Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

амидированность и окислительные модификации белков тканей крыс и сывороточного альбумина при модельном и физиологическом старении

03.01.04 - биохимия

Дурканаева Ольга Анатольевна

Ростов-на-Дону

2012

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии факультета биологических наук Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» (г. Ростов-на-Дону).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Лукаш Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горошинская Ирина Александровна

(г. Ростов-на-Дону)

доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Друккер Нина Александровна

(г. Ростов-на-Дону)

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Институт биорегуляции
и геронтологии СЗО РАМН

(г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится «12» апреля 2012 г. в «13.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана (344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «____» марта 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.208.07,

кандидат биологических наук, с.н.с. Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Старение - это комплексный биологический процесс, связанный с прогрессивным снижением физиологических и биохимических функций индивидуальных тканей или органов. Старение характеризуется «тетрадой»: поражением мембран, инактивацией ферментов, нарушением клеточного деления и накоплением балластных полимеров, включая нуклеиновые кислоты, липиды и белки (Обухова, Эмануэль, 1983). Особое значение в процессе старения имеет окислительный стресс, так как он носит прогрессирующий и нарастающий характер. Согласно свободно-радикальной теории старения, нарушение биологического механизма ингибирования свободно-радикального окисления может быть пусковым фактором для развития различных возраст-ассоциированных патологий и процессов старения. Анализ тканевых повреждений показывает, что в условиях возрастного дисбаланса про- и антиоксидантных систем белки являются одной из первичных мишеней для окислительного стресса. Окисленные модифицированные белки вовлекают в последующие процессы липиды клеточных мембран, что приводит к необратимым повреждениям клетки (Болдырев, 2003).

В клетках активные кислородные метаболиты (АКМ) вызывают различные повреждения белковых молекул, такие как окисление аминокислотных остатков, образование белок-белковых сшивок, фрагментация молекул. Взаимодействие белков со свободными радикалами и активными формами кислорода (АФК) приводит к образованию гидроперекисей, альдегидов и других реакционных соединений. Присутствующие в клетках ферменты репарации белков (протеиназы, протеазы, пептидазы) расщепляют поврежденные молекулы до аминокислот и низкомолекулярных продуктов с целью их повторного использования или выведения из организма. Содержание окислено модифицированных белковых соединений в клетках, органах или целом организме представляет собой удобный показатель для оценки развития окислительного стресса (Зенков и др., 2003).

Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки аспарагина и глутамина действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson, 2001). Было показано, что амиды дикарбоновых аминокислот вовлечены в процесс старения. Изменение степени амидированности влечет за собой локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Белизи и др., 2001; Бибов и др., 2004; Назарова и др., 2005; Robinson, 2002). Можно предположить, что между генетически предопределенными посттрансляционными модификациями (ПТМ) и интенсивностью индуцированных окислительных процессов, участвующих в молекулярных механизмах развития старения, существуют сложные многосторонние связи.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление взаимосвязи окислительных модификаций и степени амидированности тканевых и индивидуальных белков в условиях физиологического и модельного старения.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучить динамику степени амидированности суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.).

2. Исследовать возрастную динамику окислительных модификаций суммарных белков по образованию карбонильных групп и уровню сульфгидрильных групп в различных тканях белых крыс.

3. Разработать модифицированный способ получения очищенного препарата сывороточного альбумина (СА) крыс.

4. Определить степень амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, содержанию сульфгидрильных групп, изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс.

5. Изучить динамику амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана бычьего сывороточного альбумина (БСА) сразу и при инкубации в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37С).

6. Исследовать влияние концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степени деструкции БСА по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана и электрофоретической гетерогенности.

7. Изучить влияние металл-катализируемых окислительных модификаций, индуцированных системой Фентона, на степень амидированности БСА.

Научная новизна работы: Впервые сопоставлена тканевая специфика степени амидированности и окислительных модификаций суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс разного постнатального возраста (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). Разработана новая, простая и экономичная модификация метода выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс. Впервые установлена зависимость степени амидированности сывороточного альбумина от условий индуцированного металл-катализируемого окисления в среде Фентона. Определены корреляционные связи между интенсивностью окислительных модификаций и степенью амидированности сывороточного альбумина в условиях физиологического и модельного старения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика степени амидированности и окислительной модификации суммарных белков при старении белых крыс индивидуальна для каждой из исследованных тканей.

2. Инкубация в среде Фентона изменяет в БСА не только уровень окислительной модификации, но и содержание амидных групп.

3. Старение БСА в условиях, моделирующих физиологические, приводит к изменению посттрансляционных модификаций и конформационным последствиям, сопоставимым с изменениями в СА крыс при их физиологическом старении.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярных механизмов, происходящих при старении белков как in vitro, так и in vivo.

В ходе старения животных наблюдается разнонаправленный характер изменений как степени амидированности, так и окислительных модификаций суммарных белков различных тканей крыс. Однако четкой зависимости между посттрансляционными модификациями суммарных белков различных тканей и их способностью к обновлению не выявлено.

В отличие от разнонаправленных динамик содержания амидных, карбонильных и сульфгидрильных групп в суммарных белках, отличающихся тканевой спецификой, посттрансляционные модификации индивидуального белка (сывороточного альбумина) имеют сходную картину как при физиологическом, так и при модельном старении.

Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между степенью амидированности и окислительными модификациями белков, выявляемые по содержанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о сопряжении спонтанных и индуцированных посттрансляционных модификаций, являющихся пусковым механизмом конформационных изменений белков, приводящих к нарушению их функциональной активности и накоплению во времени их аномальных, модифицированных форм.

Обнаруженная взаимосвязь между окислительной модификацией белка и степенью его амидированности имеет принципиальное значение, поскольку позволяет объяснить наблюдавшееся ранее увеличение амидированности белков в некоторых тканях при состояниях организма, сопряженных с окислительным стрессом.

Разработка модифицированного способа выделения высокоочищенного препарата сывороточного альбумина крыс позволяет упростить и сократить во времени базовый метод, не нанося ущерба степени чистота и гомогенности препарата.

Материалы, полученные в работе, используются на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета при чтении спецкурсов «Биология старения» и «Химия белка с основами биокатализа».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием, (Новосибирск, 2008); 8-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2008); Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2008); 3-й Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009); 9-м Международном симпозиуме «Биологические механизмы старения» (Харьков, 2010); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых. «Биология - Наука 21-го века» (Пущино, 2010); 2-й Международной конференции «Физико-химическая биология» (Новосибирск, 2011); Юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Общий объем публикаций составил 0,8 п.л., личный вклад - 57,3%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литература, включающего 97 отечественных и 114 зарубежных источников. Работа иллюстрирована
43 таблицами, 2 схемами и 52 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

амидированность белок постнатальный сывороточный

Исследование выполнено на базе лабораторий «Молекулярной биотехнологии» и «Экспериментальной биохимии» кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета.

Работа выполнена на 83 белых беспородных крысах - самцах в возрасте 2, 4, 16, 18, 20 и 24 месяцев. Животные содержались в условиях вивария на стандартном рационе, доступ к воде и пище был свободным. При обнаружении у крыс опухолевого роста или воспалительных процессов их исключали из опыта.

Общая схема эксперимента состояла из 4 этапов. На первом этапе работы определяли степени амидированности и окислительных модификаций (уровень карбонилирования и содержание SH-групп) в суммарных белках тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс на различных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.). На следующем этапе работы по степени амидированности, уровням карбонильных и сульфгидрильных групп, а также изменению собственной флуоресценции и флуоресценции остатков тирозина и триптофана высокоочищенного сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс были изучены молекулярные механизмы старения белковых структур in vivo. На третьем этапе исследовали влияния концентрации компонентов среды Фентона и времени инкубации на интенсивность окислительных модификаций и степень деструкции БСА (по образованию карбонильных групп, изменению собственной флуоресценции белка и остатков тирозина и триптофана, электрофоретической гетерогенности). На заключительном этапе работы анализировали динамики амидированности и окислительных модификаций по образованию карбонильных групп, уровню сульфгидрильных групп, изменению флуоресценции остатков тирозина и триптофана БСА сразу и при инкубации в стерильных условиях в течение 7, 14 и 28 суток в условиях, моделирующих физиологическое старение (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37С).

Выделение и очистку тканевых белков проводили методом Yoshino (1970) и Wherrett (1971) в модификации Н.В. Пушкиной (Шепотиновская, 1982). Количество белка в полученных препаратах определяли методом Lowry (1951) в модификации Schaterle (1973).

Выделение и хроматографическую очистку препаратов сывороточного альбумина молодых и старых крыс проводили методом Angal (1977), основанном на аффинном сродстве альбумина к триазиновому красителю (цибакроновому синему), иммобилизованному на агарозе, с некоторыми модификациями, включающими использование предварительного дробного высаливания сульфатом аммония.

Полученный сывороточный альбумин крыс идентифицировали с использованием электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) по Леймли (Laemmli, 1970).

Регистрировали спектры собственной флуоресценции при длинах волн возбуждения 275, 280 и 285 нм. Длины волн 275 нм и 285 нм соответствуют максимумам поглощения остатков тирозина (Тир) и триптофана (Трп), соответственно, а излучение с длиной волны 280 нм относится к области перекрывания спектров поглощения остатков Тир, Трп и фенилаланина (Фен). Окислительную модификацию тирозиновых остатков регистрировали по образованию битирозина, обладающего характерной голубой флуоресценцией при л возб 325 нм и лисп 415 нм. Окисление триптофановых остатков определяли по изменению флуоресценции, характерной для триптофана (л возб 295 нм и лисп 340нм).

Определение содержания карбонильных групп белков проводили спектро-фотометрическим динитрофенилгидразиновым методом (Дубинина, 1995).

Определение сульфгидрильных групп в белках осуществляли колориметрическим методом при помощи 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислоты (Веревкина, 1977).

Определение содержания амидных групп белков проводили флуорометрическим методом (Sugawara, 1981) в модификации (Шепотиновская, 1995), в основе которого лежит специфическая для аммиака флюоресценция, возникающая в результате его взаимодействия с ортофталевым альдегидом в присутствии дитиотреитола. О содержании амидных групп в белке судили по количеству выделенного аммиака после гидролиза препарата белка в 1 н. серной кислоте при 100С. В белках определяли суммарную амидированность (САГ), легкогидролизуемые (ЛАГ) и трудногидролизуемые (ТАГ) амидные группы (Гершенович, Кричевская, 1960).

При изучении «старения» белков in vitro материалом исследования являлся лиофилизированный препарат бычьего сывороточного альбумина фирмы «ДиаМ» (Россия), растворенный в физиологическом растворе (0,9% NaCl). Стерилизацию белковых препаратов (1 мг/мл) осуществляли с использованием бактериальных фильтров с внутренним диаметром пор 0,22 мкм («Schleicher Schьll», Германия), а затем добавляли мертиолят натрия в конечной концентрации 0,001%.

Для исследования посттрансляционных модификаций (биохимических свойств) препаратов альбумина in vitro («старение» препаратов альбумина) осуществляли их инкубации в термостате при 37С. На 7, 14 и 28 сутки инкубации в пробах проводилось определение степени амидированности и карбонилирования белка, содержания продуктов деструкции и электрофоретической гетерогенности фракционного состава препаратов, а также характера структурно-конформационных преобразований белковых молекул методом спектрофлуориметрии. В качестве контроля использовали замороженные препараты, хранившиеся при температуре -20С.

Для инициации металл-катализируемого окисления бычьего сывороточного альбумина использовали среду Фентона 3-х концентраций: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), Fe2+-ЭДТА комплекс, который готовили ex tempore, и Н2О2 (10-5мМ, 10-4мМ, 10-3мМ).

Для статистической обработки и анализа полученных результатов использовали лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Достоверность различий между опытными и контрольными группами оценивали по t-критерию Стьюдента (различия считали достоверными при p<0,05). Статистические взаимосвязи между показателями оценивались по коэффициенту корреляции (Гланц, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастные изменения содержания амидных, сульфгидрильных и карбонильных групп в суммарных белках разных тканей белых крыс. Были выявлены некоторые особенности накопления окисленных производных суммарных белков разных тканей в различных возрастных группах крыс в ходе их физиологического старения (Рис. 1). Исследованные ткани отличались митотической активностью и относились к группам постмитотических необратимых (сердечная и скелетная мускулатура, мозг) и обратимых (печень, селезенка, тестикулы) тканей.



Рис.1. Динамика содержания карбонильных групп в суммарных белках тканей крыс.

Обозначения: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05).

Была установлена четкая тканеспецифичная возрастная динамика прироста карбонильных производных суммарных белков во всех анализируемых тканях, за исключением тестикул, в которых отмечалось снижение кетопроизводных белков на 68,3% к началу пострепродуктивного периода. Наиболее выраженные изменения в обратимых постмитотических тканях были выявлены в печени и селезенке, в которых накопление карбонил-модифицированных белков составляло 1,5 и 4,5 раза, соответственно, тогда как в необратимых тканях онтогенетическое увеличение наблюдалось преимущественно в отношении миокарда в 2,3 раза. Возрастное изменение степени карбонильной модификации белков мозга носило более ровный характер и составило 34%.

В литературе описана различная динамика интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в разных органах и тканях животных при старении организма. Эти различия зависели от устойчивости систем ПОЛ и антирадикальной защиты конкретного органа (Анисимов и др., 1999; Хавинсон, Баринов, 2003; Bokov. et al., 2004; Halliwell, Gutteridge, 2007). В нашей лаборатории на тех же животных были получены результаты, свидетельствующие о возрастании интенсивности ПОЛ, выраженном в накоплении малонового диальдегида (МДА) в мозге, печени и плазме крови крыс в ходе их индивидуального развития (Бондаренко и др., 2011). Максимальное повышение содержания МДА имело место в мозге животных всех возрастных групп, что объясняется особенностями метаболизма данной ткани. В печени эти изменения были более разнородными и онтогенетическое накопление ТБК-активных продуктов отмечалось только начиная с 20-месячного возраста крыс.

Однако наблюдаемое нами статистически значимое накопление белковых карбонилов соответствовало более раннему возрастному периоду (16 мес.) животных, что позволило рассматривать окислительные модификации белков как первичный индикатор окислительного повреждения тканей.

Известно, что другим механизмом окислительного повреждения белков АКМ является окисление SH-содержащих аминокислотных остатков цистеина или метионина с последующим образованием тиолов, тиолятов, тиильных радикалов, дисульфидов, сульфеновых, сульфиновых и сульфоновых кислот. Эффективность окислительной модификации цистеиновых остатков определяется их низким потенциалом ионизации и в значительной степени зависит от микроокружения и структурной организации белковой молекулы. В условиях окислительного стресса действие АКМ на цистеиновые остатки в белках ведет к образованию нестабильной сульфеновой кислоты, которая может либо обратно восстанавливаться в цистеин, либо подвергаться более глубокому окислению до сульфиновой и сульфоновой кислот (Зенков, 2009).

Анализ сравнительно-онтогенетических исследований показал, что во всех тканях происходило снижение содержания сульфгидрильных групп к 24 месячному возрасту животных. Однако наблюдаемые изменения носили нелинейный характер. Это выражалось в предварительном увеличении содержания тиольных групп в миокарде, тестикулах и скелетных мышцах на 67,0, 38,7 и 59,4%, соответственно, в 4 месячном возрасте животных, которое сохранялось в скелетных мышцах вплоть до 16 месяцев (91,9%) (Рис. 2).

Рис. 2. Динамика содержания сульфгидрильных групп в суммарных белках тканей крыс.

Обозначения как на Рис. 1.

Нами была установлена отрицательная корреляция между содержанием карбонильных производных и количеством SH-групп в суммарных белках печени и селезенки с коэффициентами корреляции -0,98 и -0,74, соответственно. Онтогенетические изменения содержания сульфгидрильных и карбонильных групп в суммарных белках мозга также были противоположно направлены. Степень карбонилирования суммарных белков мозга старых крыс (24 мес.) составляла 34,5%, а снижение тиоловых групп - 36,1%.

Нами был обнаружен возрастной сдвиг в белках скелетных мышц и тестикул крыс в сторону увеличения суммарной амидированности (Рис. 3, 4). Отмечено, в среднем, 1,5-кратное повышение уровня САГ белков исследуемых тканей с преобладанием в их первичной структуре остатков глутамина над аспарагином.

Рис. 3. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках мышц крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 4. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках тестикул крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

В белках тканей сердца, печени и селезенки было выявлено снижение суммарной амидированности в 1,4, 2,3 и 1,8 раза, соответственно, преимущественно за счет фракции ТАГ. Статистически достоверных изменений во фракции ЛАГ обнаружено не было (Рис. 5, 6, 7). Полученные результаты, очевидно, свидетельствуют о преобладании трудно-обмениваемых белков в позднем онтогенезе животных.

Рис. 5. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках сердца крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 6. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках печени крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

При старении нервной ткани потеря суммарных амидных групп белков крыс на 13,4% осуществлялась за счет фракции ЛАГ, представленной в основном аспарагином, тогда как количество ТАГ оставалось неизменным (Рис. 8).

Таким образом, в ходе старения животных наблюдались разнонаправленные изменения как степени амидированности, так и окислительных модификаций суммарных белков различных тканей крыс. Однако следует отметить, что четкой зависимости между ПТМ суммарных белков различных тканей и их способностью к обновлению выявлено не было.

Рис. 7. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках селезенки крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 8. Динамика содержания амидных групп в суммарных белках мозга крыс при старении. Обозначения как на Рис. 1.

Из литературы известно, что изменения белков являются следствием возрастной специфики реализации генорегуляторных механизмов, приводящей к качественным и количественным изменениям протеомов тканей, что, в свою очередь, предопределяет возникновение метаболических дисфункций органов и организма в целом. Однако на сегодняшний день нет четкой ясности в понимании первопричин инициации онтогенетических изменений генорегуляторной активности. Накопленная информация о пусковых звеньях возрастного дисбаланса регуляции экспрессии генов множественна, разнокачественна и во многом противоречива (Резяпкин, 2009).

Для исследования молекулярных механизмов старения белковых структур in vivo и in vitro нами были изучены спонтанные и индуцированные ПТМ высокоочищенного сывороточного альбумина молодых и старых крыс, а также бычьего сывороточного альбумина в условиях, моделирующих физиологическое старение.

Изменения амидированности и окислительных модификаций сывороточного альбумина при модельном и физиологическом старении. Источником для выделения СА служила сыворотка крови молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс. Литературные источники содержат информацию об использовании «голубой» агарозы в качестве хроматографического носителя при выделении и очистке сывороточных альбуминов (Angal, 1977). Однако метод получения высокоочищенного сывороточного альбумина с использованием аффинного сорбента был модифицирован нами при содействии лаборатории химии пептидов Института белка РАН России и не является общепринятым.

Схема выделения и очистки СА в разработанной нами модификации включает дополнительное 2-х стадийное фракционирование сульфатом аммония, 2-х ступенчатое центрифугирование и 2 стадии хроматографии (Рис. 9).

Для осаждения глобулиновой фракции белков к сыворотке крови добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 50% насыщения. Осадки глобулиновой фракции отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течении 15 минут с последующей декантацией супернатанта. К супернатанту добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 80% и полученные суспензии хранили в холодильнике при температуре +40С.

Для очистки сывороточного альбумина использовали несколько типов хроматографических процессов. Работу выполняли на хроматографической системе Bio-Rad DuoFlow со спектрофотометрической ячейкой Quad-Tec (190-370 нм), кондуктометром и коллектором фракций («Bio-Rad», США). Предварительно освобождали альбуминовую фракцию от сульфата аммония методом гель-фильтрации (Рис. 10). В ходе очистки были выявлены различия в растворимости сывороточных альбуминов молодых и старых крыс.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Схема выделения сывороточного альбумина крыс.



Рис. 10. Хроматографический профиль гель-фильтрации фракции сывороточного альбумина крыс на колонке (1,56 см) c сефадексом G-10, со скоростью 100 мкл/мин. Обозначения:

- - - - фракция сывороточного альбумина (о.е. 280 нм);

____ - 0,9% раствор NaCl, pH 7,0 (электропроводность).

Используемый прием дает возможность значительно обогатить смесь белков сывороточным альбумином и частично подавить неспецифическую сорбцию других белков при последующей аффинной хроматографии на «голубой» агарозе (Рис. 11).



Рис. 11. Профиль солевой элюции сывороточного альбумина крыс на колонке (15 см) с «голубой» агарозой. Обозначения:

B, C - несвязавшиеся с аффинным сорбентом белковые фракции;

D - фракция сывороточного альбумина после начала элюции буфером «Б», содержащим 20 mM Трис-HCl, pH 7,4, в градиенте концентрации KCl (0,3 - 1,5 M).

Благодаря высокоспецифичной аффинной хроматографии процесс выделения удалось сократить во времени по сравнению с описанными в литературе методами (Коханов, 2009).

Чистота выделяемого препарата СА, оцененная по данным электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na, составляла свыше 97% (Рис. 12).



Рис. 12. Результат электрофоретического анализа в ПААГ в присутствии ДДС-Na продуктов хроматографического разделения альбуминовой фракции на колонке (1 x 5 см) с аффинным сорбентом «голубая агароза». Обозначения:

Led. - смесь рекомбинантных белков с известной молекулярной массой (кДа).

А - суммарная альбуминовая фракция сыворотки крови крыс после гельфильтрации на колонке с сефадексом G-10

B,C - не связавшиеся с аффинным сорбентом белковые фракции.

D - фракция сывороточного альбумина, соответствующая пику D хроматографического профиля.

Полученного количества белка оказалось достаточно для проведения анализа уровня амидированности и окислительных модификаций в СА молодых и старых животных.

В отличие от разнонаправленных изменений содержания амидных, карбонильных и сульфгидрильных групп в суммарных белках, обладающих тканевой спецификой, посттрансляционные модификации индивидуального белка (сывороточного альбумина) имели сходную динамику как при физиологическом, так и при модельном старении (Рис. 13, 14).



Рис. 13. Динамика уровня карбонильных групп СА по отношению к контрольной группе (2-х месячные животные). Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 14. Динамика уровня карбонильных групп БСА на различных сроках инкубации в условиях, моделирующих физиологические. Обозначения как на Рис. 1.

Наблюдаемые нами окислительные модификации в СА старых крыс и БСА в условиях «модельного старения» выражались в приросте карбонильных производных на 30,4 и 158,6%, соответственно.

Было отмечено усиление образования внутри- и межмолекулярных сшивок радикалов тирозина на 10,7% в СА старых крыс и на 82,1% при инкубации БСА в физиологических условиях, а также снижение флуоресценции остатка триптофана на 18,5 и 39,6%, соответственно (Рис. 15, 16). Можно предположить, что большая выраженность наблюдаемых окислительных изменений свидетельствует о наличии достаточного количества ионов меди в коммерческом препарате альбумина (Ramirez, 2005) и кислорода в инкубационной среде, необходимых для генерации АКМ, являющихся, в свою очередь, пусковым механизмом окислительных повреждений белка.

Рис. 15. Динамика интенсивности флуоресценции битирозина и триптофана СА старых крыс по отношению к контрольной группе (2-х месячные животные). Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 16. Изменения интенсивности флуоресценции битирозина и триптофана БСА на различных этапах инкубации в условиях, моделирующих физиологические. Обозначения как на Рис. 1.

Считается, что незначительная интенсивность свободно-радикального повреждения белков in vivo (по сравнению с in vitro) обусловлена наличием антиоксидантной системы организма, представленной низкомолекулярными соединениями - ловушками радикалов, к которым относятся витамины (А, Д, Е, К и С), биофлаваноидами, антиперекисными ферментами (супероксиддисмутазой, каталазой, глутаонпероксидазой, глутатионредуктазой и пр.), а также низкомолекулярными тиолами (глутатионом) (Губский, 2000). Повышению антиоксидантных свойств крови способствует «цистеинизация» сывороточных белков, что усиливает защитные свойства организма (Синичкин, 2005).

Наблюдаемый нами прирост в 2,5 раза уровня сульфгидрильных групп в сывороточном альбумине старых крыс может объясняться расщеплением одной дисульфидной связи с последующим образованием свободных SH-групп (Рис. 17).

Установленные изменения уровня тиольных групп, снижение собственной флуоресценции тирозина, триптофана и фенилаланина в среднем на 19%, наряду с падением специфической флуоресценции триптофана, обусловленной окислительным воздействием, свидетельствуют о конформационных перестройках в молекуле сывороточного альбумина старых животных, что не может не отражаться на его физико-химических свойствах и выполняемых им функциях (Рис. 18).

Рис. 17. Динамика содержания сульфгидрильных групп СА старых крыс по отношению к контрольной группе (2-х месячные животные). Обозначения как на Рис. 1.



Рис. 18. Изменение флуоресценции СА 20 и 24 месячных крыс по отношению к контролю (2-х месячные животные). Обозначения как на Рис. 1.

Природа конформационных перестроек белков имеет двойственную причину: наряду с окислительным фолдингом, в изменения конформации молекулы определенный вклад вносит процесс неферментативного спонтанного дезамидирования остатков аспарагина и глутамина. Изменения степени суммарной амидированности сывороточного альбумина имели сходные картины и при физиологическом, и при модельном старении. Наблюдаемая потеря САГ как in vivo, так in vitro происходила за счет фракции ЛАГ и составляла 8 и 14%, соответственно. Достоверных изменений во фракции ТАГ не наблюдалось (Рис. 19, 20).

Рис. 19. Динамика содержания амидных групп СА крыс 20 и 24 месячного возраста по отношению к контролю (2 мес.). Обозначения как на Рис. 1.

Рис. 20. Изменение содержания фракций амидных групп в БСА на различных этапах инкубации в условиях, моделирующих физиологические. Обозначения как на Рис. 1.

Окислительные модификации и амидированность сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона. Для установления взаимосвязи между окислительными модификациями белка и степенью его амидированности были проведены эксперименты in vitro, заключающиеся в инкубации СА в различных концентрациях среды Фентона, где происходила генерация свободных радикалов ОН*. В литературе отсутствуют сведения об окислительной модификации амидных групп аспарагина и глутамина.

Нами было показано, что интенсивность окислительных модификаций, детектируемых по нарастанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана, зависит от концентрации компонентов среды Фентона (Рис. 21, 22, 23).



концентрация реагентов среды Фентона, мМ

Рис. 21. Зависимость уровня содержания карбонильных групп в БСА от времени инкубации и от концентрации реагентов среды Фентона.

Обозначения: * - достоверные различия по сравнению с контролем (р < 0,05);

1 - сразу после внесения в реакционную смесь перекиси водорода;

2 - через 15 минут инкубации в среде Фентона;

3 - через 1 час инкубации в среде Фентона;

4 - через 2 часа инкубации в среде Фентона.

Концентрация компонентов среды Фентона, мМ

Рис. 22. Зависимость степени окисления тирозина БСА в среде Фентона (Fe2+-ЭДТА- Н202) от времени инкубации и концентрации реагентов. Обозначения как на Рис. 21.

Концентрация компонентов среды Фентона, мМ

Рис. 23. Динамика окисления триптофана БСА в среде Фентона (Fe2+-ЭДТА-Н202) в зависимости от времени инкубации и концентрации реагентов среды. Обозначения как на Рис. 21.

Наиболее выраженные окислительные изменения наблюдались при инкубации БСА с максимальной концентрацией реагентов среды Фентона (10-3 мМ). Для данной концентрации коэффициенты корреляции между уровнем карбонильных групп и содержанием триптофана и битирозина составляли -0,91 и +0,91, соответственно. Аналогичная картина прослеживалась и для концентрации 10-4 мМ. Для наиболее низкой концентрации реагентов инкубационной среды существенных корреляционных связей выявлено не было, так как достоверные изменения относительно «нулевой» точки инкубации регистрировались только к 120 минуте.

Динамики содержания САГ и ЛАГ при инкубации БСА на протяжении всех временных периодов в среде Фентона 10-3 мМ имели сходную тенденцию к увеличению (на 8,5 и 15,1%, соответственно) (Рис. 24). Фракция ТАГ при аналогичных условиях инкубации достоверно не изменялась. Инкубация БСА в среде Фентона с концентрацией компонентов 10-4 мМ отражалась на уровне ЛАГ и САГ значительно слабее (Рис. 25).



Рис. 24. Динамика содержания амидных групп и их фракций при индуцированном средой Фентона [10-3] металл-катализируемом окислении БСА. Обозначения как на Рис. 21.

Рис. 25. Динамика содержания амидных групп и их фракций при индуцированном средой Фентона [10-4] металл-катализируемом окислении БСА. Обозначения как на Рис. 21.

Было отмечено увеличение содержания фракции ЛАГ ко 2-му часу инкубации на 10,3%, что вносило вклад в увеличение суммарной амидированности БСА на 4,7%.

Можно предположить, что наблюдаемый прирост фракции ЛАГ происходит за счет образования аспарагина при окислении остатков гистидина. Другой способ образования аспарагина, кроме окислительной деструкции гистидина, не доказа. Обнаруженная взаимосвязь между окислительной модификацией белка и степенью его амидированности имеет принципиальное значение, поскольку позволяет объяснить наблюдавшееся увеличение амидированности белков в некоторых тканях при состояниях организма, сопряженных с окислительным стрессом (Кричевская, 1980). Ферментативные механизмы амидирования остатков дикарбоновых аминокислот к настоящему времени неизвестны.

Следует отметить, что прирост амидных групп при инкубации БСА в среде Фентона невысок, так как используемый в работе метод определения амидных групп, возможно, не выявляет б-амидов, возникающих при окислительной деструкции белков.

Изменения уровня амидированности могут быть опосредованы влиянием двух противоположных процессов: увеличением фракции ЛАГ вследствие окислительных модификаций и описанным Robinson спонтанным дезамидированием аспарагина в водной среде. По всей видимости, второй процесс количественно преобладает над первым, так как максимальное окисление гистидина способствовало бы существенному приросту амидных групп, что в настоящем исследовании экспериментально подтверждено не было.

В отличие от инкубации в среде Фентона (минуты и часы), инкубация при условиях, сопоставимых с физиологическими (недели), резко замедляет окислительные модификации. Это позволило выявить неферментативный гидролиз амидных групп и его высокую отрицательную взаимосвязь с окислительными модификациями (коэффициент корреляции = -0,97).

В ходе анализа полученных результатов по конформационным изменениям альбумина при инкубации в среде Фентона трех концентраций была выявлена аналогия с данными по изменению собственной флуоресценции сывороточного альбумина молодых (2 мес.) и старых (20 и 24 мес.) крыс. Собственная флуоресценция альбумина старых животных снижалась при всех трех значениях возб 275, 280 и 285 нм в среднем на 19%. Эти данные сопоставимы с результатами по окислительному воздействию компонентов среды Фентона, особенно в малых концентрациях (10-5 мМ), где было зарегестрировано затухание флуоресценции при этих длинах волн на 12,0%, 13,0% и 9,4%, соответственно.

Однако подобная низкая концентрация не способствовала окислительной деструкции белка. При более высоких концентрациях компонентов среды Фентона (10-3 мМ) наблюдалась значительная степень деструкции полипептидной цепи, что согласуется с данными других авторов о перекись-зависимой фрагментации СА, выражающейся в образовании фрагментов с молекулярными массами 60, 49, 39, 28-30, 15-17, 8 и 5 кДа, и снижении степени агрегации, связанной с уменьшением количества димерных форм (Ramirez, 2005). Увеличение срока инкубации способствовало росту степени гетерогенности исследуемого белка (Рис. 26).

Рис. 26. Электрофореграммы БСА на различных этапах инкубации в среде Фентона. Обозначения как на Рис. 21.

Проведенный анализ экспериментальных данных позволяет заключить, что возникновение белков с измененными структурой и свойствами - довольно широко распространенное явление, характеризующее процесс старения in vivo и in vitro. Характер и глубина изменений белков при старении зависят как от их функций, так и от скорости их обновления в различных клетках и тканях. Белки, подвергшиеся окислительным и спонтанным, генетически предопределенным модификациям, обнаруживаются в постмитотических необновляемых (нервные и мышечные), обновляемых (селезенка, тестикулы), а также покоящихся интермитотических (печень) клетках, сохраняющих способность к интенсивному синтезу и катаболизму белка.

Возрастные ПТМ затрагивают как отдельные функциональные группы, так и общую конформацию белков. В большей степени изменены белки с относительно медленным периодом обновления, содержащие большое количество остатков трудногидролизуемых амидных групп (глутамина), в то время как у короткоживущих полипептидов интенсивность этих модификаций незначительна.

Таким образом, полученные результаты позволили установить взаимосвязь процессов окислительных модификаций и сопутствующих им изменений степени амидированности на всех уровнях изменений белков при старении: от физиологического старения тканей до посттрансляционных изменений индивидуальных белковых молекул как in vivo, так и in vitro.

Практическим результатом проведенных исследований явился предложенный модифицированный метод выделения высокоочищенного сывороточного альбумина в препаративных количествах, который может представлять интерес для промышленного производства СА.

ВЫВОДЫ

1. На разных этапах постнатального онтогенеза (2, 4, 16, 18, 20 и 24 мес.) наблюдаются тканеспецифичные изменения степени амидированности, содержания тиоловых групп и интенсивности карбонилирования суммарных белков тканей мышц, сердца, мозга, печени, селезенки и тестикул белых крыс, что обусловлено морфо-функциональными особенностями, а также гетеротропностью и гетерохронностью развития процессов инволюции органов и тканей.

2. Прирост карбонильных производных, а также снижение уровня суммарной амидированности и показателей собственной флуоресценции свидетельствуют о наличии конформационных переходов в сывороточном альбумине старых крыс (24 мес.), следствием которых являются увеличение доступности остатков тирозина к окислительным воздействиям, выражающимся в образовании битирозиновых сшивок, и накопление сульфгидрильных групп, в сравнении с неполовозрелыми (2 мес.) животными.

3. Установлена зависимость интенсивности окислительных модификаций БСА, детектируемых по нарастанию карбонильных групп, битирозиновых сшивок и окислению триптофана, от концентрации компонентов среды Фентона. Наиболее выраженные окислительные изменения наблюдались при инкубации БСА с максимальной концентрацией реагентов среды Фентона (10-3 мМ). Для данной концентрации коэффициенты корреляции между уровнем карбонильных групп и содержанием триптофана и битирозина составили -0,91 и +0,91, соответственно. При металл-катализируемом окислении в среде Фентона с наибольшей концентрацией компонентов отмечен небольшой, но достоверный прирост суммарной амидированности БСА, который происходит за счет фракции ЛАГ.

4. В процессе инкубации БСА в условиях, моделирующих физиологические (0,9% раствор NaCl, рН 7,0, 37С), в течение 28 суток происходит прирост карбонильных и битирозиновых производных и снижение флуоресценции триптофана.

5. При инкубации БСА в физиологических условиях процесс спонтанного дезамидирования количественно преобладает над увеличением амидных групп окислительной этиологии, что находит отражение в снижении суммарной амидированности при модельном старении бычьего сывороточного альбумина за счет фракции ЛАГ.

6. Установлена взаимосвязь между амидированностью и окислительными модификациями сывороточного альбумина крыс при старении животных и при модельном старении бычьего сывороточного альбумина. Характер взаимосвязи определяется соотношением интенсивности окислительных модификаций и спонтанного дезамидирования белков.

7. Разработан модифицированный способ препаративного получения сывороточного альбумина, предусматривающий использование предварительной очистки высаливанием сульфатом аммония, с последующей аффинной хроматографей на колонке с «голубой» агарозой. Установлено, что внесенные изменения позволяют упростить и сократить во времени базовый метод, не нанося ущерба степени чистоты и гомогенности препарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Дурканаева О.А. Возрастные изменения амидированности и карбонилирования белков тканей белых крыс / Сорокина И.А., Лукаш А.И., Дурканаева О.А. // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2009. № 1. С. 74-78 (0,20 п.л., личн. вк. 80%).

2. Дурканаева О.А. Взаимосвязь амидированности и окислительных модификаций сывороточного альбумина при его инкубации в среде Фентона / Дурканаева О.А., Булгакова А.А., Сорокина И.А., Лукаш А.И. // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2011. № 6. С. 56-58. (0,12 п.л., личн. вк. 60%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

3. Дурканаева О.А. Посттрансляционные неферментативные модификации контролируют «время жизни» белков / Дурканаева О.А., Сорокина И.А., Лукаш А.И., Вечканов Е.М. // В мат. 4-го съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов с международным участием. Новосибирск. 2008. С. 260 (0,04 п.л., личн. вк. 60%).

4. Дурканаева О.А. Взаимосвязь спонтанного дезамидирования и карбонилирования белков крыс при физиологическом старении / Дурканаева О.А., Сорокина И.А., Лукаш А.И. // В мат. 8-го Международного симпозиума «Биологические механизмы старения». Харьков. 2008. С. 38 (0,04 п.л., личн. вк. 70%).

5. Дурканаева О.А. Влияние металлкатализируемой окислительной модификации на неферментативное дезамидирование бычьего сывороточного альбумина / Булгакова А.А., Темяков А.В., Дурканаева О.А., Сорокина И.А., Вечканов Е.М., Лукаш А.И. // В мат. Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине». Ростов-на-Дону. 2008. С. 20-21 (0,08 п.л., личн. вк. 70%).

6. Дурканаева О.А. Онтогенетический анализ содержания сульфгидрильных групп, уровней спонтанного дезамидирования и карбонилирования белков различных тканей крыс / Темяков А.В., Дурканаева О.А., Булгакова А.А., Сорокина И.А., Вечканов Е.М., Лукаш А.И. // В мат. 3-й Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону. 2009. С. 120-121 (0,08 п.л., личн. вк. 60%).

7. Дурканаева О.А. Исследование спонтанного дезамидирования, уровня сульфгидрильных и карбонильных групп в белках печени и сердца крыс при физиологическом старении / Дурканаева О.А., Темяков А.В., Сорокина И.А., Лукаш А.И. // В мат. 9-го Международного симпозиума «Биологические механизмы старения». Харьков. 2010. С. 116-117 (0,08 п.л., личн. вк. 50%).

8. Дурканаева О.А. Роль посттрансляционных неферментативных модификаций в молекулярных механизмах продолжительности жизни белков / Сорокина И.А., Лукаш А.И, Вечканов Е.М., Дурканаева О.А., Темяков А.В., Булгакова А.А., Парибек И.М., Алилуев И.А. // Международный журнал экспериментального образования. 2010. № 7. С. 15 (0,04 п.л., личн. вк. 20%).

9. Дурканаева О.А. Динамика окислительной модификации белков в различных тканях крыс в онтогинезе / Булгакова А.А., Вечканов Е.М., Дурканаева О.А., Темяков А.В., Сорокина И.А. // В мат. 14-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. «Биология. Наука 21-го века». Пущино. 2010. Сборник тезисов. Т. 1. С. 13 (0,04 п.л., личн. вк. 50%).

10. Дурканаева О.А. Онтогенетический анализ посттрансляционных модификаций сывороточного альбумина крыс / Дурканаева О.А., Сорокина И.А., Темяков А.В, Вечканов Е.М., Лукаш А.И. // В мат. 2-й Международной конференции «Физико-химическая биология». Новосибирск. 2011. С. 109 (0,04 п.л., личн. вк. 40%).

11. Дурканаева О.А. Анализ влияния металл-катализируемых окислительных модификаций на неферментативное дезамидирование бычьего сывороточного альбумина при инкубации в различных концентрациях среды Фентона / Дурканаева О.А., Булгакова А.А., Сорокина И.А., Лукаш А.И. // В мат. Юбилейной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии». Санкт-Петербург. 2011. С. 56 (0,04 п.л., личн. вк. 70%).

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активные кислородные метаболиты;

АФК - активные формы кислорода;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ДДС-Na - додецилсульфат натрия;

ЛАГ - легкогидролизуемые амидные группы;

МДА - малоновый диальдегид;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

ПТМ-посттрансляционные модификации;

СА - сывороточный альбумин;

САГ - суммарные амидные группы;

СОД - супероксиддисмутаза;

ТАГ - трудногидролизуемые амидные группы;

ТБК - тиобарбитуровая кислота;

Тир - тирозин;

Трп - триптофан;

Фен - фенилаланин;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия.

Размещено на Allbest.ru

...