Роль свободнорадикальных процессов в формировании устойчивости к окислительному стрессу у потомков предадаптированных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Роль свободнорадикальных процессов в формировании устойчивости к окислительному стрессу у потомков предадаптированных животных

03.00.04 - биохимия

Волосовцова Галина Ивановна

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Шкурат Татьяна Павловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Эмирбеков Эмирбек Зиядович

доктор медицинских наук Шестопалов Александр Вячеславович

Ведущая организация: Государственный научный центр - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, г. Москва.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Cвободныe радикалы кислорода и его активные метаболиты играют ключевую роль во многих биохимических и генетических процессах, протекающих в клетке (Владимиров и др., 1973; Кричевская и др., 1980; Лукаш и др., 1981; Ames, 1983, Halliwell, 1985; Gutteriadge, 1995; Allen, 2000; Kohen еt аl., 2002; Singh, 2004, Benz еt аl., 2008). С одной стороны, клетка использует активные метаболиты кислорода для регуляции энергетических систем, с другой - их уровень увеличивается при стрессе различной этиологии, злокачественном росте, атеросклерозе, диабете, бронхиальной астме и др. (Boros et al., 1989; Kasai et al., 1991; Halliwell, 1998; Sahnoun et al., 1998; Лукаш и др., 1999; Шустанова и др., 2001; Yonei et al., 2002; Wu et al.; 2003; Cooke et al., 2003; Reddy, 2008). Свободные радикалы кислорода могут индуцировать деструкцию мембран, снижать активность ферментов и гормонов, вызвать повреждения ДНК, нарушение клеточного цикла и, в конечном итоге, инициировать гибель клетки (Внуков и др., 1983; Chiu et al., 1989, Гуськов и др., 1985; Kang et al., 1999; Jackson et al., 2001; Шустанова и др, 2001; Klein et al., 2003; Djordjevic et al., 2004; Fang et al., 2004; Valco et al., 2005; Милютина и др., 2005). В связи с этим, проблема повышения устойчивости организма к окислительному стрессу является достаточно актуальной.

Ранее было показано, что токсическое действие на организм разнообразных физических, химических и биологических факторов может быть снижено предварительным воздействием малых доз токсического агента. Это явление получило название предварительной адаптации или предадаптации (Ригер и Михаэлис, 1978). Феномен повышения устойчивости организма в результате предадаптации получил название адаптивного ответа (Samson, 1977). Показана неспецифичность феномена адаптивного ответа для различных факторов, условий воздействия (in vivo и in vitro) и объектов (микроорганизмы, растения и животные) (Спитковский, 1992; Joiner еt аl., 1999; Опритов и др., 1999; Моргун и др., 2002; Васильева, 2004; Busija et al., 2008).

Особой формой адаптивных реакций животных является реакция незрелого организма на окислительный стресс. Презумпивные клетки адаптивнее воспринимают новый режим функционирования, чем клетки взрослого организма. Так, у шпорцевых лягушек этот эффект способен сохраняться и после достижения животными половозрелого состояния (Тимофеева, 1997; Гуськов и др., 1999). У новорожденных крыс после воздействия малых доз гипербарической оксигенации (ГБО) формируется качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем, которое сохраняется и у взрослых животных. Предадаптированные крысы приобретают повышенную устойчивость к токсическим режимам ГБО (Азарова, 2005).

Целью настоящей работы явилось изучение свободнорадикальных процессов у предадаптированных к окислительному стрессу животных и их потомков в условиях нормально функционирующего организма и после развития окислительного стресса, индуцируемого ГБО.

Задачи исследования:

1. Определить интенсивность свободнорадикальных процессов в различных тканях потомства предадаптированных в новорожденный период крыс к окислительному стрессу.

2. Определить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню содержания молекулярных продуктов и антиоксидантный статус в различных тканях у потомков предадаптированных животных после развития окислительного стресса, индуцированного ГБО.

3. Провести сравнительный анализ изменения активности антиоксидантных ферментов и интенсивности перекисного окисления липидов в мозге, печени и легких в ответ на воздействие токсического режима ГБО у потомков, полученных от предадаптированных родителей.

4. Оценить цитогенетические последствия окислительного стресса, индуцируемого ГБО (0,5 МПа-1ч) в пролиферирующих тканях предадаптированных животных и их потомков.

Научная новизна. Впервые показано, что однократное воздействие повышенного давления кислорода (0,2 МПа-1ч) на новорожденных крыс изменяет внутриклеточный метаболизм, в частности систем, ответственных за перекисное окисление липидов, и формирует качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем в организме, которое сохраняется длительное время и наблюдается у потомков первого поколения. Показана возможность передачи устойчивости к окислительному стрессу от животных, однократно обработанных в новорожденный период низким режимом ГБО. Показано, что ответ на действие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных животных зависит от пола предадаптированного родителя. Экспериментально показано снижение стресс-индуцированного ГБО накопления продуктов перекисного окисления липидов во всех исследованных тканях у потомков предадаптированных самок. Представлены доказательства повышенной устойчивости генома к окислительному стрессу у потомков самок, предадаптированных в новорожденный период.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Однократная обработка животных низкой дозой ГБО 0,2МПа в течение 1 часа в новорожденном возрасте изменяет внутриклеточный метаболизм тканей, в частности, систем, ответственных за перекисное окисление липидов.

2) Сформировавшееся качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем в организме предадаптированных животных сохраняется у потомков первого поколения.

3) Первое поколение предадаптированных к окислительному стрессу животных обладает повышенной емкостью антиоксидантных систем, которые обеспечивают устойчивость к токсическому режиму ГБО у потомков предадаптированных самок.

4) Однократная обработка животных низкой дозой ГБО в новорожденный период приводит к стабилизации кластогенного эффекта в ответ на действие токсических режимов ГБО. Эффект кластогенной предадаптации сохраняется у потомков первого поколения предадаптированных самок и не выявлен у потомства предадаптированных самцов.

Теоретическое и практическое значение работы: В общетеоретическом плане, выполненная работа расширяет существующие представления о возможностях предадаптации млекопитающих к окислительному стрессу в ряду поколений. Результаты исследования, представленные в работе, позволяют количественно и качественно оценить влияние предадаптации новорожденных животных на устойчивость к повреждающему воздействию на ткани организма ГБО - индуцированного стресса у потомков предадаптированных животных. Выявлена возможность предадаптировать однократной обработкой ГБО в новорожденный период организм взрослых животных и их потомков к окислительному стрессу. Установлен эффект наследования устойчивости к окислительному стрессу у потомков предадаптированных самок. Полученные в работе данные представляют существенный интерес для раскрытия механизмов приспособления организма к постоянно меняющимся условиям окружающей среды, а также для разработки различных методов повышения резистентности организма к экстремальным условиям среды. Полученные результаты расширяют представления о свободнорадикальных и мутационных процессах в организме при окислительном стрессе, открывают новые перспективы их практического применения в адаптационной, космической и подводной медицине. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Свободные радикалы в живых системах», «Мутагены окружающей среды», «Химический мутагенез», «Экологическая генетика», «Основы патобиохимии», «Генетика окислительного стресса».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета РГУ (2003, 2005, 2006); на международной конференции «Гипербарическая медицина» (Москва, 2003); на Всероссийском съезде ВОГиС (Москва, 2004); на заседании Ростовского отделения общества ВОГиС (2005, 2006); International Workshops and Scientific Discussion Club «New Thechnology in Integrative Medicine and Biology» (Bangkok-Pattaya, 2006); на ХIV международной конференции «New Information Technologies in medicine, biology, pharmacology and ecology» (Гурзуф, 2006); на международной научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 2 статьи. Личный вклад 62,5 %,- 1,58 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, списка использованной литературы, включающего 189 отечественных и 204 зарубежных источника. Работа содержит 17 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых беспородных крысах Rattus norvegicus обоего пола массой 200-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Окислительный стресс моделировали воздействием на животных разными режимами гипербарической оксигенации.

Для предадаптации (ПА) животных к окислительному стрессу на 3-й день после рождения 1/3 часть новорожденных животных была однократно подвержена гипербарической оксигенации в режиме 0,2 МПа в течение 1 часа, поскольку в предыдущих исследованиях, выполненных на базе НИИ биологии РГУ, был показан предадаптирующий эффект именно этого режима (Брень, 1997; Тимофеева, 1997; Гуськов и др., 1999). После достижения половозрелости предадаптированных животных (3 месяца) были проведены следующие скрещивания:

интактная самка х интактный самец (+К х >К)

интактная самка х 0,2 МПа-1ч самец (+К х >ПА)

0,2 МПа-1ч самка х интактный самец (+ПА х >К)

0,2 МПа-1ч самка х 0,2 МПа-1ч самец (+ПА х >ПА).

Половозрелое потомство первого поколения, полученное в результате данных скрещиваний, было подвергнуто обработке ГБО в режиме 0,5МПа в течение 1 часа. Изучение воздействия такого режима представляет особый интерес, поскольку не вызывает гибели животных, что позволяет изучать в динамике изменение основных показателей адаптации крыс к окислительному стрессу.

свободнорадикальный окислительный стресс предадаптированный



Рис.1. Схема эксперимента.

В каждом варианте потомков исследовали животных, обработанных ГБО (0,5МПа-1ч) сразу и через 24 часа после окончания воздействия. Исследования проводились согласно общепринятым нормам биоэтики и в соответствии со статьей 11-й Хельсинской декларации Второй медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003г).

В соответствии с задачами исследования были изучены биохимические, биофизические показатели плазмы крови, эритроцитов, ткани мозга, печени, легких и генетические показатели эпителиоцитов роговицы глаз. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию молекулярных продуктов - диеновых конъюгатов (ДК) (Стальная, 1977), малонового диальдегида (МДА), шиффовых оснований (ШО) (Bidlack, Tappel, 1973). Активность СОД определяли методом Fried (1975), каталазы - методом Королюка и др., (1988). Определение оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) проводили методом Ревина в модификации Колба, Камышникова (1982), суммарной пероксидазной активности по методу Лукаша и др., (1996). Содержание белка в гомогенатах тканей, в плазме и в суспензии эритроцитов определяли методом Лоури (1951). Количество гемоглобина определяли гемоглобинцианидным методом (Каракашов, Вичев, 1973). Определение активности антиоксидантных ферментов проводили в лизате эритроцитов и супернатанте гомогенатов тканей и пересчитывали с учетом содержания в биологическом материале белка или гемоглобина. Определение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) плазмы крови в системе Н₂О₂ - люминол проводили по методу Шестакова и др. (1979). Регистрировали высоту быстрой вспышки (h) и светосумму (Sm) хемилюминесценции в течение 100 секунд.

Для цитогенетических исследований готовили временные давленные препараты роговицы глаз по стандартной методике (Дарлингтон, 1980). Учет аберраций хромосом проводили анафазно-телофазным методом. Пролиферативную активность клеток учитывали с помощью митотического индекса (МИ). В каждом варианте анализировали не менее 1500 анафаз.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica v. 6.0. Достоверность полученных различий оценивали по t - критерию Стьюдента (Владимирский, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсивность свободно-радикальных процессов и активность антиоксидантных ферментов у предадаптированных животных и их потомков

Результаты проведенных исследований позволили установить, что обработка новорожденных крыс повышенным давлением кислорода 0,2 МПа -1ч приводит к длительным метаболическим изменениям, которые сохраняются у взрослых животных и их потомков первого поколения. У взрослых животных, подвергавшихся воздействию низкого режима ГБО в трехдневном возрасте, отмечалось повышение интенсивности свободнорадикальных процессов, проявляемое в возрастании параметров Н₂О₂-люминол хемилюминесценции в плазме крови. Высота быстрой вспышки, характеризующая разложение предшествующих гидродиоксидов липидов стала больше на 21%, а величина светосуммы - 38% больше, по сравнению с интактными животными (рис.2).

Исследуемые нами параметры хемилюминесценции плазмы крови крыс, полученных в результате реципрокных скрещиваний предадаптированных особей, различались. Так, у потомков предадаптированных самок и интактных самцов интенсивность высоты быстрой вспышки и светосуммы достоверно выше, чем у потомков контрольной группы родителей, на 115% и 49%, соответственно. Менее выраженная интенсивность свободнорадикальных процессов, регистрируемая ХЛ, отмечалась у потомков предадаптированных самцов - высота быстрой вспышки превышала контроль на 49%. У потомков обоих предадаптированных животных величина светосуммы, отражающая степень окисляемости тканевых липидов стала в 2 раза ниже, чем у потомков предадаптированных самок (+ПАx>К), но выше чем у контрольной группы на 30% (рис.2).

Рис.2. Интенсивность Н₂О₂-люминол хемилюминесценции в плазме крови у предадаптированных животных и их потомков

Примечание: на рис.2-4. *- обозначает статистически достоверные различия, по сравнению с К, **- +Кx>К.

Следовательно, повышенный уровень свободнорадикальных процессов у предадаптированных к окислительному стрессу животных передается по наследству первому поколению потомков. Уровень индукции Н₂О₂-люминол хемилюминесценции плазмы крови животных зависит от варианта реципрокных скрещиваний. Наиболее повышена интенсивность ХЛ в плазме крови потомков предадаптированных самок.

Изучение процессов ПОЛ показало, что предадаптация к ГБО приводит к повышению содержания в эритроцитах продуктов ПОЛ у животных и их потомков, по сравнению с контролем. В потомстве предадаптированных самок (+ПАx>К) уровень первичных (ДК) и вторичных продуктов ПОЛ выше контрольных значений на 33% и 36% (р<0,05), соответственно. У потомков предадаптированных самцов (+Кx>ПА) содержание ДК и ШО было выше контроля на 22% и 26% (р<0,05), а у потомков обоих предадаптированных животных уровень ДК на 114% и МДА на 33% превышал значение таковых у потомков +Кx>К.

А Б

В Г

Рис.3. Уровень продуктов ПОЛ у предадаптированных животных и их потомков по отношению к контролю: А) -эритроциты крови; Б) - мозг; В) - печень; Г) - легкие.

Примечание: обозначения на рис.2.

В головном мозге потомков предадаптированных крыс, как и у самих предадаптированных животных, отмечался повышенный уровень содержания продуктов ПОЛ относительно контроля. У животных, полученных от скрещивания предадаптированных самок увеличение содержания первичных продуктов ПОЛ - ДК составляет 184%. В обратном скрещивании, у потомков предадаптированных самцов (+Кx>ПА) отмечалось превышение абсолютных значений конечного продукта - ШО на 205%, у потомков обоих предадаптированных животных содержание ДК и ШО выше контроля на 141% и 140%, соответственно.

В печени у потомков предадаптированных животных также регистрировалось повышенное содержание продуктов ПОЛ, по отношению к интактным животным, но в значительно меньшей степени, чем у родителей. У потомков, полученных от скрещивания предадаптированных самок и интактных самцов, уровень МДА был выше контроля на 48%. У потомков предадаптированных самцов и интактных самок отмечено уменьшение содержания ДК на 28% (р<0,05), тогда как уровень МДА стал выше контроля на 37%. У потомков обоих предадаптированных животных в ткани печени было увеличение содержания первичного продукта ПОЛ - ДК на 34% (р<0,05).

В легочной ткани у потомков предадаптированных самок (+ПАx>К) было отмечено увеличение содержания изучаемых продуктов ПОЛ: уровень ДК превышал контроль на 73% и МДА - 29% (р<0,05) (рис. 3), тогда как у потомков предадаптированных самцов содержание продуктов ПОЛ в легочной ткани достоверно не отличалось от контроля. У животных, полученных от скрещивания предадаптированных самок и самцов (+ПАx>ПА) зарегистрировано увеличение уровня МДА на 50%, по отношению к контролю.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что у предадаптированных к окислительному стрессу животных и их потомков, интенсивность процессов ПОЛ в соматических тканях выше, чем у контрольных животных. Степень накопления продуктов ПОЛ в тканях различна, в зависимости от варианта проведенных скрещиваний.

Токсическое действие свободных радикалов на жизнедеятельность клетки привело к повышению емкости антиоксидантной защиты (Лю, 2002, 2004). Ферментные АО являются первым функционально сопряженным звеном защиты от активных кислородных соединений, в связи с этим следующий раздел работы посвящен рассмотрению влияния предадаптации на активность АО ферментов в крови животных и их потомков.

Рис.4. Активность СОД в эритроцитах у предадаптированных животных и их потомков

Примечание: обозначения на рис.2.

Предадаптированные крысы отличались повышенной активностью антиоксидантных ферментов в эритроцитах. Активность СОД в эритроцитах была более чем в 3 раза выше, по сравнению с интактными животными. У потомков, полученных от скрещивания предадаптированных самок (+ПА x >К и +ПА x >ПА), повышение активности СОД составило 115% и 104%, соответственно. У потомков предадаптированных самцов (+Кx>ПА) активность СОД в эритроцитах повышена на 39% (р<0,05).

В отличие от повышенной интенсивности ПОЛ активность антиоксидантных ферментов в соматических тканях потомков предадаптированных животных значительно ниже контроля. Следует отметить, что у потомков предадаптированных самок активность СОД в головном мозге не имела достоверных отличий, по сравнению с потомками контрольных животных, тогда как у потомков предадаптированных самцов в мозге, печени и легких регистрировали угнетение ее активности. Более того, у потомков предадаптированных самцов в печени и легких зарегистрировано угнетение активности как СОД, так и каталазы.

Таким образом, нами установлено, что потомки предадаптированных к ГБО животных наследуют «изменный окислительный метаболизм», сформировавшийся в организме родителей после однократного воздействия повышенного давления кислорода. Новое соотношение про- и антиоксидантных систем, по-видимому, находилось в равновесии. В пользу этого свидетельствует тот факт, что потомки предадаптированных животных были подвижны, носовых кровотечений и диареи не отмечалось, шерсть была густой, белой, блестящей, крысы не теряли в весе. При вскрытии также не было обнаружено какой-либо патологии внутренних органов. В связи с этим представляло интерес изучить, каким образом предадаптация родителей влияет на устойчивость к ГБО - воздействию их потомков при различных вариантах скрещивания. Поскольку метаболический след предадаптации к окислительному стрессу у потомства имеет разнонаправленный характер, в зависимости от пола предадаптированного родителя, в каждой группе потомков контролем служили животные, не подвергавшиеся воздействию ГБО.

Влияние ГБО на интенсивность свободно-радикальных процессов в различных тканях потомков предадаптированных животных

В эксперименте сеанс ГБО вызывал развитие окислительного стресса, который проявлялся в возрастании параметров Н₂О₂-люминол ХЛ у потомков контрольных животных (+Кx>К), тогда как у потомков предадаптированных самок наблюдалось четкое снижение интенсивности хемилюминесценции, которое можно рассматривать как показатель устойчивости к ГБО воздействию. У потомков предадаптированных самцов ГБО-индуцированный окислительный стресс вызвал повышение показателей Н₂О₂-люминол ХЛ (как сразу после окончания действия стрессирующего агента, так и в последействии), что можно рассматривать как снижение резистентности к воздействию ГБО (рис.5).

А Б

Рис. 5. Влияние ГБО 0,5МПа-1ч на интенсивность Н₂О₂ - люминол хемилюминесценции у потомков предадаптированных животных: А) сразу после окончания действия ГБО; Б) через 24 час после действия ГБО

Примечание: на рис. 5 - 10 обозначены статистически достоверные различия, по сравнению с контролем * при уровне различий 0,05; ** - 0,01; *** - 0,001.

Полученные данные были подтверждены результатами исследования активности антиоксидантных ферментов и содержания продуктов ПОЛ в крови. Так, у потомков предадаптированных самок действие ГБО стимулировало активность СОД и каталазы сразу после окончания действия ГБО на 21% и 41%, соответственно. Очевидно, усиление антиоксидантной защиты было достаточным, чтобы ингибировать ПОЛ на стадии зарождения процесса, на что указывает отсутствие изменений в содержании ДК и МДА в крови животных. Снижение уровня ШО сразу после воздействия ГБО может служить тому подтверждением.

А Б

Рис.6. Изменения активности АО ферментов и уровня продуктов ПОЛ в крови у потомков при ГБО-индуцированном стрессе: А)+ПАx>К; Б) +Кx>ПА

Примечание: обозначения на рис.5.

В обратном варианте скрещивания, действие ГБО угнетает антиоксидантную защиту и способствует накоплению продуктов ПОЛ в крови крыс (как сразу после действия, так и через 24 часа).

Следующим этапом нашего исследования явилось изучение СПА в плазме крови как одного из показателей дестабилизации мембран эритроцитов при действии токсического режима ГБО. У потомков предадаптированных самок (+ПАx>К) отсутствие изменений СПА можно расценивать как показатель резистентности мембран к повреждающему действию ГБО. У потомков предадаптированных самцов следствием усиления ПОЛ в крови, обнаруженном нами при окислительном стрессе, явилась дестабилизация эритроцитарных мембран, зарегистрированная в значительном повышении уровня СПА как в условиях ГБО, так и в постгипероксический период.

А Б

Рис.7. Динамика (А) СПА (усл.ед./мл) и (Б) ЦП в плазме крови потомков предадаптированных животных после ГБО - 0,5 МПа-1час

Примечание: обозначения на рис.2.

Действие ГБО в режиме 0,5МПа-1ч приводит к резкому повышению оксидазной активности ЦП в плазме крови потомков предадаптированных самцов, составляющей 68% (рис.7), по сравнению с контрольным значением (до ГБО воздействия).

Интенсивность свободнорадикальных процессов, состояние антиоксидантной системы, в первую очередь, зависят от характера метаболических процессов в различных тканях. Большое значение имеют не только абсолютные величины активности про- и антиоксидантных систем, но и их соотношение между собой, буферная емкость антиоксидантной защиты.

Как видно из представленных данных, воздействие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самок снизило уровень первичных и конечных продуктов ПОЛ в мозге (рис.8). Уровень содержания МДА, ДК и ШО не изменился и остался таким через 24 часа после окончания действия стрессирующего агента. Активность СОД увеличилась на 44%, что, возможно, оказалось достаточным для снижения уровня продуктов ПОЛ - ДК и ШО.

А Б

Рис.8. Изменения активности СОД и уровня продуктов ПОЛ в мозге у потомков: А) +ПАx>К, Б) +Кx>ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.

У потомков, полученных в результате скрещивания предадаптированных самцов и интактных самок (+Кx>ПА), пребывание в условиях токсического режима ГБО (0,5 МПа-1ч) вызвало ингибирование активности CОД в мозге на 68%. В постгипероксический период отмечалось значительное накопление изучаемых молекулярных продуктов ПОЛ и активность СОД (рис.8). Избыточная выработка перекиси водорода в результате реакции дисмутации ведет к увеличению образования гидроксильных радикалов, взаимодействие которых с ненасыщенными жирнокислотными цепями в молекулах липидов относится к первому типу реакций и может рассматриваться как одна из основных реакций инициирования перекисного окисления липидов в биологических мембранах. Следовательно, можно предположить, что через 24 часа после окончания воздействия ГБО (0,5МПа-1ч) в мозге у потомков предадаптированных самцов происходит инициация свободнорадикальных процессов.

Следующим этапом нашей работы было исследование влияния действия ГБО (0,5МПа-1ч) на интенсивность свободнорадикальных процессов в печени потомков предадаптированных к окислительному стрессу животных. Печень участвует в регуляции практически всех видов обмена веществ и обеспечивает необходимые условия жизнедеятельности для других органов и тканей. Стрессорное действие ГБО характеризуется развитием ПОЛ, занимающего ключевое место в повреждении гепатоцитов.

А Б

Рис.9. Изменения активности СОД, каталазы и уровня продуктов ПОЛ в печени у потомков группе животных: А) +ПАx>К, Б) +Кx>ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.

Сразу после окончания действия повышенного давления кислорода у животных, полученных в результате скрещивания предадаптированных самок и интактных самцов, в печени снизилось содержание молекулярных продуктов ПОЛ: МДА - 40%, ШО - 22% при увеличении активности каталазы на 12% (р<0,05) и осталось без изменений через 24 часа (рис.9).

В условиях токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самцов ингибировалась активность антиоксидантной защиты. Сразу после окончания воздействия ГБО (0,5 МПа-1ч) активность каталазы в ткани печени уменьшилась на 45% в сравнении с контролем, что сопровождалось накоплением молекулярных продуктов ПОЛ в постгипероксическом периоде. Уровень МДА, ШО превосходили контроль на 167% и 115%. При этом активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) также значительно возрастала (рис. 9).

При контакте с гипероксической средой напряжение кислорода последовательно возрастает в легочной ткани, затем в крови и далее в других органах и тканях. Ткань легких в силу своей специфической функции газообмена и в связи с общепринятым способом оксигенациии подвергается действию относительно более высокого парциального давления кислорода.

Воздействие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самок и интактных самцов (+ПАx>К) приводило к снижению уровня ПОЛ в легких, о чем свидетельствует снижение содержания ДК, ШО и активности СОД (рис.10). Через сутки после воздействия ГБО активности СОД стала еще ниже (на 70%), по сравнению с контролем, а активность каталазы повысилась. Восстановление функционального равновесия процессов пероксидации и антиоксидантной защиты проявилось снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов (рис.10).

А Б

Рис. 10. Изменения активности СОД и уровня продуктов ПОЛ в легких у потомков группе животных: А) +ПА x >К, Б) +К x >ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.

У потомков предадаптированных самцов (+Кx>ПА) сразу после окончания воздействия ГБО (0,5 МПа-1ч) в ткани легких достоверных изменений изучаемых показателей не наблюдалось. Однако через 24 часа отмечали резкое смещение равновесия про- и антиоксидантной активности в сторону усиления процесса перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует значительное накопление молекулярных продуктов ПОЛ на фоне чрезмерного напряжения антиоксидантной системы защиты клетки - повышение активности антиоксидантных ферментов. Уровень ДК, МДА и ШО превышал контрольные значения на 154%, 437% и 210%, соответственно, а активность СОД и каталазы - на 217% и 120%, соответственно.

Таким образом, ответ на действие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных животных зависит от пола предадаптированного родителя. Полученные результаты свидетельствуют, что мозг, кровь и периферические ткани потомков предадаптированных самок более устойчивы к развитию окислительного стресса, индуцированного ГБО, по сравнению с потомками предадаптированных самцов.

Аберрации хромосом и пролиферативная активность эпителиоцитов роговицы глаз у потомков предадаптированных животных

Степень кластогенного действия какого-либо фактора может отражать направленность и выраженность протекающих в организме процессов свободнорадикального окисления, поскольку основной причиной нарушения целостности ДНК при различных стрессорных воздействиях является прямое и опосредованное действие активных метаболитов кислорода. Снижение уровня аберраций хромосом после воздействия токсической дозы агента у любых организмов составляет суть кластогенной адаптации и неотьемлимую часть реакции адаптивного ответа (Riger et al., 1990). Во всех вариантах эксперимента у животных, полученных от реципрокных скрещиваний, уровень аберраций хромосом находился в пределах спонтанного (1,7-2,6%). После действия токсического режима ГБО (0,5МПа-1ч) уровень аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаз вырос в 3 раза и через сутки оставался на высоком уровне (табл.1, 2).

Таблица 1.

Уровень аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаза у потомков предадаптированных животных

ВАРИАНТ	До ГБО	ГБО	Через 24ч после ГБО
F1	+Кх>К	1,7 ± 0,16	6,7 ± 0,31*	5,4 ± 0,29*
	+ПАх>К	2,5 ± 0,27	2,3 ± 0,27	2,4 ± 0,34
	+Кх>ПА	2,6 ± 0,47	1,9 ± 0,17	4,3 ± 0,27*

Примечание: достоверность * при Р<0,05

У животных первого поколения, полученных в результате различных вариантов скрещиваний адаптированных и неадаптированных к окислительному стрессу родителей, ответ на действие повышенного давления кислорода различен. Так у потомков предадаптированных самок (+ПАx>К) при воздействии токсического режима ГБО уровень аберраций хромосом остается неизменным. Пролиферирующая активность клеток не нарушена. Одинаковый уровень хромосом (как до воздействия, так и после) можно рассматривать как свидетельство кластогенной адаптации к повреждающему агенту.

Таблица 2.

Уровень пролиферативной активности эпителиоцитов роговицы глаза у потомков предадаптированных животных

ВАРИАНТ	До ГБО	ГБО	Через 24ч после ГБО
F1	+К х >К	1,6±0,14	1,6±0,13	1,6±0,11
	+ПА х >К	2,5±0,24	2,1±0,18	0,7±0,11
	+К х >ПА	1,6±0,15	0,8±0,09*	1,0±0,09

Примечание: достоверность * при Р<0,05

Совершенно иную реакцию на окислительный стресс, индуцируемый действием ГБО в режиме 0,5МПА-1час, зарегистрировали при обратном скрещивании. В результате действия повышенного давления кислорода у потомков предадаптированых самцов и интактных самок практически в 2 раза вырос уровень аберраций хромосом, при этом пролиферативность эпителиальных клеток роговицы глаза животных снизилась. Следовательно, у потомков предадаптированных самцов отмечались отрицательные последствия действия окислительного стресса на геном.

Динамика некоторых биохимических показателей может дать существенную информацию о процессах, определяющих возможности адаптации животных к экстремальным воздействиям ГБО. Показатели стрессорного состояния организма и цитогенетический анализ процента аберраций хромосом в эпителиоцитах глаз позволяют комплексно оценивать реактивность организма к повреждающему агенту. Анализируя данные реципроктных скрещиваний (предадаптированная самка и интактный самец, интактная самка и предадаптированный самец), можно говорить о материнском эффекте в наследовании адаптивной реакции практически по всем исследуемым показателям.

Согласно концепции протекторного катаболизма (Гуськов и др., 1989), механизм, обеспечивающий адаптацию на молекулярном уровне, заключается в следующем. При действии стрессорных факторов на организм наименее стабильные продукты биополимеров клетки подвергаются деструкции, продукты которой увеличивают резистентность организма, т.е., обеспечивают адаптацию. При длительном и многократном воздействии экстремального фактора возможности цитоплазматического протекторного катаболизма исчерпываются и необратимому повреждению подвергаются ядерные структуры части соматических клеток. Ephrussi (1959) описал «эпигенетическую изменчивость» у многоклеточных организмов и показал, что константное вегетативное наследование приобретенных признаков связано не с изменением генотипа, а с изменением детерминант цитоплазмы. Ранее была показана роль митохондрий в повышенной устойчивости к окислительному стрессу у новорожденных животных, по сравнению с более взрослыми животными. Так при изучении активности митохондриальной аконитазы и 8-ОНdG как индикаторов уровня митохондриального супероксида и окислительных повреждений ДНК, соответственно, было выявлено, что при окислительном стрессе у взрослых животных активность фермента и содержание 8-ОНdG увеличивались, в отличие от незрелых крыс. При этом активность MnSOD и CuZnSOD не изменялась ни у взрослых, ни у незрелых животных. Эти результаты позволили предположить, что митохондриальный окислительный стресс может быть ключевым фактором, который обеспечивает устойчивость развивающегося организма к АФК индуцированному повреждению (Patel et al., 2003).

Известно, что в митохондриях находится примерно 90% клеточного кислорода, из них 2% конвертируется в супероксидные радикалы. В условиях гипероксии нарушение функционирования электрон транспортной цепи митохондрий может приводить к повышению уровня свободных радикалов. Металлосодержащие белки дыхательной цепи митохондрий - один из основных источников эндогенных активных форм кислорода в клетке (Melovs et al., 1998). Частота спонтанных митохондриальных мутаций в 5-10 раз выше, по сравнению с ядерными (Brown et al., 1982), и при этом в условиях окислительного стресса наиболее часто регистрируются трансверсии. Более того, показана способность повреждений в митохондриальной ДНК персистировать, т. е., сохраняться в ряду клеточных поколений, в то время как повреждения ядерного генома эффективно репарируются. Вероятность возникновения новых изоформ белковых молекул после действия ГБО достаточно велика. Особое значение при этом будут иметь те белки, которые участвуют в контроле уровня АФК.

Возможно, в наших экспериментах материнский эффект устойчивости к окислительному стрессу может быть обусловлен появлением новых изоформ митохондриальных цитохромоксидаз.

На основании результатов проведенных исследований и данных литературы по исследуемой проблеме, мы предполагаем следующие возможные механизмы наследуемой адаптации новорожденных животных к окислительному стрессу: геномный импринтинг материнских хромосом как следствие метилирования ДНК после окислительного стресса; изменения экпрессии генов адаптивных признаков; неспецифическая активация генов, контролирующих интенсивность свободнорадикальных процессов в ядрах ооцитов; формирование новых изоформ митохондриальных цитохромоксидаз; селекция митохондрий в гетероплазматических клетках овариальных животных.

ВЫВОДЫ

1. Однократное воздействие гипербарической оксигенации в режиме 0,2 МПа-1ч на новорожденных крыс вызывает изменения в окислительном метаболизме взрослых животных, характеризующиеся качественно новым соотношением про- и антиокисдантных систем организма. Эти изменения наследуются потомками первого поколения.

2. Уровень повышенной индукции Н₂О₂-люминол хемилюминесценции плазмы и молекулярных продуктов ПОЛ в крови животных первого поколения зависит от пола предадаптированного родителя. Наиболее существенно повышен уровень ХЛ в плазме крови потомков предадаптированных самок и интактных самцов.

3. Характер скрещивания влияет на систему антиоксидантной защиты крови, что проявляется в более высокой активности СОД у потомков предадаптированных самок, по сравнению с потомками предадаптированных самцов.

4. Воздействие ГБО 0,5 МПа-1ч снижает уровень молекулярных продуктов ПОЛ в мозге и печени у потомков предадаптированных самок (F₁+ПАx>К) и увеличивает - у потомков предадаптированных самцов (F₁ +Кx>ПА).

5. Во всех вариантах эксперимента у потомков, полученных от реципрокных скрещиваний предадаптированных животных, уровень аберраций хромосом в соматических тканях находится в пределах адаптивной нормы. Воздействие токсического режима ГБО (0,5МПа-1) не изменяет уровня аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаза у потомков предадаптированных самок и увеличивает у потомков предадаптированных самцов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шкурат Т.П., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н. Влияние предварительной обработки животных окислительным стрессом на состояние антиоксидантных систем у потомков первого поколения.//Валеология. 2009. - №1. - С. 76-82. - 0,29 п.л.,- личный вклад 90%.

2. Гуськов Е.П., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Вардуни Т.В., Волосовцова Г.И., Гуськов Г.Е., Шкурат Т.П. Мутационные процессы у животных, предадаптированных к окислительному стрессу. //Экологическая генетика. 2009. - Т.VII.-№1. -С. 40-47. - п.л., - 0,36 личный вклад 45%.

3. Guskov E.P., Shkurat T.P., Milutina N.P., Mashkina E.V., Prokofiev V.N., Pokudina I.O., Timofeeva I.V., Belichenko N.I., Volosovceva G.I. Resistance to oxidative stress maternal effect //VIII International meeting on high pressure biologi.-Moscow, 2-6 june, 2003., P. 24-25.- 0,08 п.л.,- личный вклад 45%.

4. Гуськов Е.П., Шкурат Т.П., Милютина Н.П., Прокофьев В.Н., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Волосовцова Г.И., Азарова А.Э. Устойчивость к окислительному стрессу: материнский эффект.//III Съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». М., 6-12 июня 2004 г., С. 429.- 0,04 п.л.,- личный вклад 35%.

5. Волосовцова Г.И., Азарова А.Э., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Гутникова Л. В., Шкурат Т.П., Гуськов Е.П. Цитогенетическая адаптация к окислительному стрессу.//III Съезд ВОГиС “Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития». М., 6-12 июня 2004., С. 449. - 0,04 п.л., - личный вклад 80%.

6. Азарова А.Э., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Волосовцова Г.И., Шкурат Т.П., Гуськов Е.П. Кластогенная адаптация к ГБО - индуцированному стрессу//. В сб. «Актуальные проблемы биологии и медицины», Томск, 2004 - С.16-19.-0,17 п.л.,- личный вклад 35%.

7. Азарова А. Э., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н., Милютина Н.П., Шкурат Т.П.. Свободнорадикальные процессы в тканях животных, предадаптированных к окислительному стрессу.//"Известия Высших учебных заведений Северо-Кавказский регион", Естественные науки, приложение №3 (27). Ростов-на-Дону. 2005г.- C. 63-67.- 0,22 п.л.,- личный вклад 40%.

8. Shkurat T.P., Mashkina E.V., Volosovcova G.I., Milutina N. P., Guskov E.P. Mutation and free-radical processes in animals, pre-adapted to oxidative stress.//International Workshops and Scientific Disscussion Club « New Technology in Integrative Medicine and Biology» «Stress and extreme conditions» //Bangkok-Pattaya, Thailand, 1-13 march, 2006.- Р. 84.-0,04 п.л.,- личный вклад 65%.

9. Гуськов Е.П., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н., Шкурат Т.П. Устойчивость к окислительному стрессу у предадаптированных животных и их потомков. «Открытое образование» Международная конференция и дискуссионный научный клуб: Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT + M&E' 2006» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, июнь 2006. -С. 427-429.- 0,17 п.л.,- личный вклад 90%.

10. Волосовцова Г.И. Антиоксидантный статус потомков крыс предадаптированных к окислительному стрессу. Тез. докл. Научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)».Ростов н/Д., 2006.-С. 167.-0,04 л.,-личный вклад 100%.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АО - антиоксиданты

АФК - активные формы кислорода

АХр - аберрации хромосом

ГБО - гипербарическая оксигенация

ДК - диеновые конъюгаты

К - контрольные животные

МДА - малоновый диальдегид

МПа - мегапаскаль (в международной системе единиц давления принят паскаль (Па); I Па=1,02x10^-5 ат =2,02x10⁵ ати; I ат (атмосфера техническая)-0,98x 10⁵; I ати(атмосфера избыточная) = 1,98x10⁵)

МЭ - мембраны эритроцитов

ПА - предадаптированные животные

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксид дисмутаза

СПА - суммарная пероксидазная активность

СРП - свободно радикальные процессы

ХЛ - хемилюминесценция

ЦП - церулоплазмин

ШО - шиффовые основания

Н - высота быстрой вспышки ХЛ

Sm - светосумма ХЛ

Размещено на Allbest.ru

...