Свободнорадикальные процессы в крови и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при метаболическом синдроме

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Свободнорадикальные процессы в крови и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при метаболическом синдроме

03.00.04 - биохимия

Попова Татьяна Петровна

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Внуков Валерий Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Франциянц Елена Михайловна

доктор медицинских наук, профессор Терентьев Владимир Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» (г. Нижний Новгород).

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Метаболический синдром (МС) представляет собой комплекс взаимосвязанных нарушений углеводного и жирового обменов, а также механизмов регуляции артериального давления (АД) и функции эндотелия, в основе развития которых лежит снижение чувствительности тканей к инсулину - инсулинорезистентность (ИР). Клиническая значимость нарушений и заболеваний, объединённых рамками метаболического синдрома, заключается в том, что их сочетание в значительной степени ускоряет развитие и прогрессирование атеросклеротических сосудистых заболеваний, которые занимают первое место среди причин смертности населения большинства развитых стран (Парфенова, 1998; Диденко, 1999; Казека, 2002).

Резистентность к потреблению глюкозы, стимулированной инсулином - общий феномен, который играет основную роль в патогенезе многих болезней человека, в том числе, МС. Возникновение ИР и следующей за ней компенсаторной гиперинсулинемии (ГИ) зачастую ассоциируются с такими факторами риска ишемической болезни сердца (ИБС), как ожирение, гипергликемия, артериальная гипертензия, дислипопротеинемия (Bartnik et at., 2004). В развитии ИР имеют значение как фактор генетической предрасположенности (нарушение рецепторных и пострецепторных механизмов передачи сигнала инсулина), так и определенные особенности образа жизни: избыточное питание, снижение физической активности, курение (Coleman, Stevens et al., 2005).

Несмотря на очевидные успехи последних десятилетий в области изучения патогенеза МС, сложные механизмы, вызывающие ИР, остаются до конца неизученными. К настоящему времени накоплен обширный клинико-биохимический материал о ведущей роли свободнорадикальных процессов (СРП) в патогенезе сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертензии, атеросклероза - синдромообразующих заболеваний МС. Однако данных о свободнорадикальном окислении (СРО) и состоянии клеточных мембран у пациентов с ИР без нарушения углеводного обмена в доступной литературе нет. Понимание механизмов регуляции СРО может дать новые подходы к профилактике и лечению МС. Таким образом, несмотря на успехи, достигнутые в последние годы в изучении патогенетических основ ИР, существует очевидная незавершенность исследований в этой области. Необходимо дальнейшее изучение биохимических и патологических механизмов, связанных с развитием ИР, поскольку только такой подход поможет разработать патогенетически верную терапию, направленную на профилактику системных нарушений в различных органах и тканях.

Цель работы. Исследование свободнорадикальных процессов в крови и структурно-функционального состояния мембран эритроцитов больных при метаболическом синдроме.

Задачи исследования.

1) Исследовать уровень свободнорадикальных процессов по параметрам Н₂О₂-люминол индуцированной хемилюминесценции и интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по содержанию их молекулярных продуктов - диеновых коньюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) и шиффовых оснований (ШО) в крови больных с МС.

2) Определить активность ферментативных (супероксиддисмутаза (СОД), каталаза и церулоплазмин) и уровень неферментативных (мочевина, мочевая кислота и б-токоферол) антиоксидантов в крови обследуемых пациентов с МС.

3) Исследовать стабильность и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов клинической группы.

4) Определить уровень эндогенной интоксикации по содержанию молекул средней массы (МСМ) в плазме крови и развитие гипоксии по содержанию ксантина и молочной кислоты в крови обследуемых больных.

5) Исследовать уровень СРП, сбалансированность в системе прооксиданты - антиоксиданты в крови, стабильность и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов, развитие эндогенной интоксикации при проведении больным метаболическим синдромом дието - и фармакотерапии.

Научная новизна работы. В работе впервые проведены комплексные исследования свободнорадикальных процессов, генерации активных интермедиатов кислорода и интенсивности перекисного окисления липидов при МС.

Впервые оценена роль ферментативных (СОД, каталаза и церулоплазмин) и неферментативных (мочевина, мочевая кислота и витамин Е) эндогенных антиоксидантов плазмы крови, являющихся основными компонентами адаптивно-компенсаторных механизмов, в регуляции свободнорадикальных процессов при МС и его коррекции дието- и фармакотерапией,.

В работе впервые исследованы физико-химические параметры, отражающие структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов больных с МС, показатели дестабилизации и проницаемости, в основе которых лежат нарушения микровязкости липидного бислоя, мембранных белков, полярности липидного матрикса.

Впервые отмечено, что при МС у больных развивается эндогенная интоксикация и наблюдаются признаки гипоксического синдрома.

В комплексном лечении МС использование сбалансированной по содержанию жиров и углеводов диеты, сопряженной с физическими упражнениями и лекарственными средствами, повышающими чувствительность тканей к инсулину (глюкофаж) и содержащими щ3-ПНЖК (омакор), приводит к ингибированию СРО в крови, восстановлению прооксидантно-антиоксидантного равновесия, стабилизации структурно- функционального состояния мембран эритроцитов, а также снижению эндогенной интоксикации.

Теоретическая и практическая значимость работы. В общетеоретическом плане выполненная работа позволяет расширить существующие представления о патогенезе метаболического синдрома, сформировать целостное представление о роли свободнорадикального окисления, ферментативных и неферментативных антиоксидантов в развитии заболевания.

Одним из важнейших компонентов в развитии МС является активация свободнорадикального окисления, процессов ПОЛ, структурно-функциональная дестабилизация мембран эритроцитов, повышение активности антиоксидантной системы, эндогенная интоксикация и гипоксия. Угнетение процессов свободнорадикального окисления, нормализация активности ферментативных и количества неферментативных антиоксидантов, стабилизация структурно-функционального состояния и, как следствие, изменение проницаемости мембран эритроцитов, снижение уровня эндогенной интоксикации являются результатом купирования МС при применении сбалансированной по содержанию жиров и углеводов диеты, сопряженной с физическими упражнениями, лекарственных средств, снижающих ИР (глюкофаж) и содержащих щ3-ПНЖК (омакор).

Наиболее информативные биохимические и биофизические показатели развития патологического процесса, характеризующиеся простотой и оперативностью определения (содержание малонового диальдегида, активность ферментативных (супероксиддисмутаза, каталаза и церулоплазмин) антиоксидантов, содержание ксантина, лактата и молекул средней массы), могут быть использованы для прогноза развития заболевания и оценки тяжести патологического процесса, а также эффективности проводимого лечения.

Полученные данные можно использовать в клинике как для диагностики состояния больных при метаболическом синдроме, так и для оценки эффективности проводимой терапии и подборе лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту. Развитие метаболического синдрома сопровождается усилением в крови пациентов свободнорадикальных процессов и повышения продуктов перекисного окисления липидов.

В крови больных метаболическим синдромом наблюдается повышение активности ключевых ферментов антирадикальной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, церулоплазмина) и уровня важнейших эндогенных неферментативных антиоксидантов (мочевины и мочевой кислоты).

У обследованной группы больных выявлены нарушения физико-химических характеристик мембран эритроцитов, сопровождаемые изменением структуры, дестабилизацией и увеличением их проницаемости.

Важными особенностями метаболического синдрома является развитие у больных эндогенной интоксикации и признаков гипоксического синдрома.

Включение в терапию метаболического синдрома диеты, сбалансированной по содержанию жиров и углеводов, в сочетании с физическими упражнениями, препаратов, обеспечивающих снижение инсулинорезистентности (глюкофаж) и содержащих щ-3ПНЖК (омакор) повышает эффективность лечения за счет выраженного антирадикального, антиоксидантного и мембранотропного действия и приводит к купированию синдрома эндогенной интоксикации.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации доложены на третьей всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008), научно-практическом симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2008), ЙV Всероссийском диабетологическом конгрессе (Москва, 2008), ЙЙ Международной научной конференции (Ростов-на-Дону, 2008), ЙЙ съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008), 69 научно-практической конференции студентов и молодых ученых Саратовского медицинского университета «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 1 статья.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 197 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики обследуемых больных и методов исследования, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 24 таблицы и иллюстрирована 10 рисунками. Список использованной литературы включает 338 наименований, в том числе 180 зарубежных источников.

мембрана эритроцит метаболический синдром

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На базе Ростовского эндокринологического центра городской больницы №4 и клинико-диагностической лаборатории ГУЗ РОКБ было обследовано 50 пациентов с МС обоего пола в возрасте от 20 до 58 лет. В качестве контроля использовали данные по обследованию 20 доноров соответствующего пола и возраста, без вредных привычек. Критерии включения пациентов в исследования были: избыточная масса тела (ИМТ ? 29 кг/м²), абдоминальный тип ожирения (ОТ/ОБ ? 0,85), в 86% случаев висцеральное ожирение (ОТ ? 90 см), наличие инсулинорезистентности, отсутствие сахарного диабета и других эндокринных нарушений, согласие на участие в исследовании, отсутствие противопоказаний для проведения планируемой терапии.

Пациенты с МС были рандомизированы в группы, не отличающиеся по полу и возрасту, в зависимости от выраженности метаболических нарушений. Группа, имеющая значительные изменения со стороны углеводного обмена (17 пациентов), получала глюкофаж (1000 мг/сут). В группу пациентов с МС, которые принимали омакор (1 капс/сут), вошли 17 пациентов, имеющие по результатам предварительного обследования нарушения со стороны липидного спектра крови. Еще одна группа состояла из 16 пациентов, которым была разработана индивидуальная немедикаментозная терапия, включающая рациональное гипокалорийное питание и дозированные аэробные физические нагрузки.

Получение биологического материала. Для получения плазмы крови использовали кровь, собранную утром натощак путем пункции локтевой вены. В качестве антикоагулянта использовали гепарин производство «Биохеми» (Австрия), 5000 МЕ/мл, из расчета 0,1 мл гепарина на 7-8 мл крови.

Метод определения активности процессов СРО. Уровень свободнорадикальных процессов оценивали по интенсивности хемилюминесценции в системе Н₂О₂ - люминол (Шестаков и др., 1979).

Методы определения активности процессов ПОЛ. Интенсивность перекисного окисления липидов определяли по содержанию его молекулярных продуктов - диеновых коньюгатов (Стальная, 1977), малонового диальдегида (Стальная и др., 1977) и шиффовых оснований (Bidlack et al. 1973). Содержание общих липидов определяли с помощью стандартного клинического набора реактивов производства «ЭКОлаб» (Россия).

Методы определения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов. Для оценки структурно-функционального состояния мембран эритроцитов определяли микровязкость липидной фазы, зон белок-липидных контактов и другие параметры с использованием метода, основанном на свойстве флуоресценции зонда пирен (Владимиров, Добрецов, 1980).

Содержание общего белка определяли методом Лоури в модификации Schacterle (1973). Исследовали содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) (Меньшиков, 1987), а также суммарную пероксидазную активность (Покровский, 1969, в модификации Лукаша А.И. и др., 1996).

Методы определения активности антиоксидантной защиты. О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности ферментативных антиоксидантов: супероксиддисмутазы (Сирота, 1999) (в плазме крови - супероксидустраняющая активность, Гуляева и др., 1988), каталазы (Королюк и др., 1988), церулоплазмина (ЦП) (Камышников, 2000); по содержанию неферментативных антиоксидантов: мочевой кислоты (с помощью стандартного клинического набора фирмы «Эко-сервис», Россия), мочевины (с помощью стандартного набора фирмы «Эко-Сервис» «Клини-Тест-Мочевина200», Россия) и б-токоферола (Архипова, 1988).

Метод определения эндогенной интоксикации. Определяли показатели эндогенной интоксикации по содержанию молекул средней массы по пяти фракциям (л=210нм, 238нм, 245нм,254нм, 280нм) (Камышников, 2000).

Методы определения уровня гипоксии. Для оценки уровня гипоксии исследовали содержание молочной кислоты (Меньшиков, 1987), пировиноградной кислоты (ПВК) (Бабаскин, 1981) и ксантина (Williams (1950) в модификации Погореловой и соавт. (1983).

Полученные в эксперименте результаты подвергали статистической обработке (Владимирский, 1983; Лакин, 1980). Рассчитывали среднее арифметическое значение ряда Мср и среднеквадратичное отклонение m. Сравнение величин, в случае нормального распределения, проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Различия между группами считали статистическими значимыми при р ?0,05, при 0,05< р?0,1 говорили о тенденции к изменению, при р> 0,1 различия полагали недостоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Свободно-радикальные процессы и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов у пациентов с МС

В эксперименте в исследуемой группе пациентов с МС относительно доноров в начале лечения наблюдали усиление СРО (по повышению параметров Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ): спонтанной светосуммы (на 34%), высоты быстрой вспышки (на 25%), высоты и светосуммы медленной вспышки (на 31% и 54%, соответственно), скорости окисления липидов (на 35%) (рис. 1).

Активация ПОЛ полиненасыщенных жирных кислот липидов в плазме крови и эритроцитах пациентов с МС выражалась в увеличении концентрации первичных, вторичных и конечных продуктов пероксидации. В сравнении с группой доноров, в плазме крови больных с МС содержание ДК было выше на 35%, МДА и ШО - на 28% и 22%, соответственно. В эритроцитах прослеживалась аналогичная динамика. Содержание ДК превышало контрольный уровень на 39%, МДА - на 34%, ШО - на 30%, соответственно (рис. 1).

Рис. 1. Интенсивность СРО по показателям Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ и процессов ПОЛ в крови пациентов с метаболическим синдромом. Обозначение: h - высота быстрой вспышки, Н - высота медленной вспышки, Sm - светосумма медленной вспышки, tgб - скорость окисления липидов. Примечание: на рис. 1-9 достоверность изменений обозначена следующим образом: * - р< 0,05; ** - р< 0,01; *** - р<0,001

Усиление процессов ПОЛ в клетках может приводить к дестабилизации мембраны с последующей деструкцией клеток. Обнаруженная в наших исследованиях интенсификация свободнорадикального ПОЛ в крови пациентов с МС приводила к изменению структурной организации мембран эритроцитов, к их дестабилизации и нарушению барьерных функций. Подтверждением этого являлось повышение содержания ВЭГ и интенсивности СПА в плазме крови (по сравнению с данными доноров) на 74% и 89%, соответственно (рис. 2), что свидетельствует об ухудшении реологических свойств крови и о повышенном гемолизе эритроцитов.

Наличие выраженных изменений структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у пациентов с МС оценивали по нарушению микровязкости липидного бислоя и вязкостно-эластических свойств эритроцитов. Анализ спектра флуоресцентного зонда пирена позволил сделать вывод об изменении структуры эритроцитарной мембраны обследованных нами лиц с МС.

В сравнении с группой доноров, у больных с МС была повышена микровязкость липидного бислоя (F_э/F_м 334) на 25%, текучесть зон белок-липидных контактов (F_э/F_м 282) - на 12%, степень погружения белков в липидный бислой (F₀-F₁/F₀) - на 38%, гидрофобность внутренних областей мембраны (F₃₇₂/F₃₉₃ 334) снизилась на 7% (рис. 2). Коэффициент полярности зоны белок - липидных контактов (F₃₇₂/F₃₉₃ 282) относительно доноров остался без достоверных изменений. Обнаруженные структурные изменения мембран эритроцитов могут быть обусловлены некомпенсированной активацией ПОЛ. Кроме того, в литературе имеются указания на то, что изменения физико-химического состава плазматических мембран, снижение их текучести может наблюдаться вследствие нарушения транспорта неэтерефицированных жирных кислот (НЭЖК) (Титов, 2002, 2006; Новгородцева с соавт., 2008).



Рис. 2. Показатели структурно-функционального состояния мембран эритроцитов, уровни ВЭГ и СПА в плазме крови пациентов с метаболическим синдромом.

При нормальных условиях в организме сохраняется динамическое равновесие между интенсивностью СРП и активностью ферментативной и неферментативной антиоксидантных систем, что является одним из основных показателей гомеостаза. По сравнению с группой доноров, активность супероксидустраняющей активности (СУА) в плазме пациентов с МС достоверно увеличилась (на 98%), активность каталазы увеличивалась при этом на 28%. Наряду с этим, наблюдали достоверное повышение оксидазной активности ЦП (по сравнению со значениями доноров) на 45%. В гемолизате эритроцитов наблюдали аналогичные изменения. Активность данного фермента в группе пациентов с МС была достоверно повышена, по сравнению со значениями доноров, на 60%, активность каталазы - на 42% (рис. 3).

В исследуемой группе больных МС, по сравнению с группой доноров, наблюдали достоверное повышение в плазме крови содержания мочевой кислоты (на 27%) и мочевины (на 59%) (рис. 3). По-видимому, по мере прогрессирования метаболических нарушений при МС происходит увеличение «емкости» антиоксидантной системы крови за счет низкомолекулярных продуктов. Концентрация витамина Е, напротив, была снижена у пациентов с МС в плазме крови (на 41%), что, возможно, связано с усилением процесса детоксикации липидных перекисей б-токоферолом и, в связи с этим, снижением его резервного пула в организме (рис. 3).

Таким образом, активацию АОС в плазме крови больных с МС можно рассматривать как состояние ее «напряжения», которое, вероятно, вызвано усилением процессов СРО.

Рис. 3. Активность антиоксидантной системы в крови пациентов с метаболическим синдромом.

В начале обследования на фоне усиления СРО и процессов ПОЛ обнаружено повышение МСМ в плазме крови пациентов с МС (рис. 4). В наибольшей степени это касается метаболитов, регистрируемых при л=246 нм (45%) и 280 нм (39%). Также наблюдалось повышение пула МСМ (при л=254, л=210 и л=238 нм). С одной стороны, это может свидетельствовать о повышении уровня гидролитических процессов, следствием которых является увеличение содержания в плазме крови продуктов деструкции биополимеров и, в первую очередь, белков, что лежит в основе развития эндогенной интоксикации (Добротина и др., 2004). С другой стороны, при указанных длинах волн регистрируются такие метаболиты, как мочевина и мочевая кислота, которые могут оказывать выраженное антиоксидантное действие. Поэтому можно предположить, что при развитии данной патологии увеличение содержания отдельных фракций МСМ может являться компенсаторной реакцией организма в ответ на усиление СРП.



Рис. 4. Содержание МСМ, ксантина, ПВК и лактата в крови пациентов с метаболическим синдромом.

При МС в условиях ИР под влиянием повышенной концентрации инсулина в крови происходит повышение выработки эндотелием вазоконстрикторных биологически активных веществ (эндотелина, тромбоксана А₂) и снижение секреции таких мощных вазодилататоров, как простациклин и оксид азота. Нарушение функций сосудов сопровождается изменением транспорта кислорода и степени напряжения кислорода в тканях (Gayhlarde et al., 1988). Нарушение эндотелийзависимой вазодилатации, сопряженное с ухудшением вязкостно-эластических свойств крови, плохо деформируемой мембраной эритроцитов, приводит к развитию застойных явлений в микроциркуляторном русле, нарушению оксигенации тканей и, как следствие, тканевой гипоксии (Kikuchi, 1994). В нашем исследовании у больных с МС до лечения было зарегистрировано повышение концентрации в цельной крови и эритроцитах лактата (на 67%), ПВК (на 43%) и ксантина (на 34%) (рис. 4), что свидетельствует о развитии гипоксии у пациентов с МС в начале заболевания, когда равновесие гипоксантин - ксантин сдвигается в сторону последнего. Параллельно с этим, по-видимому, метаболизм в клетках частично перестраивается с аэробного на анаэробный гликолиз, идущий с накоплением молочной кислоты.

Свободно-радикальные процессы и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при лечении пациентов с МС

В процессе терапии пациентов с МС во всех обследуемых группах наблюдали снижение интенсивности СРО по уменьшению параметров Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ.

В группе, находящейся на рациональном питании и физических нагрузках, во все сроки обследования (3 и 6 мес.) не наблюдали достоверных изменений со стороны исследуемых параметров ХЛ в плазме крови как по отношению к показателям фоновых значений, так и по показателям в группе доноров, за исключением достоверного снижения высоты медленной вспышки (Н) через 6 месяцев (на 31%) относительно фоновых значений и повышения высоты быстрой вспышки (h) относительно группы доноров через 3 и 6 месяцев терапии (на 22% и 18%, соответственно), что свидетельствует об эффективности проведения диетотерапии (рис.5).

Рис. 5. Интенсивность СРО по показателям Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ в плазме крови пациентов с метаболическим синдромом при терапии.

В группе пациентов, которые наряду с традиционной терапией применяли глюкофаж, регистрировали снижение всех параметров Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ относительно исходных значений: через 3 месяца - в среднем на 31%, через 6 месяцев - на 29% (рис.5). Данные показатели статистически не отличались от значений, полученных в группе доноров, что свидетельствует об эффективности проводимой терапии.

В группе пациентов, которые наряду с традиционной терапией получали омакор, также наблюдали снижение в плазме крови всех параметров Н₂О₂-люминол индуцированной ХЛ через 3 месяца лечения в среднем на 23%, по сравнению с фоновыми значениями. Относительно значений доноров в данной группе пациентов с МС после лечения достоверно были повышены спонтанное свечение и высота медленной вспышки (на 22% и на 19%, соответственно) (рис.5).

На фоне снижения уровня СРП отмечали уменьшение интенсивности процессов ПОЛ. В группе пациентов с МС, находящейся на диетотерапии, наблюдали снижение МДА в плазме крови через 3 и 6 месяцев (на 23%) относительно фонового уровня, что соответствовало значениям доноров (рис.6). Достоверного изменения содержания остальных продуктов ПОЛ относительно значений доноров и исходного уровня в плазме крови данной группы не регистрировали.

В группе пациентов с МС, находящейся на терапии глюкофажем, через 3 и 6 месяцев лечения наблюдали уменьшение концентрации ДК в плазме крови относительно фоновых значений (в среднем на 34%), МДА и ШО через 6 месяцев терапии (на 21% и 29%, соответственно). Относительно значений доноров регистрировали достоверное увеличение ШО в плазме крови через три месяца терапии (на 11%), содержание остальных продуктов ПОЛ через три и шесть месяцев терапии достоверно не отличались от значений доноров, что свидетельствовало об эффективности проводимой терапии (рис.6).

В группе пациентов с МС, находящейся на терапии омакором, также наблюдали снижение в плазме крови относительно исходного уровня через три 3 месяца терапии ДК и МДА (в среднем на 19%), которые приближались к значениям этих показателей у доноров (рис.6). Содержание ШО в плазме крови данной группы в начале обследования соответствовало значениям доноров и достоверно не менялось в процессе лечения.

В эритроцитах пациентов с МС, получающих рациональное питание и дозированные физические нагрузки, регистрировали достоверное снижение МДА и через 3, и через 6 месяцев лечения (на 22%) (рис.6). Содержание остальных продуктов ПОЛ в данной группе после лечения достоверно не отличалось от таковых у доноров.

В группе, находящейся на терапии глюкофажем, наблюдали уменьшение продуктов ПОЛ в эритроцитах относительно исходного уровня через 3 и 6 месяцев (в среднем на 20% и 28%, соответственно), что статистически не отличалось от величин, определенных у доноров (рис.6).

Рис. 6. Содержание продуктов ПОЛ в крови пациентов с метаболическим синдромом при терапии.

У пациентов с МС, находящихся на терапии омакором, как и в предыдущей группе, также отмечали (в сравнении с исходным фоном) достоверное снижение первичных и вторичных продуктов ПОЛ в эритроцитах через 3 месяца лечения: ДК - на 26% и МДА - на 25% (рис.6). Относительно значений доноров через 3 месяца терапии наблюдали достоверно повышенные концентрации в эритроцитах МДА и ШО (на 18% и 17%, соответственно), что свидетельствует о положительной эффективности проводимой терапии.

Снижение уровня СРП и процессов ПОЛ по мере проведения дието- и фармакотерапии нашло свое отражение и в стабилизации мембран эритроцитов пациентов с МС. Обнаружено снижение содержания ВЭГ в плазме крови относительно фоновых значений через 3 и 6 месяцев в группах, в которых проводилась диетотерапия и лечение глюкофажем (в среднем на 26% и 32%, соответственно) (рис. 7). В большей мере наблюдали снижение содержания ВЭГ в группе пациентов, находящихся на терапии глюкофажем. Через 6 месяцев - на 38%, при этом полученные результаты соответствовали значениям доноров.

В группе пациентов, находящейся на терапии омакором, относительно фонового уровня через 3 месяца регистрировали ймечали снижение ВЭГ на 30%ерез три месяца, наблюдали ВЭГ в плазме крови (на 30%), однако этот показатель остался выше относительно значений доноров на 35% (рис. 7).

Активность СПА в плазме крови во всех группах пациентов МС по мере проведения терапии также снижалась относительно фоновых значений через 3 и 6 месяцев, в среднем на 27% и 34%, соответственно, что превышало значения доноров в среднем на 39% и 25% через 3 и 6 месяцев, соответственно (рис. 7).

Нормализация физико-химических свойств мембран эритроцитов и их стабилизация по мере проведения терапии подтверждается исследованиями структурных параметров мембран эритроцитов с использованием флуоресцентного зонда пирен.

Наиболее выраженные изменения относительно исходных значений наблюдались у пациентов, находящихся на терапии глюкофажем. В данной группе отмечали достоверное увеличение текучести липидного бислоя (Fэ/Fм 334), по сравнению с фоновыми значениями, через 3 и 6 месяцев терапии (на 36% и 38%, соответственно), что соответствовало значениям, полученным у доноров (рис.7). В группе проведения диетотерапии также наблюдали достоверное повышение данного параметра относительно исходного фона через 3 и 6 месяцев (на 27% и 22%, соответственно), статистически не отличавшееся от контроля. В группе пациентов МС, находящейся на терапии омакором, достоверных изменений текучести липидного бислоя относительно фоновых значений и значений доноров не наблюдали.

Повышение текучести аннулярных липидов (Fэ/Fм 282) отмечали при использовании в лечении пациентов с МС как глюкофажа, так и физической нагрузки с диетотерапией (относительно фоновых значений - в среднем на 23% в обеих группах) (рис.7). Данный параметр в группе пациентов, принимавших омакор, относительно фоновых значений и значений доноров через 3 месяца обследования достоверно не менялся.

Степень погружения белков в липидный бислой эритроцитов (F0-F1/F0) при лечении МС как медикаментозными, так и немедикаментозными средствами (диетотерапией) достоверно снизилась относительно исходных значений через 3 месяца - в среднем на 20%, через 6 месяцев - на 29%, статистически не отличаясь от значений доноров.

Помимо этого, в процессе лечения регистрировали достоверное повышение гидрофобности внутренних областей мембраны (F₃₇₂/F₃₉₃ 334) относительно исходного уровня во всех трех группах пациентов с МС (в среднем на 27%) (рис.7), что статистически соответствовало значениям доноров.

Через 3 месяца приема омакора наблюдали достоверное повышение параметра, характеризующего полярность белок-липидных контактов (F₃₇₂/F₃₉₃ 282), в мембранах эритроцитов относительно исходных значений на 16%, что статистически не отличалось от контроля (рис.7). В остальных группах относительно фоновых значений и значений доноров достоверных изменений по данному показателю не выявлено.



Рис.7. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов и уровни ВЭГ и СПА в плазме крови пациентов с метаболическим синдромом через 3 и 6 месяцев терапии.

Таким образом, в исследуемых группах пациентов с МС, находящихся на лечении, происходит стабилизация структурно-функционального состояния мембран эритроцитов с уменьшением их микровязкости, в большей степени в группах, принимавших глюкофаж и находящихся на диетотерапии. В группе пациентов, принимавших омакор, также, хотя и в меньшей степени, происходит нормализация структурных параметров эритроцитарной мембраны.

Рис. 8. Изменение активности антиоксидантной системы в крови пациентов с метаболическим синдромом через 3 и 6 месяцев терапии.

На фоне снижения СРО и стабилизации мембран эритроцитов отмечали уменьшение активности антирадикальных ферментов во всех группах при проведении пациентам различного вида терапии (рис. 8).

Относительно исходного уровня активность ферментов у больных с МС, находящихся на лечении глюкофажем, снижалась следующим образом: СОД в эритроцитах - на 38%, в плазме СУА - на 34%, каталаза - на 40% и ЦП - на 31%. Из всех изученных нами антиоксидантных ферментов в группе проведения диетотерапии наблюдалось уменьшение только активности ЦП через 3 и 6 месяцев лечения на 15% и 22%, соответственно. В эритроцитах данной группы наблюдали снижение активности каталазы через 6 месяцев на 15%. При лечении пациентов с МС омакором (через 3 мес.) значительное снижение относительно исходного уровня установлено в отношении СОД (47%), СУА (31%) и каталазы в плазме крови (24%).

На фоне выше перечисленных изменений после проведения диетотерапии, лечения глюкофажем и омакором, через 3 и 6 месяцев отмечали снижение содержания МСМ, по отношению к исходному уровню. Диетотерапия в сочетании с физическими нагрузками приводила к снижению содержания МСМ относительно исходного уровня при л=210нм на 7% (р<0,05), при л=246нм - на 32% (рис. 9). При лечении глюкофажем МСМ при л=210 снижались на 9% (р<0,01), при л=246 - на 42%.

Рис. 9. Содержание МСМ в плазме крови пациентов с метаболическим синдромом через 3 и 6 месяцев терапии.

В группе терапии омакором через 3 месяца пул МСМ при л=210 уменьшался на 12%, МСМ при л= 280 - на 34%. Данный факт свидетельствует о снижении процессов, в результате которых идет накопление низкомолекулярных соединений, в том числе и эндотоксинов.

Таким образом, экспериментальные и клинические данные, полученные в ходе настоящего исследования, свидетельствуют о том, что одним из важнейших компонентов в развитии МС является активация свободнорадикального окисления, которая параллельно с усилением процессов ПОЛ ведет к дестабилизации структурно-функционального состояния мембран эритроцитов, усилению активности антиоксидантной системы, развитию эндогенной интоксикации и гипоксии, что может являться причиной таких грозных осложнений этого симптомокомплекса, как сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), атеросклероз, сахарный диабет 2-го типа и т.д. Поэтому актуальным является поиск эффективных методов корригирующей терапии МС.

На основании вышеизложенного, еще одной задачей нашего исследования было проведение сравнительного анализа эффективности воздействия на организм диеты, сбалансированной по содержанию жиров и углеводов, в сочетании с дозированными физическими упражнениями и применения препаратов: глюкофажа, повышающего чувствительность инсулинозависимых тканей организма к инсулину, и омакора, содержащего щ3-ПНЖК. В результате исследования было выявлено, что угнетение процессов свободнорадикального окисления, нормализация активности ферментативных и количества неферментативных антиоксидантов, стабилизация структурно-функционального состояния и, как следствие, изменение проницаемости мембран эритроцитов, снижение уровня эндогенной интоксикации являются результатом купирования метаболического синдрома при применении больным дието- и фармакотерапии.

Вероятно, эффективность применения глюкофажа и диеты в сочетании с комплексом физических упражнений имеет ряд общих механизмов, связанных с энергетическим обменом в мышцах. Основная биологическая роль инсулина - энергетическое обеспечение длительной и интенсивной физической нагрузки (Титов, 2005). Количество глюкозы, которое можно при действии инсулина депонировать в форме гликогена, определено, в первую очередь, числом миоцитов, т.е., массой мышечной ткани. Усиление поглощения клетками глюкозы и ее окислительное фосфорилирование требуют кислорода для улучшения оксигенации миоцитов.

Рис.10. Роль окислительного стресса в развитии осложнений при МС.

Обозначение: эNOC - эндотелиальная синтаза оксида азота, ВН₄-тетрагидробиоптерин, NO? -оксид азота, ROS - реактивные кислородные радикалы; О₂я, ООNOя, LOOя, LOя, OHя - кислородосодержащие радикалы, ЛНП - ненасыщенные липопротеиды, СОД - супероксиддисмутаза.

При гипергликемии и гиперинсулинемии миоциты усиливают депонирование глюкозы в форме гликогена, при этом, когда происходит избыточное накопление гликогена в миоцитах, инсулинозависимые транспортеры глюкозы (Глют-4), перемещаясь с мембраны в цитозоль клетки, формируют физиологическую резистентность к инсулину в мышечной ткани. Чувствительность миоцитов к инсулину восстанавливается, как только начинают сокращаться миоциты, происходит активация гликогенолиза и возвращение на мембрану Глют-4 (E.J. Herniksen, 2002). Таким образом, одним из путей преодоления физиологической резистентности к инсулину является усиление функции миоцитов.

Чем больше масса мышечной ткани, чем длительнее и интенсивнее сокращаются миоциты, тем реже наступает функциональная резистентность к инсулину, ниже гипергликемия после еды и меньше глюкозы депонируется в адипоцитах. Повышение скорости утилизации глюкозы в кишечнике в результате действия метформина приводит к снижению ее содержания в крови, тем самым, способствуя снижению ГИ. Одновременно с этим проявляется ингибирующее действие этого препарата на глюконеогенез и гликогенолиз. Уменьшение концентрации инсулина в крови способствует также активации в крови гормончувствительной липазы под влиянием катехоламинов посредством цАМФ-зависимого фосфорилирования, тем самым, усиливая липолиз и угнетая липогенез. В крови восстанавливается нормогликемия, происходит нормализация инсулиновых эффектов: активация фосфатидил-инозитол-3-киназы (PI-3-K) в эндотелиальных клетках и микрососудах, что приводит к экспрессии гена эндотелиальной NO-синтазы и высвобождению NO эндотелиальными клетками и, как следствие, инсулин-обусловленой вазодилатации (Arcaro et al., 2002). При этом улучшается кровообращение, снижается окислительная напряженность организма, что приводит к снижению тканевой гипоксии и интенсивности СРО.

В настоящее время дислипидемию рассматривают как одну из причин смертности от ССЗ. Поэтому наличие у пациентов с МС нарушений углеводного и липидного обмена помещает данную категорию пациентов в группу с высоким и очень высоким риском развития осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы (Ройтберг, 2007). Мембранопротективный эффект щ3-ПНЖК связывают не только с встраиванием их в структуру мембраны, но и с улучшением эндотелиальной функции и уменьшением экспрессии адгезивных молекул (Kris-Etherton et al., 2003). щ3-докозагексаеновая кислота, в отличие от насыщенных жирных кислот, защищает эндотелиальные клетки от воздействия провоспалительных цитокинов и подавляет экспрессию молекул адгезии (Marchiolli, Barzi et al., 2003). В литературе имеются данные, что прием щ3-ПНЖК в дозе 2,4 г в сутки сопровождался достоверным снижением маркеров активации эндотелия: растворимой межклеточной молекулы sICAM-1 и тканевого активатора плазминогена tPA у больных с гиперлипидемией. Кроме того, диета, обогащенная щ3-ПНЖК, достаточно быстро (в течение 19 дней) приводит к восстановлению содержания их как в плазме крови, так и в мембранах эритроцитов (Endres, Ghorbani et al., 2000).

Следует отметить, что для поступления в организм нужного количества щ3-ПНЖК необходим регулярный прием нескольких капсул, содержащих рыбий жир, при этом увеличивается общее потребление как ненасыщенных, так и насыщенных ЖК. В условиях недостатка естественных антиоксидантов избыток ПНЖК может приводить к усилению процесса переокисления, образованию свободных радикалов, что повышает угрозу атерогенеза и канцерогенеза (Reis, Boucher, Pastemak, 2005). Восполняя недостатки препаратов, содержащих рыбий жир, в состав омакора помимо 1г концентрата щ3-ПНЖК входит 4 мг витамина Е. Помимо этого, щ3-ПНЖК являются предшественниками преимущественно эйкозанойдов и других веществ с противовоспалительными свойствами.

Таким образом, все проанализированные нами способы лечения оказывали нормализующее действие на активность свободнорадикального окисления, приводили к восстановлению баланса в системе про- и антиоксиданты, способствовали улучшению физико-химических свойств эритроцитарных мембран. В конечном итоге. происходило обратное развитие системных нарушений, характерных для МС: нормализация веса тела, повышение чувствительности тканей к инсулину, снижение артериального давления.

Проводя сравнительный анализ эффективности различных подходов к коррекции системных нарушений с МС, мы столкнулись с проблемой - равнозначен ли вклад каждого из изучаемых параметров в поддержание здоровья, есть ли необходимость в изучении такого большого количества параметров и если нет, то как выбрать оптимальное их количество. На сегодняшний день эталон лечения МС выглядит как 5-этажная пирамида, основание которой составляет изменение образа жизни (борьба с гиподинамией, гипокалорийная диета и т.д.); на нем базируется медикаментозная коррекция основных компонентов МС: инсулинорезистентности и гиперинсулинемии, артериальной гипертензии, ожирения и нарушения липидного обмена.

На основании полученных результатов исследования в группах терапии глюкофажем достигнуто наибольшее число достоверно положительных изменений, при этом терапия омакором также приводит к положительным изменениям значительного количества параметров и уступает глюкофажу по терапевтическому эффекту только за счет непродолжительного времени лечебного воздействия на организм пациентов с МС (3 мес.). Возможно, наиболее полный терапевтический эффект можно получить при сочетании корригирующего воздействия на организм пациентов с МС с выраженными нарушениями углеводного и липидного обменов как препарата, снижающего резистентность тканей к инсулину, так и препарата, содержащего щ-3ПНЖК, одновременно с проведением диетотерапии и комплекса физических упражнений.

ВЫВОДЫ

1. При метаболическом синдроме повышается активность свободнорадикального окисления, что приводит к накоплению продуктов ПОЛ в крови больных.

2. При метаболическом синдроме активность ферментов антиоксидантной защиты - СОД в эритроцитах (СУА в плазме крови), каталазы и церулоплазмина в гемолизате и плазме крови пациентов, а также содержание неферментативных антиоксидантов - мочевины и мочевой кислоты в плазме крови больных повышены.

3. Дестабилизация мембран эритроцитов при метаболическом синдроме проявляется повышением микровязкости, увеличением проницаемости и повышением содержания внеэритроцитарного гемоглобина в плазме крови.

4. Важным звеном развития метаболического синдрома является эндогенная интоксикация, которая сопровождается накоплением молекул средней массы в плазме крови и начальных признаков гипоксии, о чем свидетельствует повышение уровня лактата и ксантина в эритроцитах и цельной крови больных.

5. Включение диеты, глюкофажа и омакора в комплексное лечение пациентов с метаболическим синдромом приводит к восстановлению прооксидантно - антиоксидантного равновесия, ингибированию свободнорадикального окисления в крови, нивелированию эндогенной интоксикации, а также способствует стабилизации структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Попова Т.П. Активность свободнорадикального окисления и структурное состояние мембран эритроцитов у пациентов с метаболическим синдромом / Крайнова Н.Н., Внуков В.В. // В мат. ЙЙЙ всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Медико-фармацевтический журнал «Сибирский консилиум». - Новосибирск. - 2007. - №7(62). - С.130. - 0,05 п.л., - личный вклад 80%.

2. Волкова Н.И. Сравнительный анализ эффективности различных видов терапии в лечении метаболического синдрома / Волкова Н.И., Сафроненко В.А., Крайнова Н.Н., Попова Т.П. // В мат. XV российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2008. С.70-71. 0,05 п.л., - личный вклад 50%.

3. Попова Т.П. Свободнорадикальные процессы и их регуляция при метаболическом синдроме и его коррекция / Сафроненко В.А., Крайнова Н.Н., Волкова Н.И. // В мат. научно-практического симпозиума с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия». Приложение 1 к журналу «Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области», Волгоград, 2008. С.23.0,05 п.л., - личный вклад 80%.

4. Сафроненко В.А. К вопросу о первичной и вторичной профилактике сахарного диабета 2 типа / Сафроненко В.А., Волкова Н.И., Крайнова Н.Н., Попова Т.П. // В.мат. ЙV всероссийского диабетологического конгресса. Москва, 2008. С.71. 0,05 п.л., - личный вклад 50%.

5. Попова Т.П. Структурное состояние мембран эритроцитов с метаболическим синдромом / Сафроненко В.А., Крайнова Н.Н., Волкова Н.И. // В.мат. ЙV-го всероссийского диабетологического конгресса. Москва, 2008. С.359. 0,05 п.л., - личный вклад 80%.

6. Попова Т.П. Интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы при лечении метаболического синдрома / Крайнова Н.Н., Внуков В.В. // В мат. ЙЙ-й международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины». Ростов-на-Дону, 2008. С.107-108.0,05 п.л., - личный вклад 80%.

7. Попова Т.П. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при лечении метаболического синдрома / Крайнова Н.Н., Внуков В.В. // В мат. ЙЙ-го съезда физиологов СНГ «Научные труды», Кишинев, 2008. С.154-155. 0,05 п.л., - личный вклад 80%.

8. Попова Т.П. Активность процессов ПОЛ и структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов у пациентов с инсулинорезистентностью / Сафроненко В.А., Крайнова В.А., Внуков В.В., Волкова Н.И. // В мат. 69 научно-практической конференции студентов и молодых ученых саратовского государственного медицинского университета: «Молодые ученые - здравоохранению региона», Саратов, 2008. С.193. 0,05 п.л., - личный вклад 80%.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ артериальная гипертензия

АОС антиоксидантная система

АФК активные формы кислорода

ВЭГ внеэритроцитарный гемоглобин

ГИ гиперинсулинемия

ДК диеновые коньюгаты

ЖК жирные кислоты

ИР инсулинорезистентность

МДА малоновый диальдегид

МС метаболический синдром

МСМ молекулы средней массы

НЭЖК неэтерефицированные жирные кислоты

ПВК пировиноградная кислота

ПНЖК полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ перекисное окисление липидов

СОД супероксиддисмутаза

СПА суммарная пероксидазная активность

СРО свободнорадикальное окисление

ССЗ сердечно-сосудистые заболевания

СУА супероксидустраняющая активность

ХЛ хемилюминесценция

ЦП церулоплазмин

ШО шиффовы основания

Размещено на Allbest.ru

...