Размещено на http://www.allbest.ru/

Цикл оксида азота и его регуляция в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Никашина Анастасия Александровна

Ростов-на-Дону 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения России (г. Ростов-на-Дону)

Научный руководитель: доктор биологических наук Крукиер Ирина Ивановна

Официальные оппоненты: Микашинович Зоя Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой общей и клинической биохимии №1 с курсом органической и неорганической химии ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» (г. Ростов-на-Дону)

Франциянц Елена Михайловна, доктор биологических наук, профессор, заведующая гормональной лабораторией Ростовского НИИ онкологии (г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» (г. Краснодар)

Защита диссертации состоится «24» сентября 2014 года в 11⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» (344090. г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: г. Ростов-на-Дону, ул. Зорге 21ж.

Автореферат разослан «_____»______________ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Околоплодные воды являются сложной, биологически активной средой, обеспечивающей, наряду с другими факторами, нормальную жизнедеятельность плода. В последнее десятилетие очевидность важной роли околоплодных вод и плодных оболочек в течение внутриутробного развития эмбриона и плода не вызывает сомнения, однако представление о многих обменных процессах в этих биологических средах нуждаются в дальнейшем исследовании. Данных о роли околоплодных вод и плодных оболочек как посредников передачи информации от материнского организма к плоду и от плода к матери, а также о динамике регуляторных процессов в указанных биологических объектах при физиологической и осложненной беременности крайне мало.

Осложненная беременность обычно протекает на фоне глубоких метаболических изменений и сопровождается внутриутробной гипоксией. В этих условиях имеет место чрезмерная продукция оксида азота, свободнорадикальная природа которого общеизвестна. Согласно концепции, выдвинутой Реутовым В.П. с соавторами (1992;1994;1998), превращение оксида азота в другие азотсодержащие соединения (NO₂, NO₃, NO⁺, NO^- и т.д.) осуществляется в ходе окислительно-восстановительных реакций, протекающих в виде метаболического цикла. Этот метаболический цикл может активироваться при различных состояниях, в том числе и на фоне гипоксии. Зависимость цикла оксида азота (NO) от концентрации кислорода связана с тем, что активация процессов восстановления нитритов в NO происходит при участии гемсодержащих белков, способных связывать кислород. В отсутствии последнего или при его дефиците восстановленные гемсодержащие белки начинают переносить электроны на ионы NO₂, которые, в свою очередь, восстанавливаются в NO. Такая множественность эффектов NO в цикле оксида азота объясняется большим количеством продуктов его метаболизма, которые приводят к различным биологическим эффектам, что позволило называть его «дву- или даже многоликим Янусом» (Snyder S.H., 1993). Поэтому до сих пор возникают многочисленные вопросы о причине «многоликости» оксида азота, на которые до сих пор нет определенного ответа.

Кроме указанных свойств, NO обладает выраженным вазодилататорным эффектом, что объясняет широкий спектр биорегуляторного действия этой молекулы, а когда его физиологические функции изменяются на цитотоксические образуется пероксинитрит (ONOO^-). Поскольку образование NO в организме лимитируется активностью NO-синтазы (NOS) (КФ 1.14.13.39), важным представляется изучение этого фермента в околоплодных водах и плодных оболочках.

Несмотря на многочисленные биохимические исследования последних лет, посвященные механизмам формирования различных осложнений беременности (в том числе преждевременных родов), ряд ключевых реакций регуляции прежде всего белкового обмена в плодных оболочках и околоплодных водах остаются практически не изученными. К их числу относится аминокислотный состав указанных биологических сред. Известно, что основной путь обмена аминокислот между матерью и плодом происходит через плаценту, однако возможен параплацентарный транспорт через плодные оболочки и поглощение аминокислот плодом с околоплодными водами (Орлов В.И. и др., 1998; 2009).

Наиболее важной аминокислотой, связанной с NO, является L-аргинин, который, как известно, способен окисляться в организме с образованием одного из ключевых регуляторов клеточного метаболизма - оксида азота (Марков Х.М., 1996; 2000; Ignaro L. et al., 1999). Однако пути метаболизма L-аргинина не ограничиваются продукцией NO. Наибольшая скорость синтеза аргинина наблюдается в цикле мочевины (орнитиновый цикл). От мощности работы цикла (орнитин-цитруллин-аргинин) зависит способность организма очищаться от белковых шлаков (Реутов В.П. и др., 1998). Следует отметить, что цитруллин, являющийся сопродуктом оксида азота при окислении аргинина, способен вновь превращаться в аргинин и в настоящее время этот путь трактуется как цитруллин/NO-цикл или аргинин/цитруллин-цикл (Morris S. et al., 1994). Аргинин является одним из самых эффективных стимуляторов продукции соматотропного гормона гипофиза и позволяет поддерживать его концентрацию на верхних границах нормы, а недостаток его приводит к замедлению роста детей (Чернобровкин М.Г. и др., 2004). Концентрация аргинина зависит от активности аргиназы, которая превращает его в орнитин и мочевину. Аргиназа (КФ 3.5.3.1.) - регуляторный фермент, определяющий доступность аргинина для синтеза оксида азота, пролина и глутамата, а также полиаминов. Аргиназа в процессе сложных ферментативных реакций обеспечивает также и синтез пролина, который в большом количестве содержится в коллагене - основном белке соединительной ткани.

В связи с вышеизложенным, целью исследования явилось изучение особенностей становления цикла оксида азота и компонентов его регуляции в околоплодных водах и плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Оценить продукцию оксида азота и активность NOS в околоплодных водах и плодных оболочках в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

2. Изучить и сопоставить динамику содержания аминокислотного состава околоплодных вод и плодных оболочек в разные периоды физиологической и осложненной беременности.

3. Определить в разные периоды физиологической и осложненной беременности интенсивность свободнорадикальных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках.

4. Оценить активность аргиназы в околоплодных водах и плодных оболочках в разные сроки физиологической и осложненной гестации.

5. Разработать объективные критерии для оценки состояния плода и прогноза состояния новорожденного.

Научная новизна. В процессе исследования впервые:

- получены новые сведения о содержании оксида азота, активности NOS и аргиназы в околоплодных водах и плодных оболочках в процессе формирования физиологической гестации и их дисбалансе при развитии различных осложнений беременности;

проведено сравнительное изучение динамики содержания аргинина и его производных (пролина и цитруллина), участвующих в регуляции клеточных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках в разные периоды физиологической и осложненной гестации;

установлены соотношения между изученными аминокислотами в околоплодных водах при различных осложнениях беременности, что позволило разработать способ прогнозирования задержки роста плода (патент № 2425379, 2010);

показано, что плацентарная недостаточность, лежащая в основе многих осложнений беременности, развивается на фоне усиления свободнорадикальных процессов в околоплодных водах и плодных оболочках. околоплодный плодный аминокислотный беременность

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физиологическое течение беременности сопровождается значительными изменениями продукции NO, активности NOS и аргиназы, а также ряда аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина) в околоплодных водах. Степень этих изменений, направленных на создание оптимальных условий для развития плода, различна в разные периоды гестации.

2. Осложненная беременность (ПН, ЗРП, преждевременные роды) развивается на фоне дисбаланса в околоплодных водах уровня аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина), оксида азота и активности NOS и аргиназы. Наиболее выраженные изменения имеют место при ЗРП и преждевременных родах.

3. Увеличение продукции производных оксида азота (ONOO^-, NO-глутатиона и NO-тирозина) в околоплодных водах, сопровождающееся усилением свободнорадикальных реакций, является одним из механизмов негативного влияния данных процессов, приводящих к ухудшению течения гестации.

4. Модификация продукции NO, изученных аминокислот, а также активности ферментов их обмена и свободнорадикальных реакций в плодных оболочках свидетельствует об их участии в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом.

Теоретическое и практическое значение работы. Выполненные биохимические исследования расширяют существующие представления о роли оксида азота и продуктов его метаболизма - некоторых аминокислот (аргинина, пролина, цитруллина) и других биоактивных компонентов в процессе нормального развития беременности и формировании плацентарной недостаточности, являющейся одним из наиболее распространенных осложнений гестации.

Полученные в работе данные создают теоретические предпосылки для коррекции метаболических нарушений в фетоплацентарном комплексе, особенно в те периоды гестации, в которые установлены наиболее значительные биохимические нарушения в околоплодных водах и плодных оболочках.

В результате проведенных исследований разработан информативный критерий для диагностики задержки роста плода (патент № 2425379, 2010), который внедрен в практику (в родильном отделении ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России).

Материалы диссертации используются в лекционных курсах на кафедре акушерства, а также на семинарах по повышению квалификации врачей Учебного центра РНИИАП.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации изложены и обсуждены на следующих научных форумах: V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2009); III, V, VI Региональных научных форумах «Мать и дитя» (Саратов, 2009; Геленджик, 2011; Ростов-на-Дону, 2012); XI, XII, XIII, XIV Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2010, 2011, 2012, 2013); VI, VII национальных научно-практических конференциях с международным участием «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health» (Smolensk, 2009, 2011); IX, X, XI, XII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении (дни медицинской лабораторной диагностики)» (Ростов-на-Дону, 2010, 2011, 2012, 2013); III научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободно-радикальная медицина и антиоксидантная терапия», «Кислород и антиоксиданты» (Волгоград, 2010); Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины - возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010); V, VI международных конгрессах по репродуктивной медицине (Москва, 2011, 2012); конференции «Биохимия-биофизика-информатика - три кита лабораторной медицины XXI века» (Санкт-Петербург, 2010); Международной научно-практической конференции "Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии" (Судак, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК МОН РФ - 7 статей, получен 1 патент. Личный вклад автора составляет 75%. Общий объем публикаций 3,16 печатного листа.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 143 отечественных и 135 иностранных источников. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на базе клинических и научных подразделений ФГБУ «Ростовский НИИ акушерства и педиатрии» Минздрава России (РНИИАП).

Обследовано 150 беременных в возрасте 20-35 лет, находившихся под наблюдением в клинических подразделениях РНИИАП и давших информированное согласие на расширенный алгоритм обследования в соответствии с юридическим договором.

Контрольную группу составили 55 здоровых женщин с неосложненной гестацией: 10 беременных - в 15-19 недель, 12 - 20-23 нед., 13 - 24-27 нед. и 20 - 39-40 недель беременности. В основные группы вошли 95 женщин с различными осложнениями гестации: с плацентарной недостаточностью - 25 беременных в 15-27 недель и 20 - в 39-40 недель гестации; с задержкой роста плода - 16 женщин в 15-27 недель и 15 - в 39-40 недель беременности. У 19 женщин имели место преждевременные роды.

Диагнозы плацентарная недостаточность и задержка роста плода были поставлены на основании комплексного динамического обследования.

В исследование у вышеуказанных женщин брали околоплодные воды и плодные оболочки. Околоплодные воды получали при их отхождении или амниотомии в I периоде родов (35-37 нед., 39-40 нед.), а также путем проведения амниоцентеза (15-27 нед.). Для исследования брали 10-15 мл околоплодных вод. Непригодными считали пробы, загрязненные кровью или меконием.

Плодные оболочки получали путем отделения их от последа в процессе родов и затем промывали от крови и мекония физиологическим раствором.

Перед исследованием проводили пробоподготовку материала. Околоплодные воды центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об./мин.

Плодные оболочки гомогенизировали в ступке с кварцевым песком, затем центрифугировали 15 минут при 3000 об./мин., в анализ брали экстракт.

Определение содержания оксида азота (его метаболитов NO₂^-, NO₃^-.). Эндогенный уровень оксида азота определяли с помощью классической реакции Грисса после энзиматического восстановления нитратов в нитриты (Green L. et al., 1982), обозначаемых в литературе NO_x. Регистрацию результатов проводили на спектрофотометре Varian «Саrу-50» (США) при длине волны 520 нм. Значение концентрации определяли в мкмоль/л.

Определение активности NOS. Активность NOS (КФ 1.14.13.39) оценивали по увеличению продукции оксида азота по уровню его метаболитов из L-аргинина в присутствии NADPH (Di Julio J.L. et al., 1994). Уровень образовавшегося оксида азота в форме его метаболитов (NO₂^-, NO₃^-) определяли с помощью классической реакции Грисса (Green L. et al., 1982) и обозначали как NO_х.

Определение активности аргиназы. Активность аргиназы (КФ 3.5.3.1.) определяли колориметрическим методом (Тиц Н.У., 2003) по увеличению продукции мочевины из L-аргинина (Меньшиков В.В., 1987).

Определение содержания аминокислот (L-аргинина, L-пролина, L-цитруллина). Идентификацию и количественное определение свободных форм аргинина, пролина и цитруллина выполняли методом капиллярного электрофореза с использованием немодифицированного кварцевого капилляра («Капель-105», «Люмэкс», С.-Петербург, Россия). Обработку данных проводили при помощи IBM PC с программным обеспечением «Мультихром» (АО «Амперсенд»).

Определение содержания ONOO^-, NO-глутатиона, NO-тирозина. О степени инактивации NO судили по количественному содержанию ONOO^-, которое определяли спектрофотометрически (Лобышева И.И. и др., 1999).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 5.1, фирмы StatSoft. Inc.) и Excel. Достоверность различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента и его аналогу для непараметрических распределений - критерию Манна-Уитни (U-критерий). Однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена c расчетом коэффициента ранговой корреляции (r) и вычислением его средней ошибки.

Результаты исследования и их обсуждение

Оксид азота и активность NOS и аргиназы в околоплодных водах в разные периоды физиологической и осложненной беременности.

Результаты собственных исследований показали, что в норме продукция вазоактивного NO и активность NOS в околоплодных водах существенно возрастают по мере развития физиологической беременности (рис. 1) и достигают своих максимальных величин к 38-40 неделям гестации.

К концу беременности уровень указанных показателей в амниотической жидкости возрастает, в среднем, в 3 раза, по сравнению с 15-19 неделями гестации, что, по-видимому, необходимо для обеспечения возрастающей трофики плода. Что касается аргиназы (рис.1), то пик её активности в околоплодных водах приходится на 20-23 неделю беременности и совпадает с пиком содержания аргинина при физиологической беременности.

Рис. 1 Изменение содержания NOx (мкмоль/л) и активности NOS (мкмоль/л) и аргиназы (мкмоль/мин*мг) в околоплодных водах женщин в разные сроки физиологической беременности

По-видимому, именно в этот период наиболее усиливаются пролиферативные и ангиогенные процессы, сходные с наблюдаемыми в плаценте и обеспечивающие нормальное развитие сосудистой сети и формирование данного органа (Praff A.W., et al., 2005). Известно также, что в процессе формирования плаценты происходят изменения метаболического обеспечения пролиферации на уровне аргиназного пути метаболизма, характеризующиеся максимальной активностью аргиназы и высоким уровнем аргинина (Шестопалов А.Ю., 2007). Очевидно, в околоплодных водах наблюдается аналогичная ситуация.

В амниотической жидкости, взятой у женщин с осложненной беременностью в сроке 15-27 недель (рис. 2), продукция NO была наиболее повышена при ЗРП - в 4 раза, и при плацентарной недостаточности - в 3 раза, активность NOS увеличивалась в меньшей степени: на 71% - при ЗРП, и на 65% - при ПН по, сравнению с контролем.

Активность аргиназы, напротив, была снижена при указанных осложнениях беременности, но особенно при ЗРП (на 41,6%), относительно контрольных величин. Было показано, что местная доступность аргинина в качестве субстрата для NOS может быть снижена вследствие изменения активности аргиназы (Граник В.Г., 2003). Так как в нашем случае активность аргиназы уменьшалась, то можно предположить, что это связано с высоким уровнем NO_х и NOS. Содержание NO_х, активность NOS и аргиназы при доношенной беременности и преждевременных родах представлены на рисунке 2.



Рис. 2 Изменение содержания NOx, активности NOS и аргиназы (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН и ЗРП и преждевременные роды)

Обозначения: * - достоверные различия показателя по сравнению с контрольной группой (p<0,05).

При ПН уровень NO_х был увеличен на 13%, а активность NOS достоверно не изменялась. При ЗРП и особенно преждевременных родах, напротив, содержание NO_х снижалось на 31% и 46%, соответственно. Активность NOS также достоверно снижалась при ЗРП - на 19,7% и при преждевременных родах - на 48,9%. Активность аргиназы при всех осложнениях беременности была повышена: при ПН и ЗРП, в среднем, на 50%, а при преждевременных родах - в 2,3 раза.

Очевидно, что снижение уровня NO_х и активности NOS при таких тяжелых осложнениях беременности, как ЗРП и преждевременные роды, приводит к таким явлениям, как спазм сосудов пуповины, уменьшение транспорта кислорода и питательных веществ, поступающих к плоду, усиление отрицательных последствий кислородной недостаточности и, в конечном итоге, к срыву беременности (в случае с преждевременными родами).

Одной из причин разнонаправленных изменений активности NOS и аргиназы в околоплодных водах женщин с указанными осложнениями беременности может быть динамика экспрессии трансформирующего фактора роста (ТФР-). Известно ингибирующее влияние ТФР- на активность NOS, и, напротив, его индуцирующий эффект на аргиназную активность (Shearer J.D. et al., 1997), что в определенной мере может объяснить возможные регуляторные механизмы выявленных нами нарушений активности ферментов аргининового обмена.

Что касается незначительного увеличения продукции оксида азота у женщин с ПН, то оно, по-видимому, носило компенсаторный характер и в комплексе с другими регуляторными молекулярно-клеточными механизмами позволило создать условия для донашивания беременности, хотя и протекающей с угрозой прерывания.

Уровень аргинина, пролина и цитруллина околоплодных вод в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

Имеющиеся данные о функциональной взаимозависимости между состоянием плода и составом амниотической жидкости свидетельствуют о важной диагностической ценности изучения этой биологической среды.

Среди азотистых компонентов амниотической жидкости одно из важных мест занимают свободные аминокислоты. Они служат предшественниками биоактивных соединений, включаются в энергетический обмен. Некоторые из аминокислот выполняют самостоятельные функции, в частности, являясь индукторами синтеза стероидных гормонов и пролиферативных процессов, а также активными нейромедиаторами. Изменение соотношения аминокислот в околоплодных водах, очевидно, может отражаться на состоянии плода, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных маркеров перинатальных повреждений и прогностических показателей состояния новорожденного.

Пример электрофореграммы уровня L-аргинина, L-пролина и L-цитруллина представлен на рисунке 3.



Рис. 3 Электрофореграмма определения свободных форм аминокислот в амниотической жидкости

Полученные данные свидетельствуют о том, что по мере развития физиологической беременности содержание L-аргинина в амниотической жидкости увеличивается в 2 раза относительно начальных сроков (15-19 нед.) и достигает своих максимальных концентраций к середине гестации (20-23 нед.).

Известно, что аргинин является важным регулятором многих физиологических и биохимических процессов (Hanaoka C. et al., 1989), а также участвует в коммуникации между нервными клетками (Дмитриенко Н.П. и др., 2008). Что касается продукции пролина и цитруллина, то наиболее высокое содержание этих аминокислот в амниотической жидкости наблюдается в сроках 15-19 недель беременности.

Согласно данным ВОЗ, в мире ежегодно рождается около 21 млн. детей, имеющих низкую массу тела. При этом, если в развитых странах только 25-33% из них отстают в развитии, то в развивающихся странах таких детей большинство (Benson W.E. et al., 1978).

Результаты наших исследований (рис. 4) свидетельствуют о существенных изменениях в уровне свободных аминокислот (аргинина, пролина и цитруллина) в околоплодных водах, полученных у женщин с ПН и задержкой роста плода в 15-27 недель беременности, по сравнению с нормально протекающей беременностью.

Рис. 4 Изменение содержания аминокислот (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН и ЗРП и преждевременные роды). Обозначения как на Рис. 2

Так, уровень аргинина в эти сроки был повышен на 31,5% и 45,3% при ПН и ЗРП, соответственно. Содержание пролина и цитруллина, напротив, уменьшалось при указанных осложнениях беременности: при ПН и ЗРП уровень пролина снижался на 50% и 58%, а цитруллина - на 32% и 41%, соответственно. Одной из причин такого дисбаланса в содержании изученных аминокислот может быть нарушение плацентарной продукции и/или модификация их трансплацентарного перехода в околоплодную среду. С другой стороны, снижение уровня пролина и цитруллина, очевидно, является проявлением дезадаптации и одной из причин развития этой патологии.

Характер изменения продукции изученных аминокислот в 39-40 нед. осложненной беременности (ПН, ЗРП), а также при преждевременных родах (36-37 нед.) имел свои особенности. Уровень аргинина увеличен на 64% при ПН и на 72% - при ЗРП, а цитруллина, напротив, снижен в среднем на 14% при указанных осложнениях беременности, и лишь продукция пролина отличается по своей динамике: при ЗРП она снижена, также как и в предыдущие сроки осложненной беременности (на 32%), а при ПН, наоборот, повышена (на 29%).

Что касается динамики аминокислот в амниотической жидкости у женщин с преждевременными родами, то у них достоверно изменялся уровень аргинина и цитруллина. Так, продукция аргинина была повышена на 71%, а цитруллина снижена на 45%, уровень же пролина практически не отличался от контрольных величин при физиологической гестации.

Определенную информацию о состоянии новорожденного при осложненной беременности даёт расчет коэффициентов аргинин/пролин, аргинин/цитруллин и пролин/цитруллин.

По результатам изучения аминокислотного состава в околоплодных водах, расчета соответствующих коэффициентов (рис. 5) и сопоставления с состоянием новорожденных разработан «Способ диагностики задержки роста плода», в основу которого легло определение отношения концентраций аргинина к пролину, наиболее увеличивающееся при ЗРП (в 3,5 раза). Нами был предложен информативный тест для ранней диагностики ЗРП, на который получен патент № 2425379.

Рис. 5 Отношения содержания аргинин/пролин, аргинин/цитруллин, пролин/цитруллин в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН, ЗРП и преждевременные роды). Обозначения как на Рис. 2

Проанализировав все соотношения содержания указанных аминокислот при ПН, ЗРП и преждевременных родах, можно сделать вывод, что существенные изменения в 3 триместре, также как и во 2, наблюдались при ЗРП. Наибольшие изменения к концу беременности были отмечены для соотношения аргинина к цитруллину (в 3 раза), что указывает на существенную роль указанных нарушений в возникновении такого серьезного осложнения беременности, каким являются преждевременные роды. Очевидно, что использование предлагаемого коэффициента при диагностике позволит начать терапию этого осложнения беременности ещё до появления клинических признаков.

Обнаруженный нами дисбаланс в системе «аргинин-цитруллин» может быть обусловлен нарушением активности основных ферментов их обмена (аргиназы и NOS), что подтверждается полученными нами ранее данными о значительных изменениях активности указанных ферментов при осложненной беременности.

Свободнорадикальные процессы в околоплодных водах в разные сроки физиологической и осложненной беременности.

Известно, что воздействие оксида азота может значительно видоизменяться в результате реакций с активными формами кислорода (АФК). Чрезмерная продукция оксида азота, являющегося в определенных условиях, в том числе и гипоксии, мощным свободным радикалом, может привести к образованию цитотоксического ONOO^-. Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы. (Марков Х.М., 2001). Известно, что продуктом нитрования тирозина с участием АФК является NO-тирозин, который считается маркёром NO-зависимого оксидативного стресса (Mohiuddin I. et al., 2006).

В процессе развития физиологической беременности продукция ONOO^- в околоплодных водах нарастает (рис. 6), максимально увеличиваясь к концу гестации (на 68%).



Рис. 6 Изменение содержания ONOO^-, NO-глутатиона и NO-тирозина (нмоль/мг белка) в околоплодных водах женщин в разные сроки физиологической беременности

Пик уровня NO-глутатиона и NO-тирозина наблюдался к середине гестации (20-23 нед.). Содержание NO-тирозина к концу гестации снижалось на 31% по сравнению с началом второго триместра (15-19 нед.).

Развитие осложненной беременности сопровождалось усилением продукции ONOO^- и NO-глутатиона в околоплодных водах, взятых в сроке 15-27 нед. (рис. 7).

Рис. 7 Изменение содержания ONOO^-, NO-глутатиона и NO-тирозина (в % к контролю) в околоплодных водах женщин (15-27 нед., 35-37 нед., 39-40 нед.) с осложненной беременностью (ПН, ЗРП и преждевременные роды). Обозначения как на Рис. 2

Наибольшие изменения отмечались при ПН: продукция ONOO^- и NO-глутатиона увеличивалась на 56% и 30%, соответственно, уровень NO-тирозина достоверно не отличался от контрольных значений. Что касается ONOO^-, участвующего в регуляции кислородсвязывающих свойств гемоглобина, то его высокий уровень, по-видимому, обусловлен гипоксией, имеющей место у женщин с ПН. При ЗРП модификации подверглись все нитропроизводные оксида азота, но эти изменения были менее выражены. Так, уровень ONOO^- увеличился на 28%, NO-глутатиона и NO-тирозина - на 27% относительно контрольных величин.

В конце осложненной, но доношенной беременности наблюдалась аналогичная динамика, как и во 2 триместре, но наибольшие изменения отмечались при ЗРП: продукция ONOO^- повышалась на 45%, NO-глутатиона - на 57%, а NO-тирозина - на 41%. При ПН изменения были менее выражены: содержание ONOO^- увеличивалось лишь на 24%, а NO-глутатиона и NO-тирозина - на 35% и 28%, соответственно. Наибольшие изменения отмечались при преждевременных родах. Особенно сильно увеличивалось содержание NO-глутатиона (на 61%), содержание ONOO^- и NO- тирозина в среднем было повышено на 46%.

Следует отметить, что нитрозилирование тиолов и, прежде всего, глутатиона, а также тирозиннитрирование - важные проявления клеточного действия NO. Различная по интенсивности степень модификации продукции производных оксида азота при доношенной и недоношенной беременности, по-видимому, вносит определенный вклад в характер регуляторных процессов и компенсаторных механизмов, определяющих исход гестации.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что увеличение продукции указанных компонентов околоплодных вод, сопровождающееся усилением свободнорадикальных реакций, по-видимому, является одним из механизмов негативного влияния данных процессов, приводящих к ухудшению течения гестации.

Плодные оболочки и их роль в параплацентарном обмене между организмами матери и плода.

Более полное представление о взаимосвязи между организмами матери и плода может дать изучение плодных оболочек, участвующих в параплацентарном обмене. Среди нарушений беременности одно из ведущих мест занимают преждевременные роды, обусловленные ПН и являющиеся основной причиной перинатальной заболеваемости и смертности. Частота этой патологии, по данным различных авторов, колеблется в широких пределах (4-12%) и не имеет тенденции к снижению (Савельева Г.М. и др., 1991; 2006; Сидельникова В.М., 2002).

Уровень аргинина, пролина и цитруллина в плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Результаты наших исследований показали, что в процессе развития физиологической беременности содержание аминокислот в плодных оболочках к концу гестации было, в среднем, в 2 раза выше, чем в околоплодных водах.

Осложненная беременность сопровождалась (рис. 8) падением уровня аргинина в плодных оболочках при всех указанных патологиях, особенно это было характерно для ЗРП.

Рис. 8 Изменение содержания аминокислот (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности (ПН (39-40 нед.), ЗРП (39-40 нед.), преждевременные роды(35-37 нед.)). Обозначения как на Рис. 2

Продукция аргинина в плодных оболочках также уменьшалась при ПН на 82%, при ЗРП - на 87% и при преждевременных родах - на 81% относительно нормы. Содержание пролина и цитруллина при ПН имеет аналогичную, но менее выраженную динамику: содержание пролина снижается на 23%, а цитруллина - на 61% относительно контрольных величин.

При ЗРП и преждевременных родах уровень пролина также был снижен (на 35% и 37%, соответственно). Противоположная динамика наблюдалась для цитруллина, содержание которого было увеличено в плодных оболочках при данных осложнениях беременности (при ЗРП - на 81%, а при преждевременных родах - в 2,7 раза).

Нами, также как и для околоплодных вод, было рассчитано соотношение изученных аминокислот в плодных оболочках. Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшие изменения наблюдались (также, как и в околоплодных водах) для отношения аргинин/пролин - при ЗРП и аргини/цитруллин - при преждевременных родах. Однако если в околоплодных водах это отношение повышалось в несколько раз, то в плодных оболочках наблюдалась противоположная ситуация: отношение аргинин/пролин снижалось почти в 6 раз (при ЗРП), а аргинин/цитруллин - в 14 раз (при преждевременных родах). Имеющиеся в литературе данные о синтезе белков, аминокислот, активности некоторых ферментов их обмена (Погорелова Т.Н., 1984; Хлыбова С.В. и др., 2006) и других биоактивных веществ в плодных оболочках свидетельствуют об их регуляторных возможностях в координации процессов параплацентарного обмена между матерью и плодом.

Содержание оксида азота, активность NO-синтазы и аргиназы в плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Уровень изученных вазоактивных соединений в плодных оболочках имеет свои особенности. Известно, что в плодных оболочках продукция вазоактивных веществ возможна только в их децидуальной части, в которой обнаруживаются капилляры-синусоиды, являющиеся самыми дистальными отделами кровеносной системы матки, а также в амниальном эпителии (Tigconi G. et al., 1996).

При задержке роста плода и преждевременных родах в плодных оболочках наблюдалась аналогичная динамика модификации вазоактивных веществ, как и в околоплодных водах. Уровень метаболитов оксида азота был снижен на 26% при ЗРП и на 19% - при преждевременных родах. Активность NOS также понижалась относительно контрольных величин при указанных осложнениях беременности в среднем на 27% (рис. 9).

Противоположная динамика выявлена для продукции NO и активности фермента его обмена - NOS при плацентарной недостаточности: было обнаружено повышение содержания NO_х (на 20%) и активности NOS (на 27%) относительно соответствующих показателей при нормальной беременности.

Что касается активности аргиназы в плодных оболочках при плацентарной недостаточности, то она снижена на 28%, а при других осложнениях беременности, напротив, повышена: при ЗРП - на 65% и при преждевременных родах - в 2 раза.

Рис. 9 Изменение содержания NО_x, активности NOS и аргиназы (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности (ПН (39-40 нед.), ЗРП (39-40 нед.), преждевременные роды(35-37 нед.)). Обозначения как на Рис. 2

Следует отметить, что изменение продукции вазотоников в плодных оболочках и околоплодных водах при некоторых осложнениях беременности (ЗРП, преждевременные роды) имеет одинаковую направленность, хотя степень этих изменений различна в этих биологических средах.

Свободнорадикальные процессы в плодных оболочках при физиологической и осложненной беременности.

Широкий диапазон физиологических эффектов NO реализуется через различные механизмы, в том числе, и через участие в процессах свободнорадикального окисления. Взаимодействие NO с активными формами кислорода имеет сложный характер, он может быть как источником радикалов, так и их гасителем (Зинчук В.В. и др., 2006).

В результате исследований было показано (рис. 10), что содержание ONOO^- в плодных оболочках достоверно повышено при всех указанных осложнениях беременности по сравнению с контролем. Так, содержание ONOO^- при ПН было увеличено на 67,5%, при ЗРП - на 86%, а при преждевременных родах - в 2 раза.

Можно предположить также, что ONOO^- является не только цитотоксичным окислителем, но и фактором регуляции кислородсвязывающих свойств гемоглобина, потому, очевидно, что при его высокой продукции будет наблюдаться снижение кислородного насыщения, приводящее к гипоксии.

Рис. 10 Изменение содержания ONOO^-, NO-глутатиона и NO-тирозина (в % к контролю) в плодных оболочках при осложненной беременности (ПН, ЗРП, преждевременных родах). Обозначения как на Рис. 2

Наряду с изменением вышеназванных компонентов, имело место снижение уровня тиольных производных оксида азота. При всех осложнениях беременности было обнаружено снижение содержания NO-глутатиона: при ПН - на 40%, при ЗРП - на 50% и при преждевременных родах - на 61%. Следует отметить, что все осложнения гестации также сопровождались усилением образования нитропроизводного оксида азота - NO-тирозина: при ЗРП - на 32%, при преждевременных родах - на 53%.

В условиях выявленного нарушения генерации оксида азота и его производных создаются предпосылки для развития нитрозирующего и оксидативного стресса. Известно, что оксидативный стресс обычно сопровождается эндотелиальной дисфункцией, в результате чего запускается сложная цепь патологических реакций (гиперпродукция АФК, ONOO^- и нитропроизводных NO). В конечном итоге данная ситуация заканчивается генерализованным спазмом мелких сосудов в организме беременной, энергодефицитом и усилением гипоксических явлений. Экспрессия индуцирующих апоптоз факторов, усиливающих оксидативный стресс, приводит, по-видимому, к снижению эластичности и прочности плодных оболочек, что является причиной их спонтанного разрыва, особенно выраженного при преждевременных родах.

ВЫВОДЫ

1. Продукция NO, активность NOS и аргиназы в околоплодных водах существенно возрастают по мере развития физиологической беременности. Для осложненного течения беременности, прервавшейся в разные сроки, характерны разнонаправленные изменения в содержании NO_х, активности NOS и аргиназы в околоплодных водах: при ПН и ЗРП во втором триместре показатели NO_х и NOS повышены, а активность аргиназы - снижена. В третьем триместре при доношенной беременности (ЗРП), а также при преждевременных родах уровень NO_х, активность NOS напротив снижается, а активность аргиназы повышается.

2. В процессе физиологической беременности происходят значительные изменения в содержании изученных аминокислот околоплодных вод. Наиболее высокое содержание пролина и цитруллина наблюдается к 15-ой неделе гестации, а аргинина - к 20-23 неделям.

При осложненном течении беременности содержание аминокислот существенно изменяется относительно контрольных показателей. Концентрация аргинина повышается, а цитруллина снижается при всех изученных вариантах развития осложненной гестации и на всем её протяжении, что свидетельствует о неспецифичности данных изменений. Динамика содержания пролина имеет некоторые особенности: при ЗРП (в 15-27 нед. и 39-40 нед.), ПН (15-27нед.) и преждевременных родах (35-37 нед.) уровень пролина снижается, а у женщин с ПН, доносивших беременность (39-40 нед.) - повышается.

3. Содержание ONOO^- в амниотической жидкости при физиологической беременности наиболее высоко в третьем триместре, тогда как содержание NO-тирозина в этот период гестации снижено.

Осложненная беременность сопровождается значительными изменениями содержания ONOO^-, NO-глутатиона и NO-тирозина в околоплодных водах. Наибольшее увеличение продукции отмечалось для ONOO^- при ПН в сроки 15-27 недель. При осложненной, но доношенной беременности (39-40 нед.), а также при преждевременных родах наблюдается аналогичная динамика, но максимальные изменения отмечалются для NO-глутатиона (при ЗРП и преждевременных родах).

4. В плодных оболочках в процессе развития физиологической беременности содержание аминокислот увеличивается и к концу гестации превышает их концентрацию в околоплодных водах в среднем в 2 раза.

При осложненной беременности имеет место снижение содержания аргинина и пролина в плодных оболочках при всех указанных патологиях и повышение содержания цитруллина.

5. При ЗРП и преждевременных родах в плодных оболочках наблюдается уменьшение уровня NO_х и активности NOS, а также повышение активности аргиназы. Противоположная динамика обнаружена для указанных показателей при ПН: содержание NO_х и активность NOS повышены, а активность аргиназы - снижена относительно соответствующих контрольных величин.

6. В плодных оболочках продукция ONOO^- и NO-тирозина повышена при всех указанных осложнениях беременности, особенно при преждевременных родах (содержание ONOO^- увеличено в 2 раза, а NO-тирозина - в 1,5 раза). Обратная динамика наблюдается для NO-глутатиона: его уровень снижен при всех осложнениях беременности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Никашина А.А. Определение содержания L-аргинина в амниотической жидкости методом капиллярного электрофореза / Нарежная Е.В., Аскалепова О.И., Никашина А.А., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. // Аналитическая химия, 2010, Т. 65, № 12. С.1309-1312 (0,16 п.л., лич. вкл. 75%).

2. Никашина А.А. Прогностическое значение определения содержания аргинина и пролина в околоплодных водах при задержке роста плода / Крукиер И.И., Нарежная Е.В., Авруцкая В.В., Никашина А.А. // Известия ВУЗов, Северо-Кавказский регион. Естественные науки, 2011, № 3. С.95-98 (0,16 п.л., лич. вкл. 75%).

3. Никашина А.А. Определение свободных форм L-аргинина и L-пролина в амниотической жидкости / Нарежная Е.В., Аскалепова О.И., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Никашина А.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2011, №1. С.48-50 (0,12 п.л., лич. вкл. 65%).

4. Никашина А.А. Количественное определение L-пролина в биологическом материале методом капиллярного зонного электрофореза / Нарежная Е.В., Аскалепова О.И., Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А. // Клиническая лабораторная диагностика, 2011, № 1. С.7-9 (0,12 п.л., лич. вкл. 60%).

5. Никашина А.А. Нарушение метаболизма аминокислот в околоплодных водах при акушерской патологии / Крукиер И.И., Нарежная Е.В., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Леонова А.В. // Проблемы репродукции, специальный выпуск, Москва, 2012. С.38-39 (0,04 п.л., лич. вкл. 80%).

6. Никашина А.А. Активность свободнорадикальных процессов в сыворотке крови женщин с беременностью высокого риска / Никашина А.А., Крукиер И.И., Кудаев А.Е., Ходарева Н.К., Круглова С.В. // Медицинский вестник Юга России, 2013, № 4. С.115-118 (0,16 п.л., лич. вкл. 90%).

7. Никашина А.А. Определение уровня L-цитруллина в амниотической жидкости у женщин с физиологической беременностью методом капиллярного электрофореза / Нарежная Е.В., Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Серкова С.В. // Клиническая лабораторная диагностика, 2013, №11. С.39-41 (0,12 п.л., лич. вкл. 75%).

8. Никашина А.А. «Способ диагностики задержки роста плода» / Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В., Никашина А.А., Друккер Н.А. // Патент № 2425379, от 26.03.2010г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

9. Никашина А.А. Применение метода капиллярного зонального электрофореза для определения L-аргинина в биологических жидкостях / Нарежная Е.В., Никашина А.А., Крукиер И.И., Погорелова Т.Н. //Материалы V Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды. Ростов-на-Дону, 2009. С. 95 (0,04 п.л., лич. вкл. 70%).

10. Nikashina A.A. Strengthening of the peroxynitrite placental production in the process of gestosis development / Pogorelova T.N., Gunko V.O., Drukker N.A., Krukier I.I., Nikashina A.A. // «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health», Smolensk, 2009. P.143-144 (0,04 п.л., лич. вкл. 65%).

11. Никашина А.А. Динамика продукции пероксинитрита в околоплодных водах при задержке роста плода / Крукиер И.И., Погорелова Т.Н., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Зайцева Н.Г. // Материалы IV Ежегодного конгресса специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество», Москва, 2009. С.33-34 (0,04 п.л., лич. вкл. 60%).

12. Никашина А.А. Окислительная модификация биомолекул в сыворотке крови и околоплодных водах женщин - показатель метаболомных нарушений в системе мать-плод / Крукиер И.И., Никашина А.А., Лигидова А.С., Рожков А.В. // Материалы IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении», Ростов-на-Дону, 2010. С.68-69 (0,04 п.л., лич. вкл. 75%).

13. Никашина А.А. Интенсивность свободнорадикального окисления в сыворотке крови и околоплодных водах при невынашивании беременности / Никашина А.А., Крукиер И.И., Дубровина С.О., Маклюк А.М. // Материалы 3-го научно-практического симпозиума с международным участием «Свободно-радикальная медицина и антиоксидантная терапия», «Кислород и антиоксиданты», Волгоград, 2010, № 2. С.59-60 (0,04 п.л., лич. вкл. 85%).

14. Никашина А.А. Новые критерии диагностики задержки роста плода / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Нарежная Е.В. //Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя», Москва, 2010. С.111-112 (0,04 п.л., лич. вкл. 85%).

15. Никашина А.А. Клинико-диагностическое значение определения активности свободно-радикальных процессов в оценке беременности высокого риска / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Никашина А.А., Рожков А.В. //Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010, Т. 3. С. 312-314 (0,12 п.л., лич. вкл. 65%).

16. Nikashina A.A. Determination of L-arginine in amniotic fluid by capillary zone electrophoresis / Narezhnaya E.V., Askalepova O.I., Nikashina A.A., Krukier I.I., Pogorelova T.N. // Journal of Analytical Chemistry, 2010, Vol.65, №12. P.1280-1283 (0,16 п.л., лич. вкл. 65%).

17. Nikashina A.A. Free radical processes of membranes placenta and fetal membranes in placental insufficiency / Krukier I.I., Nikashina A.A., Degtyareva A.S., Rozhkov A.V. // «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health», Smolensk, 2011. P.105-106 (0,04 п.л., лич. вкл. 85%).

18. Никашина А.А. Продукция ангиогенных факторов роста в плодных оболочках и ее роль в формировании осложненной беременности / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В., Никашина А.А. // Материалы конференции «Биохимия-биофизика-информатика - три кита лабораторной медицины XXI века», научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум», Санкт-Петербург, 2011, №3(39). С.65-66 (0,04 п.л., лич. вкл. 70%).

19. Никашина А.А. Динамика системы аргинин-NO-пероксинитрит в плаценте и околоплодных водах при осложненной беременности / Крукиер И.И., Авруцкая В.В., Нарежная Е.В, Никашина А.А., Дегтярева А.С., Норец С.Н. // Материалы V Регионального Научного Форума «Мать и дитя», Геленджик, 2011. С.74-75 (0,16 п.л., лич. вкл. 85%).

...