Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Активность нейтральных протеаз в тканях животных при зимней спячке и гипотермии

Абасова Миясат Магомедрасуловна

Ростов-на-Дону 2009

Работа выполнена на кафедре биохимии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Дагестанский государственный университет».

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Нурмагомедова Паризат Мусалаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, гл.н.с.

Друккер Нина Александровна

доктор биологических наук, профессор

Волжина Надежда Григорьевна

Ведущая организация: Ростовский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится «17» ноября 2009 г. в 10.00 час. на заседании диссертационного совета Д.212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, ауд. 203).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «___»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.С. Колмакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что у гипотермированных животных, как и скорость метаболизма снижается по мере понижения температуры тела (Kataoka, Yanase, 1998). Наиболее уникальной среди различных типов гипотермии является зимняя спячка (Эмирбеков, Львова, 1985), в частности, в связи с тем, что температурный диапазон активности биохимических реакций зимоспящих животных более широкий (от 0 до 38°С) относительно гомойотермных (Эмирбеков, Львова, 1985; Storey, Storey, 2000; Geiser, 2004). Изменения, вызываемые гипотермией, обнаруживаются во всех органах, которые при этом по-разному реагируют на глубину и скорость охлаждения (Бернштейн, 1971; Рыжакова, 1997).

В отличие от гибернантов, у гомойотермных организмов при гипотермии угнетение процессов синтеза АТФ влечет за собой дефицит энергии, что замедляет транспорт Са2+ из цитозоля в среду и нарушает метаболизм клетки (Hochachka, Somero, 2002). Даже незначительное (с 10-8 М в норме до 10-6 М) повышение содержания Са2+ в цитозоле приводит к активации различных протеолитических и липолитических ферментов в клетке, вследствие чего начинают разрушаться клеточные мембраны (Иванов и др., 1999). Поэтому истощение энергетического субстрата в клетке гомойотермных организмов часто влечет за собой гибель.

Тем не менее, изучение эффектов гипотермии на функциональное состояние гомойотермных организмов является актуальным, т.к. позволяет изучить функциональные основы регуляции жизнедеятельности. Так, рядом авторов доказана положительная роль гипобиоза в лечении сепсиса, вирусных заболеваний, в невосприимчивости к смертельным дозам бактериальных и химических ядов, а также ионизирующего излучения, сохранении жизни тяжелообожженным, а также пострадавшим с обширными размозжениями и сдавлениями тканей, в возможности проведения операции в самых опасных зонах, например, в глубинах мозга, на многих органах и тканях одновременно, лечении опухолей. В настоящее время искусственная гипотермия с охлаждением тела до 20-24°С уже находит применение в хирургии при операциях на сердце и центральной нервной системы. Она значительно снижает обмен веществ в головном мозге, и, следовательно, уменьшает потребность органов и тканей в кислороде. Поэтому мозг в таких условиях способен переносить более длительное обескровливание (до 15-20 мин при 25-28°С) (Sakurai et al., 2005).

Проблема адаптации животных и человека к низким температурам является актуальной также и в связи с все большим проникновением человека в полярные районы Земли и освоением природных ресурсов Севера и Сибири (Мешалкин, Верещагин, 1985).

Коренным отличием зимоспящих от незимоспящих животных является появление «фактора спячки» у зимоспящих в период спячки или непосредственно перед ней. Этот «фактор» выделен и уже применен в эксперименте: незимоспящие после введения этого «фактора» становились «зимоспящими» и переносили без каких-либо последствий такие нагрузки (например, длительное и глубокое охлаждение), которые в 100% случаев в обычном состоянии оканчивались гибелью животных. Поскольку данное вещество, очевидно, белковой природы, актуальным является исследование изменения активности протеолитических ферментов в разных тканях гомойотермных и гетеротермных животных, подвергнутых глубокой гипотермии, а также сопоставление активности этих ферментов с другими биохимическими показателями, включающимися в адаптацию к низким температурам.

В связи с этим, целью данной работы явилось сравнительное исследование активности нейтральных протеаз в тканях гомойо- и гетеротермных животных в динамике зимней спячки, последующего самосогревания после индуцированного пробуждения и гипотермии.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

Исследовать автолитическую активность в мозге, сердце и сыворотке крови сусликов в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении, а также автолитическую активность у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.

Изучить состояние аминокислотных медиаторных систем в мозгу и крови в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии. спячка мозг гипотермия аминокислотный

Исследовать активность глицилглицин-дипептидазы мозга в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.

Исследовать активность Са2+-зависимых нейтральных протеаз тканей в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.

Исследовать общую активность нейтральных протеаз тканей в динамике зимней спячки и на этапах самосогревания при индуцированном пробуждении сусликов, а также у животных, подвергнутых глубокой гипотермии и самопроизвольному самосогреванию до уровня нормотермии.

Основные положения, выносимые на защиту.

Циклические изменения активности протеолитических ферментов в мозгу и сердце сусликов в период подготовки к зимней спячке являются одним из факторов, влияющих на перестройку метаболических процессов с Са2+-зависимых на независимые от уровня Са2+. Двум пикам повышения активности Са2+-зависимых нейтральных протеаз (в сентябре и ноябре) соответствует увеличение активности глицилглициновой-дипептидазы и снижение содержания аминокислотных медиаторов в коре больших полушарий и, особенно, в стволовых структурах мозга гетеротермных животных.

Температурная зависимость автолитической активности тканеспецифична: при повышении температуры тела увеличивается активность автолитических ферментов относительно 2-го месяца спячки сначала в сыворотке крови (10єС), а затем в коре больших полушарий (20єС), стволовых структурах мозга (25єС) и сердце (30єС). Активность нейтральных протеаз начинает повышаться в тканях сусликов при менее высоких температурах по сравнению с автолитической активностью.

В условиях принудительной гипотермии в тканях крыс и сусликов происходит понижение активности протеолитических ферментов и содержания ГАМК и глутамата в мозгу. Пролонгирование гипотермии способствует разнонаправленной перестройке метаболизма в тканях сусликов и крыс: у сусликов снижается значимость Са2+-зависимых процессов, тогда как у крыс, напротив, возрастает. После самопроизвольного самосогревания уровень медиаторов в структурах мозга сусликов соответствует контролю, а у крыс наблюдается истощение ГАМК и глутамата.

Научная новизна.

Впервые установлено, что перед впадением в зимнюю спячку у сусликов происходят циклические изменения протеолитической активности ферментов и содержания ГАМК и глутамата в тканях, что является одним из преадаптационных механизмов гибернации.

Впервые показано, что в период зимней спячки в мозгу и сердце сусликов перестройка метаболизма идет путем снижения значимости Са2+-зависимых процессов на процессы независимые от уровня Са2+.

Впервые установлена последовательность активации протеолитических ферментов в разных тканях гетеротермных животных на этапах самосогревания после индуцированного пробуждения.

Впервые показано, что пролонгирование глубокой гипотермии в течение 2-х часов способствует повышению активности протеолитических ферментов в тканях гомойотермных и гетеротермных животных до уровня умеренной гипотермии.

Теоретическая и практическая значимость. Изучение метаболизма при искусственном и естественном охлаждении организма в сравнительном аспекте может приблизить к пониманию общих механизмов резистентности гомойотермных животных к низкой температуре тела, а также имеет значение для понимания механизмов формирования патогенеза холодового повреждения. Решение указанных теоретических проблем имеет практическое значение при использовании метода гипотермии в медицинской практике.

Материалы, полученные при выполнении диссертационной работы, используются при чтении курса «Энзимология», спецкурса «Кинетика ферментативных реакций», в учебном процессе и на практических занятиях студентов по биохимии Дагестанского государственного университета и филиала ЮФУ в г.Махачкале, в научно-исследовательских работах.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), X Республиканской научно-практической конференции (Махачкала, 2005), Международной научной конференции (Махачкала, 2006), 10-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2006), V-й Международной научно-практической конференции (Тамбов, 2007), совместном заседании кафедры биохимии и биофизики с НИИ биологии ДГУ (3 февраля 2009, протокол №7), заседании кафедры биохимии и микробиологии Южного Федерального университета (21 марта 2009).

Публикации. По данной диссертационной работе опубликовано 7 печатных работ, в том числе в журналах рекомендуемых ВАК РФ - 2 статьи, объемом 0.63 п.л., личный вклад 45%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 218 источников, из них 88 отечественных и 130 иностранных авторов. Работа содержит 20 таблиц и 26 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 85 малых сусликах (Citellus pigmaeus Pallas) массой 200-250 г, являющихся типичными представителями зимоспящих животных (Калабухов, 1985), и 40 белых беспородных крысах - самцах, весом 180-200 г. Сусликов отлавливали в районе Буйнакского перевала (Республика Дагестан) и до наступления холодов содержали в условиях вивария на смешанном растительно-зерновом рационе. Крыс содержали в условиях вивария при температуре +18 - +20°С на стандартном рационе питания. Для избегания сезонных колебаний метаболизма и регуляции функций, опыты проводили в зимние месяцы: декабрь - февраль (Егулова и соавт., 1977, Тендитная, 1977).

Показатели сусликов исследовали в следующие периоды зимней спячки и на следующих этапах самосогревания:

1. Бодрствующие, в июле-августе (нормотермия 38°С); 2. Бодрствующие, в сентябре (нормотермия 38°С); 3. Перед спячкой, начало октября (tт°=16-19°С); 4. Начало спячки, ноябрь (tт°=10-13°С); 5. Через 2 месяца спячки (tт°=3-4°С); 6. Через 3 месяца спячки, начало февраля (tт°=4-5°С); 7. Перед пробуждением, март (tт°=6-7°С); 8. Самосогревание до 10°С, 20°С, 25°С, 30°С и 38°С.

Показатели сусликов и крыс исследовали, подвергая животных искусственной гипотермии в следующих вариантах эксперимента:

1. Нормотермия (контроль); 2. Глубокая гипотермия 20-19°С; 3. Гипотермия 30-33°С; 4. Пролонгирование гипотермии (20°С) в течение 2 часов; 5. Нормотермия после самосогревания.

Контрольную группу составляли животные, содержащиеся в условиях вивария и не подвергшиеся охлаждению. Животных декапитировали, извлекали мозг (кору больших полушарий (кора БП) и стволовые структуры (СтС)), сердце и кровь.

Условия гибернации. Сусликов отлавливали весной - летом методом залива нор. После снижения температуры воздуха до +8-6єС животные укладывались в стеклянные баллоны с подготовленной подстилкой. Ежедневно проверяли активность животных методом «опилочной пробы», т.е. при засыпании покрывали их сверху опилками и судили об их активности по тому, стряхнуты они или нет. В торпидном состоянии сусликов исследовали в середине баута (на 3-4 сутки после очередного вхождения в баут спячки). Для изучения процессов, происходящих в ходе пробуждения сусликов, животных через два месяца после начала гибернации, в середине баута спячки помещали в холодильник для достижения температуры тела 2,5єС. После этого их переносили в помещение с температурой 25єС для самосогревания. Для экспериментов брали сусликов по достижении температуры тела 10, 20, 25, 30 и 38єС. Температуру тела животных измеряли в прямой кишке через каждые 10-15 мин. Исследовали также группу сусликов, не спавших зимой, а содержащихся в условиях вивария на полном рационе и в отапливаемом помещении.

Условия искусственной гипотермии. Гипотермию проводили в холодовой камере, в «рубашке» которой циркулировала вода, охлажденная до 8°С. Температура тела животного достигала 33-30°С через 15-20 минут, а 20-19°С - через 50-60 минут, и эта температура поддерживалась в течение двух часов. Температуру тела животных измеряли ректально ртутным термометром.

Методы биохимического анализа. Нейромедиаторные аминокислоты, ГАМК и глутамат в сыворотке крови и отделах мозга определяли методом низковольтного электрофореза на бумаге (Tapia, 1983). Автолитическую активность (АА) и Са2+-зависимую активность нейтральных протеаз (Са2+-ЗНП) определяли по методу Baundry (1981) и Nilsson, Karlsson (1986). Активность глицилглицин-дипептидазы (ГГД) в мозге животных определяли нингидриновым методом Li и Takakhashi с модификациями (Рева и др., 1982). Общую активность нейтральных протеаз (ОАНП) определяли модифицированным методом Lowry (Алейникова, Рубцова, 1988).

Полученные данные подвергнуты вариационно-статистической обработке по методу малой выборки (Кокунин, 1975). Для оценки статистических различий использовали t-критерий Стьюдента. При Р?0,05 различия оценивались как достоверные.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Автолитическая активность в тканях сусликов в динамике зимней спячки и при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. Гибернация сопровождается экстремальными изменениями физиолого-биохимических параметров организма. Температура тела, уровень метаболизма, сердечный ритм и другие параметры деятельности организма падают во время зимней спячки до уровня, который может быть летальным для гомойотермов, но не для гибернантов. Восстановление функций до нормального уровня происходит во время пробуждения со скоростью, которая может затрагивать клеточные и системные регуляторные пути, типичные для негибернантов (Carey et al., 2000; Terleky, Dice, 1993). В связи с этим, результаты, полученные на зимоспящих, могут быть использованы и для выяснения механизмов терморегуляции у гомойотермных организмов.

Согласно результатам исследования, у бодрствующих сусликов в сентябре происходит повышение АА в стволовых структурах на 41%, тогда как в сердце - снижение на 44%. В октябре в коре БП и сердце выявлено понижение АА, соответственно, на 34% и 19%, а в СтС - возрастание на 19% по сравнению с июлем. Вероятно, изменения АА перед впадением в зимнюю спячку в СтС и сердце генетически обусловлены и являются признаком подготовки к снижению метаболических процессов у сусликов (табл.).

Таблица

Автолитическая активность протеаз (Еопт) в динамике зимней спячки сусликов, (M±m)

Условные обозначения: * - достоверные изменения (p<0,05) по сравнению со значением показателя в июле (нормотермия 38°С)

В ноябре наблюдали понижение АА в коре БП и сердце на 41%, а в сыворотке крови - на 21% относительно июля. Известно, что биохимические процессы, работа органов и систем организма гибернантов не тормозятся, а перестраиваются так, что даже при очень низкой температуре тела поддерживается определенный гомеостаз (Карманова, 1995; Woods, Storey, 2004). При этом АА на 2-й, 3-й месяцы спячки и перед пробуждением была значительно ниже уровня июля.

Перед пробуждением понижение АА было менее значимым, чем на 2-3-й месяцы спячки сусликов. В коре БП, СтС, сердце и сыворотке крови снижение АА составило, соответственно 44%, 48% 28% и 32% относительно контроля (июль).

В условиях самосогревания наблюдали повышение АА в структурах мозга, сердце и сыворотке крови. Нужно отметить, что при повышении температуры животного до 30єС АА резко повысилась в сердце по сравнению с показателем при температуре тела животного 25єС и достигла уровня контроля.

При самосогревании животных до температуры тела 38єС АА стала выше, чем уровень 2-го месяца спячки в коре БП и СтС в 1,4 раза (p<0,01), в сердце - в 3 раза (p<0,001) и сыворотке крови - в 2,4 раза (p<0,01). Значения АА в мозге и сыворотке крови несколько превышали уровень июля.

В условиях принудительной гипотермии (20°С) в мозгу сусликов не выявлено изменений АА по сравнению с бодрствующими животными (июль). В то же время, в сердце наблюдали понижение АА в сердце на 20%, а в сыворотке крови - повышение на 39%. После самопроизвольного самосогревания в СтС и сыворотке крови сусликов установлено возрастание АА по сравнению с бодрствующими животными.

Обращает на себя внимание, что значения АА протеаз в коре БП и сыворотки крови сусликов в условиях искусственной гипотермии были выше уровня октября, когда температура тела животных снижается примерно до 16-19єС. То есть, искусственно созданное изменение температурного режима в организме гетеротермных животных способствует повышению АА отдельных тканей сусликов. Вероятно, более значительная активация лизосомальных ферментов при принудительной гипотермии отражает менее эффективное приспособление к гипотермии сусликов, что может быть связано с отсутствием преадаптационного периода, наблюдаемого перед зимней спячкой.

У крыс в условиях принудительной гипотермии в коре БП, СтС, сердце и сыворотке крови выявлено значительное возрастание АА, соответственно, на 48%, 25%, 15% и 83% (p<0,01). То есть, в отличие от гетеротермных животных, у которых в этих же условиях наблюдали повышение автолиза лишь в сыворотке крови, а в сердце, напротив, происходило снижение АА, у крыс во всех исследованных тканях установлено возрастание автолиза.

После самопроизвольного самосогревания происходило дальнейшее повышение АА в коре БП (на 90%), СтС (на 75%), сердце (на 47%) и сыворотке крови (в 1,6 раза, p<0,01) крыс относительно контрольных значений.

Таким образом, приспособление к зимней спячке у сусликов реализуется через генетически детерминированные преадаптационные изменения АА в СтС и сердце. При этом в условиях искусственной глубокой гипотермии в тканях сусликов наблюдаются менее значимые отклонения АА по сравнению с крысами.

Изменение содержания ГАМК и глутамата в тканях сусликов в динамике зимней спячки и при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. Исследование состояния нейромедиаторных систем, участвующих в процессе гибернации, является актуальным во взаимосвязи с изучением протеолитической активности ферментов, поскольку результаты данного исследования могут дать ответ на вопрос о роли Са2+-зависимых процессов нейромедиаторов у гомойотермных и гетеротермных организмов в адаптации к холодовому воздействию.

Установлено, что за два месяца до зимней спячки (в сентябре) значимые изменения нейромедиаторов происходят в СтС сусликов: снижаются уровни ГАМК (на 51%) и глутамата (на 54%) относительно контроля (июль). В октябре, напротив, в СтС отмечали накопление ГАМК (на 32%) по сравнению с июлем. Содержание глутамата в СтС и плазме крови, а также ГАМК и глутамата в коре БП не изменялось относительно контроля. В начале зимней спячки (ноябрь), установлено значительное понижение уровня ГАМК (на 59%) и глутамата (на 67%) в СтС, а также глутамата в коре БП (на 23%) и плазме крови (на 32%) по сравнению с июлем. На 2-3-й месяцы спячки, а также перед выходом из зимней спячки в мозге и плазме крови сусликов наблюдали истощение аминокислотных медиаторов.

Перед пробуждением в коре БП сусликов уровни ГАМК и глутамата оставались ниже контроля, соответственно, на 30% и 47%. В СтС было понижено лишь содержание глутамата (на 71%), уровень ГАМК соответствовал контролю. В плазме крови содержание глутамата было ниже уровня июля на 55%.

Таким образом, в процессе подготовке к зимней спячке в мозге происходят перестройки функционального состояния нейромедиаторных систем. Преимущественно изменения происходили в СтС, тогда как в коре БП значимые изменения в содержании медиаторов выявлены только в начале спячки.

На этапах самосогревания, по мере повышения температуры тела наблюдали возрастание содержания медиаторов в тканях животных по сравнению со значениями на 2-й месяц спячки (tє=3-4°С). Так, при температуре тела 10єС в коре БП и СтС сусликов выявлено накопление ГАМК, соответственно, на 31% и 38%, а в плазме крови установлено снижение уровня глутамата на 29%. При 20єС накопление ГАМК в коре БП и СтС составило 64% и 91%, а содержания глутамата в этих же структурах мозга -27% и 68%. При дальнейшем повышении температуры тела изменения уровня ГАМК относительно содержания при 20єС тела животных не выявлено. Очевидно, ГАМКергическая система коры БП сусликов работает на одном функциональном уровне при температуре тела от 20єС до 38єС. Уровень глутамата в коре СтС нарастал вплоть до момента, когда температура тела сусликов не достигла 30єС. Такое неравномерное возрастание содержания ГАМК и глутамата в коре БП при повышении температуры тела животных может свидетельствовать о том, что их изменение связано не только с процессами возбуждения и торможения в ЦНС, но и другими реакциями, которые предположительно связаны с энергетическим обеспечением нервных клеток.

Интересно отметить, что перед зимней спячкой у сусликов наблюдали два пика снижения содержания данных медиаторов в СтС (в сентябре и ноябре), что может отражать преадаптационные перестройки метаболизма нервной ткани, способствующие в период спячки формированию высокой устойчивости к снижению энергообеспечения нейрона. При температуре тела 30є и 38єС в плазме крови содержание глутамата превышало его уровень во 2-й месяц спячки на 24% и на 29%, соответственно.

В условиях снижения температуры тела до 20 єС в коре БП сусликов происходило повышение содержания глутамата на 48%, а в СтС снижение уровней ГАМК на 28% и глутамата - на 27%. В плазме крови выявлено понижение содержания глутамата на 15% (p<0,05) относительно контроля. После самосогревания у сусликов содержание ГАМК было снижено в коре БП на 26% и СтС - на 21%, а также понижен уровень глутамата в СтС на 32% и плазме крови - на 40% относительно контроля. Таким образом, в условиях принудительной гипотермии у сусликов сохранилась направленность изменений в содержании медиаторов: при снижении температуры тела происходило снижение уровней медиаторов в мозге, а после самопроизвольного самосогревания - их возрастание.

В условиях глубокой гипотермии в коре БП крыс происходило снижение содержания ГАМК на 38% и возрастание уровня глутамата на 25%. В СтС отмечено снижение содержания ГАМК на 46%, тогда как содержание глутамата оставалось на уровне контроля. В плазме крови крыс при гипотермии выявлено повышение содержания глутамата на 77%.

В условиях самосогревания после гипотермии у крыс уровни ГАМК и глутамата в коре БП были ниже контроля, соответственно, на 57% и 31%; в СтС - на 57% и 25%. В плазме крови уровень глутамата был снижен на 23% относительно контрольной группы крыс.

Таким образом, в условиях гипотермии наблюдали истощение тормозного медиатора в мозгу одновременно с накоплением глутамата в коре БП и плазме крови крыс. Нарушение баланса тормозного и возбуждающего медиаторов может способствовать развитию окислительного стресса в организме крыс при глубокой гипотермии.

Изменение содержания ГАМК в структурах мозга гомойотермных и гетеротермных животных также объясняет более высокую устойчивость сусликов к гипотермии (рис. 1). Известно, что холодовые терморецепторы кожи посылают информацию о температуре тела в дорсальные рога спинного мозга и через паравентрикулярное ядро, а именно через ГАМКергические интернейроны, регулируют чувствительность нейронов преоптической области гипоталамуса (Shaun et al., 2008). Действительно, в структурах мозга сусликов после гипотермии и самосогревания выявлены менее значительные изменение уровня ГАМК относительно крыс.

Это может свидетельствовать о том, что ГАМКергические интернейроны гетеротермных животных при снижении температуры тела находятся в более активном состоянии (по сравнению с гомойотермными), их влияние проявляется в снижении чувствительности нейронов преоптической области гипоталамуса, которые, в свою очередь, регулируют периферические процессы термогенеза.

Рис. 1. Динамика содержания гаммааминомаслянной кислоты и глутамата в мозге и плазме крови сусликов и крыс в условиях глубокой гипотермии и после самосогревания 1 - кора БП, ГАМК; 2 - кора БП, глутамат; 3 - стволовые структуры, ГАМК; 4 - стволовые структуры, глутамат; 5 - плазма крови, глутамат. * - достоверные отличия (p<0,05)

Активность ГГД в мозгу сусликов в динамике зимней спячки и при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. Особую группу ферментов, осуществляющих заключительные стадии гидролиза белков, составляют дипептидазы, относящиеся к экзогидролазам. Одним из представителей данной группы ферментов, активность которого максимальна при нейтральном значении рН, является глицилглицин-дипептидаза (3.4.13.1), обладающий строгой субстратной специфичностью (Цыперович, Авдеев, 1978). Конечным продуктом работы ГГД является глицин, входящий в состав многих белков и биологически активных соединений (Gomeza et al., 2003), а также участвующий в терморегуляции.

Согласно полученным результатам исследования активности ГГД было установлено, что в сентябре в мозгу бодрствующих сусликов отмечено изменение активности данного фермента только в СтС (повышается на 66%, p<0,05). В то же время, в октябре наблюдали снижение активности ГГД в коре БП (на 26%) и СтС (на 80%) по сравнению с июлем. Начало спячки (ноябрь) сопровождалось возрастанием активности ГГД в коре БП на 23% и СтС - в 1,2 раза (p<0,01). На 2-й и 3-й месяц спячки выявлено снижение активности ГГД в мозгу сусликов. Перед пробуждением в мозгу сусликов активность фермента оставалась ниже контроля, но была увеличена по сравнению с 2-3-м месяцами спячки. В том числе, в коре БП активность ГГД была ниже контроля на 39%, а в СтС - на 43%.

На этапах самосогревания выявлено повышение активности ГГД в коре БП при температуре тела 10єС в 1,2 раза (p<0,01), при температуре тела 20єС - в 1,4 раза (p<0,01). Дальнейшее повышение температуры тела сопровождалось возрастанием активности данного фермента в коре БП, тогда как в стволовых структурах мозга значимое изменение относительно уровня активности ГГД на 2-й месяц спячки установлено лишь при температуре тела 25єС (на 17%). При 30 и 38єС активность ГГД в СтС была выше уровня 2-го месяца спячки, соответственно, на 81% и 108% (p<0,01).

Таким образом, при подготовке к зимней спячке в стволовых структурах мозга сусликов установлено два пика активности глицилглициновой-дипептидазы, приходящихся на сентябрь и ноябрь, в условиях зимней спячки активность фермента резко понижается, что, вероятно, связано с активацией АА, а, следовательно, закислением среды. На этапах самосогревания она повышается до контрольного уровня (июль). При этом возрастание активности ГГД в коре БП сусликов происходит уже при повышении температуры тела до 10єС, тогда как в СтС - до 25єС.

В условиях принудительной гипотермии в коре БП и СтС сусликов происходило снижение активности ГГД, соответственно, на 32% и 35% относительно уровня контроля (бодрствующие суслики). После самосогревания в коре БП и СтС установлено снижение активности ГГД, соответственно, на 20% и 31%.

Установлено, что после индуцируемого пробуждения и самосогревания сусликов при температуре тела 38єС активность ГГД оказалась выше относительно уровня, характерного для животных, подвергнутых самосогреванию после искусственной глубокой гипотермии. При этом у сусликов, перенесших искусственную гипотермию, уровень активности ГГД соответствует значению активности фермента у животных, находящихся на этапах самосогревания после индуцированного пробуждения в среднем при температуре тела 25-30єС. Это может свидетельствовать о более значительном закислении среды в мозговой ткани (при одинаковой температуре тела) сусликов, перенесших искусственную глубокую гипотермию, относительно животных, находящихся в естественной гипотермии и индуцированном самосогревании.

При исследовании активности ГГД в мозгу крыс установлено, что при снижении температуры тела до 20єС в коре БП происходит снижение активности фермента на 50%, а в СтС - на 62%. После самосогревания снижалась активность ГГД в коре БП крыс на 63%, а в СтС мозга - на 75% по сравнению с контролем.

В настоящее время все большее внимание уделяется проблеме влияния регуляторов пептидной природы на состояние классических медиаторных систем, через которые реализуются адаптивные перестройки метаболизма. Это могут быть и нейромодуляторы, и рецепторные структуры, и белки теплового шока и т.д. Для образования этих регуляторов существует два основных пути: активация ранних генов либо ограниченный протеолиз. Далее представлены результаты исследования активности Са2+-зависимых нейтральных протеаз в разных тканях гомойотермных и гетеротермных животных.

Активность Са2+-зависимых нейтральных протеаз в тканях сусликов в динамике зимней спячки и при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. В клетках животных и человека обнаружены протеолитические ферменты с оптимумом действия в зоне нейтральных значений рН. К ним относят Са2+-ЗНП и различные металлопротеазы, субстратами которых являются белки цитоскелета и ядерного матрикса, вещество Р, опиоидные пептиды, нейромедиаторы, протеинкиназа С, фосфолипазы и др. (Гусев, 1998). Эти ферменты играют важную роль в адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям окружающей среды, в осуществлении защитных функций организма, в том числе, при зимней спячке (Cuninghaim, 1987; Kortner, Geiser, 2000).

Согласно результатам исследования, в сентябре у бодрствующих сусликов относительно июля в коре БП и СтС происходит повышение активности Са2+-ЗНП, соответственно, на 79% и 92%, а в сердце и сыворотке крови - в 1,8 (p<0,01) и 1,2 раза (p<0,01). Учитывая, что в сентябре уже наступает сезон подготовки к зимней спячке, такое существенное повышение Са2+-ЗНП можно объяснить ревизией белкового состава тканей, а также появлением новых пептидов (Croall, Demartino, 1991; Chua et al., 2000), возможно, за счет реакций ограниченного протеолиза. То есть, в период, предшествующий зимней спячке, у животных происходит повышение активности Са2+-ЗНП в исследованных тканях, что может свидетельствовать о включении данных ферментов в подготовку к зимней спячке путем образования «факторов зимней спячки».

Перед спячкой в октябре месяце активность Са2+-ЗНП снижается в коре БП на 75% и СтС - на 59%, а в сердце и сыворотке крови возрастает, соответственно, в 2 (p<0,01) и 1,9 раза (p<0,01). Такая цикличность изменения активности Са2+-ЗНП в мозге может являться предварительной подготовкой к зимней спячке. В ноябре месяце, напротив, выявлено повышение активности Са2+-ЗНП в коре БП на 40%, СтС и сердце - в 1,3 раза (p<0,01), сыворотке крови - на 92%. Вероятно, в ноябре активация Са2+-ЗНП падает, предшествуя снижению практически до нуля, наблюдаемому в условиях спячки.

Согласно данным литературы, активность протеиназ в 1-ый месяц зимней спячки падает до нуля, поскольку в этот период в головном мозгу происходит подавление синтеза и распада белков (Жегунов и др., 1993), что связано с необходимостью экономить энергетические ресурсы, когда уменьшается скорость кровотока, содержание субстратов и потребление кислорода (Frerichs et al., 1998; Storey, 2004).

Через 2 месяца спячки активность Са2+-ЗНП остается сниженной относительно контроля в коре БП на 78% и СтС - на 87% (p<0,01), тогда как в сердце, напротив, повышена в 2,3 раза (p<0,001) относительно уровня при бодрствовании сусликов. На 3-й месяц спячки активность Са2+-ЗНП повышается в коре БП на 58%, СтС - на 26%, а в сердце остается повышенной в 2,5 раза (p<0,01) относительно контроля.

Выход из зимней спячки готовится заранее. Еще в состоянии гибернации в нейронах гиппокампа активным образом идет синтез, накопление и выход в цитоплазму РНК, резко повышается синтез белка (Гордон и др., 1987). Усиленный синтез в мозгу белков в первый период после пробуждения от зимней спячки носит репаративный характер и связан с активацией всех жизненных процессов в организме, а также с необходимостью восполнить количество белков, содержание которых было уменьшено при зимней спячке. Наряду с ускорением синтеза происходит и распад белковых молекул (Эмирбеков, Львова, 1985). Появляются также специфические белки, которых нет у активных и спящих животных. Таким образом, процесс пробуждения сусликов требует присутствия в клетках специфических белков, которые активно синтезируются (Жегунов, Микулинский, 1987; Жегунов и др., 1991).

Перед пробуждением у сусликов в коре больших полушарий выявлено повышение активности Са2+-ЗНП на 83%, а в СтС - на 63% относительно уровня бодрствующих животных. Наиболее значимо была повышена активность Са2+-ЗНП в сердце сусликов в данный период в 2,9 раза (p<0,01)).

Далее было проведено изучение активности Са2+-ЗНП в тканях животных после гипотермии до 20єС. Согласно полученным результатам, при самосогревании до 10єС в коре БП сусликов выявлено повышение активности Са2+-ЗНП в 2,7 раза (p<0,01), а в СтС - в 4 раза (p<0,001). Еще более значительное повышение активности фермента установлено при самосогревании до 20-25єС тела. В сыворотке крови при самосогревании до 20єС активность Са2+-ЗНП возросла на 29%, а при самосогревании до 25єС- до 27% относительно зимоспящих животных. При самосогревании до 30єС тела активность Са2+-ЗНП в коре БП была выше в 5 раз (p<0,001), а в СтС - в 9 раз (p<0,001). В сердце установлено возрастание активности ферментов на 27% по сравнению с гибернирующими животными. При самосогревании до 38єС активность Са2+-ЗНП повысилась по сравнению с уровнем зимней спячки: в коре БП - в 6,7 раз (p<0,001), а в СтС - почти в 10 раз (p<0,001) относительно зимоспящих сусликов.

Пробуждение после зимней спячки можно рассматривать как процесс адаптации к новым условиям, связанный с интенсификацией обмена веществ, возрастанием потребления кислорода и повышением температуры тела. На этапах пробуждения от зимней спячки в организме сусликов происходят изменения, направленные на поддержание метаболизма: в условиях гибернации в сердце наблюдали более значительное повышение активности Са2+-ЗНП относительно периода самосогревания; напротив, в мозгу, при пробуждении активация Са2+-ЗНП, вероятно, играет ведущую роль в адаптационных процессах к восстановлению температуры тела до уровня нормотермии. Усиленный синтез в мозгу белков, в особенности некоторых фракций, в первый период после пробуждения от зимней спячки носит репаративный характер и связан с активацией всех жизненных процессов в организме, а также с необходимостью восполнить количество белков, содержание которых было уменьшено при зимней спячке.

В условиях принудительной гипотермии при снижении температуры тела до 30-33°С в сердце сусликов отмечали снижение активности ферментов на 17% относительно контроля. Наиболее значительные изменения активности Са2+-ЗНП установлены при снижении температуры тела сусликов до 18-20°С: в коре БП - на 17%, в СтС - на 35% (p<0,05), сердце - на 32% и сыворотке крови - на 19% по сравнению с контролем. После пролонгирования глубокой гипотермии на 2 часа в мозгу активность Са2+-ЗНП была на уровне контроля, а в сердце и сыворотке крови повышена. После самосогревания активность Са2+-ЗНП была выше, чем у контрольной группы животных, в сердце - на 44% и сыворотке крови - на 30%. Таким образом, в тканях сусликов при принудительной гипотермии происходят сходные по направленности изменения активности Са2+-зависимых протеаз, но менее выраженные, чем в естественных условиях (при впадении в спячку).

У гомойотермных животных при гипотермии 30-33°С в коре БП происходило снижение активности Са2+-ЗНП на 15%, в СтС - на 23%, в сердце - на 49% и сыворотке крови - на 28% относительно контроля (38єС). При гипотермии 18-20°С в коре БП и в СтС снижение активности Са2+-ЗНП составило 69%. Также наблюдали дальнейшее понижение активности Са2+-ЗНП в сердце (на 72%). В сыворотке крови крыс при данной температуре снижение активности протеаз составило 21% относительно контрольной группы животных.

После пролонгирования гипотермии на уровне 18-20°С в течение 2-х часов значимых различий активности Са2+-ЗНП в мозге от группы контроля не выявлено. В то же время, в сердце и сыворотке крови активность протеаз оставалась ниже, а после самосогревания до 38єС активность Са2+-ЗНП возросла в СтС на 19%, в сердце - на 28% и сыворотке крови - на 15% относительно контрольной группы крыс. Наблюдаемое повышение активности протеаз в СтС после самосогревания можно объяснить тем, что при умеренной активации Са2+-ЗНП, осуществляющих ограниченный протеолиз нейроспецифических белков цитоскелета нейронов (в том числе основного структурного компонента синаптосомальных мембран - фодрина), происходит демаскировка и увеличение количества NMDA-рецепторов глутамата, что способствует развитию гипервозбуждения. Дальнейшее увеличение свободного Са2+ и активация Са2+-ЗНП может стать причиной деструкции цитоскелета и последующей гибели нейронов (Менджерицкий и др., 1995). Поскольку активация Са2+-ЗНП происходит при увеличении концентрации ионов Са2+в примембранной области до 100 и более мкмоль, то полученные нами результаты позволяют предполагать ингибирование активности Са2+-АТФазы, с помощью которой осуществляется перемещение каждого иона Са2+ из цитозоля в межклеточную среду (Иванов и др., 1999).

Общая активность нейтральных протеаз в тканях сусликов в динамике зимней спячки, при глубокой гипотермии и самопроизвольном самосогревании сусликов и крыс. ОАНП в мозгу сусликов значительно повышается к сентябрю относительно июля. В коре БП возрастание ОАНП составило 79%, а в СтС - 91%. Наиболее значительное повышение ОАНП выявлено в сыворотке крови (в 1,2, р<0,01) и сердце (в 1,8 раза, р<0,01). Перед зимней спячкой отмечали некоторое понижение ОАНП как в коре БП (на 22%), так и в СтС (на 30%) относительно сентября. Но по сравнению с июлем активность ферментов оставалась выше. В сыворотке крови ОАНП в октябре была выше уровня июля почти в 2 раза (р<0,001), а сентября на 31%. В сердце ОАНП повысилась в 2 раза (р<0,01) относительно июля, а к началу зимней спячки ОАНП снижается.

К началу зимней спячки ОАНП снизилась в мозгу, но в сыворотке крови и сердце оставалась выше относительно июля. Так, в коре БП снижение ОАНП составило 61%, в СтС - 34%. В сыворотке крови ОАНП возросла на 92% относительно контроля. В сердце повышение ОАНП также было значительным по сравнению с июлем.

Наименьшие значение ОАНП в мозгу сусликов установлены на 2-й месяц спячки относительно июля. В коре БП ОАНП была снижена на 79%, а в СтС - на 73%. В сердце ОАНП была выше как относительно июля (в 2,4 раза), так и по сравнению ноябрем (начало зимней спячки) на 47%. Но уже на 3-й месяц спячки ОАНП возросла в коре БП на 57%, а в СтС - на 39% по сравнению с контролем. В сердце ОАНП была на уровне 2-о месяца спячки.

Как указывалось выше, выход из зимней спячки готовится заранее (Гордон и др., 1987). При пробуждении сусликов от зимней спячки в их тканях синтезируется большое количество белков, характерных для активных животных. Появляются также специфические белки, которых нет у активных и спящих животных. Интенсификацию синтеза белка в тканях пробужающихся сусликов можно связать с общей для всех клеток необходимостью восполнения потерянных и измененных во время зимней спячки функциональных и структурных белков или же заменой части энзимов на специфические изоформы, необходимые при данной температуре. Пробуждение животных после длительного состояния зимней спячки можно рассматривать как процесс адаптации к новым условиям, связанный с интенсификацией обмена веществ, возрастанием потребления кислорода и повышением температуры тела. Возможно, именно это вызвало повышение ОАНП во всех исследуемых тканях сусликов. Так, в коре БП возрастание активности этих ферментов составило 82%, в СтС - 83%, а в сердце ОАНП возросла по сравнению с июлем почти в 3 раза (р<0,01).

На этапах самосогревания при температуре тела 10єС повышение ОАНП происходило только в мозгу: коре БП - в 2,7 раза (р<0,01) и СтС - на 41% относительно 2-го месяца спячки. Повышение температуры тела до 20єС сопровождалось возрастанием ОАНП в коре БП в 5 раз (р<0,01), СтС - 2,5 раза (р<0,01), а также сердце -на 26%. Изменений ОАНП в сердце на последующих этапах самосогревания не происходило вплоть до возрастания температуры тела до 38єС. При возрастании температуры тела до 25єС и 30єС в коре БП сусликов наблюдали повышение ОАНП, соответственно, в 5,7 (р<0,01) и 5,5 раза (р<0,01), в СтС, соответственно, в 4,5 (р<0,01) и 4,7 раза (р<0,01) относительно спячки (tє=3-4°С). При самосогревании до нормотермии (38єС) повышение ОАНП обнаружено вновь лишь в мозгу по сравнению со 2-м месяцем спячки.

В условиях принудительной умеренной гипотермии (30-33°С) у сусликов происходило повышение ОАНП в СтС, сердце и сыворотке крови по сравнению с контролем. Наибольшие изменения ОАНП наблюдали в сердце и сыворотке крови, тогда как в коре БП при снижении температуры тела до 30-33°С не происходило изменения ОАНП. Вероятно, это может отражать тот факт, что при умеренной гипотермии метаболические изменения происходят, в первую очередь, в системе кислородообеспечения организма, а также терморегуляторных центрах. В условиях глубокой гипотермии снижение ОАНП происходило в мозгу: в коре БП на 46% и СтС - на 28%. В сердце и сыворотке крови наблюдали повышение ОАНП, соответственно, на 43% и 26% относительно уровня нормотермии.

Пролонгирование глубокой гипотермии на 2 часа способствовало резкому повышению общей активности нейтральных протеаз в исследуемых тканях сусликов. Нужно отметить, что в естественных условиях перед зимней спячкой, когда температура тела сусликов также достигает примерно 20єС, также наблюдали возрастание ОАНП, что свидетельствует об общем генетически детерминированном механизме изменения метаболических процессов при смене температурного режима у сусликов. После самосогревания в тканях сусликов ОАНП оставалась повышенной относительно контроля, хотя и не столь значительно, как в группе животных, которые перенесли пролонгированную гипотермию. А именно, восстановление температуры тела до 38єС сопровождалось увеличением ОАНП в коре БП на 58%, в сердце - почти в 3 раза (р<0,01) и сыворотке крови в 1,2 раза (p<0,01) по сравнению с контрольной группой сусликов.

Таким образом, резкое изменение температурного режима способствует хотя и сходным по направленности изменениям ОАНП в тканях гетеротермных животных, но не идентичным. Так, например, при более быстром восстановлении температуры тела сусликов после искусственной гипотермии до уровня нормотермии наблюдали повышение ОАНП в тканях животных (кроме СтС), что в естественных условиях не происходит. После индуцированного самосогревания сусликов, выходящих из зимней спячки, значения ОАНП в тканях животных близки к контрольным. Следовательно, резкие изменения во внешней среде влекут изменения, направленные на поддержание метаболизма при данном физиологическом состоянии.

В условиях гипотермии у крыс, как и у сусликов, наблюдали снижение ОАНП. При умеренной гипотермии (30-33°С) снижение ОАНП в коре БП составило 23%, в СтС - 29% относительно контроля. При глубокой гипотермии уменьшение происходило в коре БП на 72%, в СтС - на 75%, в сердце - на 88% и сыворотке крови на 40% по сравнению с контролем. При пролонгировании глубокой гипотермии ОАНП в мозгу, сердце и сыворотке крови гомойотермных животных соответствовала контрольным значениям. После самосогревания значимые изменения ОАНП установлены в сердце и сыворотке крови относительно контроля.

Таким образом, в результате проведенного исследования показаны различия формирования адаптационных перестроек отдельных звеньев метаболизма, между гомойотермными и гетеротермными животными, находящимися в условиях гипотермии. При снижении температуры тела в организме сусликов наблюдается замена Са2+-зависимых процессов более эволюционно древними реакциями, течение которых не зависит от уровня Са2+.

ВЫВОДЫ

В период подготовки к зимней спячке происходят циклические изменения активности нейтральных протеаз, в том числе, глицилглициновой-дипептидазы: в сентябре и ноябре наблюдается повышение, сменяющееся снижением их активности. Одновременно с повышением протеолитической активностью выявлено снижение содержания ГАМК и глутамата в мозгу сусликов. Преадаптационные изменения автолитической активности установлены в стволовых структурах и сердце.

В условиях зимней спячки протеолитическая активность, а также содержание аминокислотных медиаторов в тканях сусликов снижается, при этом метаболические процессы поддерживаются благодаря работе ферментативных систем, активность которых не зависит от уровня Са2+.

На этапах самосогревания после индуцированного пробуждения в мозгу сусликов происходит зависимое от температуры тела повышение уровня ГАМК и глутамата, а также протеолитической активности. Активность автолитических ферментов начинает повышаться при 10єС в сыворотке крови, при 20єС - в коре больших полушарий, при 25єС - в стволовых структурах, а при 30єС - в сердце сусликов. По мере повышения температуры тела происходит увеличение значимости Са2+-зависимых процессов до уровня, наблюдаемого при нормотермии.

При гипотермии и после самосогревания в мозгу сусликов наблюдается менее значимое снижение содержания ГАМК и глутамата, чем в структурах мозга крыс. Активность глицилглициновой-дипептидазы при любом температурном режиме выше в мозгу сусликов относительно крыс.

В условиях самосогревания после принудительной гипотермии повышение автолитической активности у сусликов происходит только в стволовых структурах и сердце, тогда как у крыс - во всех тканях. Снижение активности Са2+-зависимых протеаз у сусликов происходит при умеренной гипотермии в сыворотке крови, а при глубокой - в мозгу и сердце; у крыс при умеренной гипотермии - в сердце и сыворотке крови, при глубокой - в мозге и сердце.

При пролонгировании гипотермии и после самосогревания изменения активности Са2+-зависимых протеаз относительно контроля установлены только в сердце гомойотермных и гетеротермных животных. Общая активность нейтральных протеаз в тканях сусликов значительно повышалась в условиях пролонгирования гипотермии, тогда как у крыс оставалась ниже контрольных значения (за исключением стволовых структур).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ИЗДАНИЯХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ

1. Нурмагомедова П.М., Омарова М.М. Активность нейтральной протеазы в тканях и сыворотке крови гомойотермного организма при охлаждении // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Приложение. - 2006. - №11. - С.89-93. - 0.38 п.л., личный вклад 50%.

2. Эмирбеков Э.З., Нурмагомедова П.М., Абасова М.М. Изменение активности нейтральных протеаз в тканях суслика Citellus pigmaeus Pallas в динамике зимней спячки // Бюллетень экспер. биологии и медицины. - М., 2008. - № 9. - С. 278-280. - 0.25 п.л., личный вклад 40%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

3. Омарова М.М. Исследование нейтральной протеазы в тканях сусликов в динамике зимней спячки // «Ломоносов-2005». Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Москва, 2005. - С. 165-166. - 0.083 п.л., личный вклад 100%.

4. Омарова М.М. Внутриклеточный распад белков // Труды молодых ученых ДГУ. Естественные науки. - Махачкала, 2005. - С. 85-89. - 0.29 п.л., личный вклад 100%.