, стимулировало рост стебля у инфицированных растений на 20,1% и 16,8%, соответственно.

Обработка здоровых растений томатов дельта-эндотоксином способствовала ускоренному росту стебля. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что средняя длина стебля у опытных растений превышала контрольную на 25,7% и 29,2%, при использовании концентраций 0,001% и 0,005%, соответственно.

Развитие фитофтороза у искусственно инфицированных растений сказывалось на показателях роста стебля. Так, на 15 сутки после начала обработок (24 сутки выращивания) наблюдалось значительное замедление роста инфицированных растений, обрабатываемых дельта-эндотоксином в концентрации 0,005% - до 27%.

Однако различия между контрольным вариантом и вариантом с обработкой пораженных растений дельта-эндотоксином в концентрации 0,001% (1 и 2 раза в неделю) несущественны.

Таблица 1. Влияние дельта-эндотоксина на длину стебля у инфицированных растений (12 сут после начала обработок)

Вариант	Средняя длина стебля	Отклонение от контроля
		мм	%
Контроль	30,4±4,3	---	---
Заражение	25,4±10,9	-5,0	-16,6
Дельта-эндотоксин (0,001%; 1 раз в нед.) + Заражение	36,5±8,6	6,1	20,1
Дельта-эндотоксин (0,005%; 1 раз в нед.) + Заражение	27,8±6,6	-2,6	-8,6
Дельта-эндотоксин (0,001%; 2 раза в нед.) + Заражение	35,5±7,0	5,1	16,8
Дельта-эндотоксин (0,005%; 2 раза в нед.) + Заражение	26,1±5,6	-4,3	-14,1
НСР01	---	4,1	12,7

Наблюдения за динамикой роста стебля показали, что обработка здоровых растений дельта-эндотоксином способствовала ускоренному росту длины стебля, по сравнению с контролем.

По данным на 15 и 18 сутки после начала обработок (24 и 27 сутки эксперимента), отмечено существенное замедление роста инфицированных необработанных и обработанных растений по сравнению с контролем. При этом инфицированные, обработанные дельта-эндотоксином растения имели существенно более высокие показатели длины стебля, чем инфицированные, но не обработанные.

Согласно данным на 21 сутки после начала обработок растений дельта-эндотоксином (30 сутки выращивания рассады), здоровые растения, обработанные дельта-эндотоксином в концентрациях 0,001% и 0,005%, достоверно опережали по величине средней длины стебля контрольные растения на 43,5% и 35,9%, соответственно. Таким образом, дельта-эндотоксин оказывал стимулирующее влияние на рост стеблей томатов. Такой эффект, вероятно, проявлялся благодаря изначальной стимуляции роста проростков, а также иммунифицирующему эффекту дельта-эндотоксина на растения. Отмечены существенные различия между контрольными и инфицированными растениями, которые обрабатывали раствором дельта-эндотоксина разных концентраций и с разной периодичностью. При этом наибольшую эффективность показали обработки с частотой 1 раз в неделю (табл. 2).

Таблица 2. Влияние дельта-эндотоксина на длину стебля у инфицированных растений (21 сут после начала обработок растений дельта-эндотоксином)

Вариант	Средняя длина стебля	Отклонение от контроля
		мм	%
Контроль	66,8±13,3	---	---
Заражение	37,4±16,1	-29,4	-44,0
Дельта-эндотоксин (0,001%; 1 раз в нед.) + Заражение	52,9±12,0	-14,0	-20,9
Дельта-эндотоксин (0,005%; 1 раз в нед.) + Заражение	55,7±11,4	-11,1	-16,6
Дельта-эндотоксин (0,001%; 2 раза в нед.) + Заражение	51,0±11,0	-15,8	-23,7
Дельта-эндотоксин (0,005%; 2 раза в нед.) + Заражение	40,8±11,0	-26,1	-39,0
НСР01	---	6,9	13,7

В связи с тем, что на 21 сутки после начала обработок растений дельта-эндотоксином (30 сутки выращивания рассады) наблюдали значительное отставание в росте длины стебля растений, обрабатываемых раствором в концентрации 0,005% с частотой 2 раза в неделю, было решено сравнить варианты с искусственным заражением растений и обработками их дельта-эндотоксином и установить, существенны ли они.

Выявлены статистически достоверные различия в длине стебля растений, обрабатываемых раствором дельта-эндотоксина в концентрации 0,001% (с частотой 1 раз в неделю) и 0,005% (2 раза в неделю). Последние имели показатели средней длины стебля ниже на 22,9%.

Показано, что обработка растений растворами дельта-эндотоксина разных концентраций позволила снизить степень поражения наземных органов. Так, инфицированные обработанные растения имели значительно меньше признаков поражения по сравнению с инфицированными, но не обработанными растениями. У обработанных растений бурые пятна присутствовали лишь на семядольных листьях. Отсутствовали бурые полосы и перетяжки на стеблях, а также беловатый налет на грунте. Листовая масса оставалась непораженной.

3.4.2 Влияние дельта-эндотоксина на формирование листьев у растений

Для выявления действия дельта-эндотоксина на формирование листьев у здоровых и инфицированных растений, учитывалось количество листьев на 12 и 18 сутки после начала обработок растений дельта-эндотоксином (21 и 27 сутки выращивания рассады). Полученные результаты представлены в таблице 3.

Обработка растений растворами дельта-эндотоксина способствовала увеличению количества листьев. Так, различия между контрольными растениями и здоровыми растениями, обработанными дельта-эндотоксином в концентрациях 0,001% и 0,005%, на 18 сутки после начала обработок растений дельта-эндотоксином (27 сутки выращивания рассады) составили 44,5% и 48,3%, при достоверном отставании последних на 21,5% и 18,3% на 12 сутки (21 сутки выращивания). Установлено, что показатели среднего количества листьев у инфицированных растений, обработанных растворами дельта-эндотоксина в обеих концентрациях (с периодичностью один и два раза в неделю) превышали показатели необработанных. Различия между ними существенны на 1%-ном уровне значимости. При этом отмечен прямо противоположный эффект от применения дельта-эндотоксина в концентрации 0,005% один и два раза в неделю. Обработки с частотой один раз в неделю повышали данный показатель у растений томатов, а с частотой два раза в неделю -- снижали (табл. 3).

Таблица 3. Влияние дельта-эндотоксина на количество листьев у инфицированных растений (18 сут после начала обработок)

Вариант	Среднее количество листьев	Отклонение от заражения
		мм	%
Заражение	3,1±0,9	---	---
Дельта-эндотоксин (0,001%; 1 раз в нед.) + Заражение	4,2±0,5	1,0	33,0
Дельта-эндотоксин (0,005%; 1 раз в нед.) + Заражение	5,1±0,5	2,0	62,9
Дельта-эндотоксин (0,001%; 2 раза в нед.) + Заражение	4,4±0,5	1,3	40,4
Дельта-эндотоксин (0,005%; 2 раза в нед.) + Заражение	3,8±1,0	0,6	20,5
НСР01	---	0,4	9,7

3.4.3 Эффективность дельта-эндотоксина против фитофтороза

Для оценки эффективности антифунгального влияния дельта-эндотоксина был проведен учет количества растений с признаками заболевания и выявлен балл их поражения фитофторозом. Результаты приведены в таблице 4.

Выявлено значительное антифунгальное действие дельта-эндотоксина против возбудителя фитофтороза картофеля и томатов Phytophthora infestans. Это выражалось в меньшей распространенности и развитии заболевания у инфицированных и обработанных дельта-эндотоксином растений.

Инфицированные, необработанные растения имели большее по сравнению с обработанными эндотоксином растениями количество бурых пятен на листьях. Наблюдали также отмирание отдельных листьев, образование перетяжек в нижней части стебля, бурые полосы на стеблях, деформацию формы листьев и стеблей, а также общее увядание растений и отставание их в росте.

Признаки поражения у инфицированных обработанных растений были видны преимущественно на семядольных листьях. Общая листовая масса не была поражена.

Таблица 4. Распространенность и развитие заболевания у растений томатов на 21 сут после начала обработок рассады дельта-эндотоксином

Вариант	Распространенность заболевания, %	Развитие болезни, %	Эффективность препарата, %
1. Контроль	0	0	---
2. Дельта-эндотоксин (0,001%; 1 раз в нед.)	0	0	---
3. Дельта-эндотоксин (0,005%; 1 раз в нед.)	0	0	---
4. Заражение	73,3	22,0	---
5. Дельта-эндотоксин (0,001%; 1 раз в нед.) + Заражение	52,7	12,1	45,0
6. Дельта-эндотоксин (0,005%; 1 раз в нед.) + Заражение	9,7	1,2	94,5
7. Дельта-эндотоксин (0,001%; 2 раза в нед.) + Заражение	50,3	11,0	50,0
8. Дельта-эндотоксин (0,005%; 2 раза в нед.) + Заражение	54,0	15,5	29,5

Примечание - В таблице приведены данные для 30-дневной рассады.

Токсин способствует снижению скорости развития фитофтороза, поэтому можно говорить об его использовании в профилактических целях и на начальных этапах развития заболевания.

Особое значение будет иметь разработка биопрепаратов на основе дельта-эндотоксина для борьбы с фитофторозом, ввиду их экологической безопасности.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены и оценены внешние патологические изменения в клетках P. infestans и F. oxysporum под действием растворов дельта-эндотоксинов B. thuringiensis: значительная вакуолизация клеток и выделение секретируемых пузырьков, изменение структуры цитоплазмы и гибель клеток;

2. Установлено, что под влиянием дельта-эндотоксинов B. thuringiensis происходило снижение жизнеспособности спор P. infestans и F. oxysporum и, как следствие, снижение числа колоний фитопатогенных культур в 2-14 раз;

3. Выявлено, что под влиянием дельта-эндотоксинов B. thuringiensis достоверно снижались распространенность и развитие заболевания фитофторозом у листьев картофеля на 6,3-17,9% и 33,3-83,3%, соответственно;

4. Показано, что обработка дельта-эндотоксином B. thuringiensis растений, инфицированных культурой P. infestans, снижает показатель развития болезни до 1,2-15,5% и распространенность заболевания на 28,1-86,8%.

5. Установлено ростостимулирующее влияние дельта-эндотоксина на пораженные растения, выражавшееся в увеличении морфометрических показателей: средней длины стебля на 35,9-43,5% и среднего количества листьев на 33,0-62,9% по сравнению с контролем.

6. Определена биологическая эффективность применения дельта-эндотоксина против фитофтороза: она составила 24,5-94,5%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Каменек Л.К. Антифунгальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении фитофтороза картофеля в полевых условиях и при хранении / Л.К. Каменек, Т.А. Сатарова, Д.В. Каменек, М.А. Терпиловский // Сельхозбиология. -- 2011. -- № 1. -- C. 112-118.

2. Климентова, Е.Г. Перспективы использовния дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как биорегулятора роста растений с фитозащитными свойствами / Е.Г. Климентова, Л.К. Каменек, Д.В. Каменек, А.А. Купцова, М.А. Терпиловский, О.Л. Янишевская // АгроXXI. -- 2010. -- № 4-6. -- С. 31-33.

3. Каменек, Л.К. Антифунгальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении фитопатогенных грибов родов Phytophthora и Fusarium / Л.К. Каменек, Д.В. Каменек, А.А. Тюльпинева, М.А. Терпиловский // Биотехнология. -- 2008. -- №5. -- С. 76-83.

Публикации в материалах международных и всероссийских конференций

4. Терпиловский, М.А. Антибиотическое действие дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis в отношении P. infestans, возбудителя фитофтороза сельскохозяйственных растений // Сборник трудов международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии», Казань. -- 10-12 Ноября 2011 г. / Отв. редактор Изотова Е.Д. -- ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, 2011. -- С. 155-159.

5. Kamenek, L.K. Spore-free antibacterial Bacillus thuringiensis delta-endotoxins formulations in integrated pest management / L.A. Ivanova, L.K. Kamenek, O.U. Shrol, M.A. Terpilovsky // 2011 International Congress on Invertebrate Pathology and Microbial Control & 44th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Saint Mary's University Halifax, Nova Scotia Canada. -- 7-11 August 2011. -- P. 77

6. Каменек, Л.К. Перспективы использования дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis как экологически безопасного агента защиты растений / Л.К. Каменек, В.В. Гулий, Д.В. Каменек, В.М. Каменек, Е.Г. Климентова, М.А. Терпиловский // Сборник научных трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов», Саратовский государственный технический университет. -- 12-14 апреля 2011. -- Саратов. -- С. 227-229. -- ISBN 978-5-7433-2369-2.

7. Терпиловский, М.А. Морфологические изменения мицелия грибов Phytophthora и Fusarium под действием дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis / М.А. Терпиловский // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2011», МГУ имени М.В. Ломоносова / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, М.В. Чистякова. -- 11-15 апреля 2011 года. -- М.: МАКС Пресс, 2011.

8. Терпиловский, М.А. Стимулирование роста и развития растений томатов дельта-эндотоксинами Bacillus thuringiensis / М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек // Материалы международной научной конференции «Фитосанитарная безопасность агроэкосистем», Новосибирский аграрный научно-образовательный комплекс, Новосибирский государственный аграрный университет, Сибирский научно-исследовательский институт земледелия и химизации сельского хозяйства, под общей редакцией Н.Г. Власенко. -- 7-9 июля 2010. -- Новосибирск, 2010. -- С. 257-259.

9. Каменек, Л.К. Возможности использования бактериальных препаратов на основе дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis для защиты растений / Л.К. Каменек, В.М. Каменек, М.А. Терпиловский // Материалы Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия», Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва. -- 26-28 мая 2010. -- Саранск: Типография ООО «Мордовия - Экспо». -- С. 59-60.

10. Терпиловский, М.А. Стимулирование роста и развития растений томатов дельта-эндотоксинами Bacillus thuringiensis / М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек // Материалы XIV Международной Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология -- наука XXI века», Российская академия наук Пущинский научный центр РАН, г. Пущино. -- 19-23 апреля 2010. -- Пущино, 2010. -- С. 268.

11. Терпиловский, М.А. Антифунгальное и фитозащитное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis / М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек // Сборник докладов II Всероссийской, 55 научно-практической конференции «Россия Молодая», Кузбасский государственный технический университет. -- 12-16 апреля 2010. -- Кемерово. -- С. 462-464. -- ISBN 978-5-89070-742-0.

12. Терехина, Л.Д. Ростостимулирующее влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на растения огурца и томата / Л.Д. Терехина, Д.А. Терехин, А.А. Симонова, М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек, В.М. Каменек // Материалы Международной научной конференции «Проблемы защиты растений в условиях современного сельскохозяйственного производства», посвященной 80-летнему юбилею ВИЗР; Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений РАСХН. -- 8-9 декабря 2009. -- СПб, 2009. -- С. 141-143.

13. Терпиловский, М.А. Stimulation of tomatoes growth and development by Bacillus thuringiensis delta-endotoxins / М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек // Материалы IV Международной студенческой научно-практической конференции «Традиции, тенденции и перспективы в научных исследованиях», Камская государственная инженерно-экономическая академия, филиал в г. Чистополь. -- 25-27 ноября 2009. -- Чистополь: ИНЭКА, 2009. -- С. 240-242. -- ISBN 978-5-9901767-2-0.

14. Терпиловский, М.А. Стимулирующее влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на развитие растений томатов / М.А. Терпиловский, Д.В. Каменек // Материалы докладов XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009»; секция «Биология»; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов / Сост.: А.Н. Демидова и др. -- 13-18 апреля 2009. -- М.: МАКС Пресс, 2009. -- 172-173 с. -- ISBN 978-5-317-02774-8.

15. Терпиловский, М.А. Действие дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis на возбудителя фитофтороза томатов Phytophthora infestans / М.А. Терпиловский, Л.К. Каменек // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии»; Казань. -- 15-16 сентября 2008. -- Казань: Казанский государственный университет, 2008. -- С. 133-134. -- ISBN 978-5-9222-0235-0.

16. Терпиловский, М.А. Изучение антифунгального действия дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis в отношении фитопатогенных грибов / М.А. Терпиловский, А.А. Тюльпинева, Д.В. Каменек, Л.К. Каменек // Материалы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008»; секция «Биология», подсекция «Микробиология» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев. -- 8-11 апреля 2008. -- М.: Издательство МГУ; СП МЫСЛЬ, 2008. -- C. 22. -- ISBN 978-5-91579-003-1.

Размещено на Allbest.ru

...