Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

Влияние режима удлинения голени собак на состояние суставного хряща наружного мыщелка бедра (экспериментально-морфологическое исследование)

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Ступина Татьяна Анатольевна

Астрахань - 2007

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки “Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию”, Курганском филиале Южно-Уральского научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук Щудло Михаил Моисеевич,

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Молдавская Анна Аркадьевна

кандидат биологических наук, доцент Романова Татьяна Петровна

Ведущее учреждение: Тюменская государственная медицинская академия Росздрава

Защита диссертации состоится « 4 » мая 2007 г. на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

C диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета

Автореферат разослан 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Нестеров Ю.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболевания суставов становятся одной из наиболее значимых проблем во всём мире. Их распространённость остро ставит вопрос о необходимости изучения особенностей перихондрального хондрогенеза и регенерации в разных условиях, адекватной оценки репаративных потенций хряща и разработки методов восстановительного лечения. Эти проблемы привлекают внимание ведущих клиницистов и морфологов [Павлова В.Н., с соавт., 1988; Шумада И.В., 1990; Лаврищева Г.И., 2002; Беллендир Э.Н., Ариэль Б.М., 2005; Ljung A. et al., 1999; Cohen Han et al., 2000; Dounchis J.S., 2001 и др.].

В последние десятилетия для лечения больных с повреждениями и заболеваниями опорно-двигательной системы стали широко применять аппараты внешней фиксации. В вопросах удлинения конечностей важное место занимает проблема сохранения функциональных возможностей суставов. Патологические изменения суставного хряща, в том числе при использовании метода управляемого чрескостного остеосинтеза, нередко осложняют лечение ортопедо-травматологических больных [Шевцов В.И., с соавт., 1998, 2000].

Реакция суставов при удлинении конечностей аппаратом Илизарова отмечалась в клинике многими авторами [Дьячкова Г.В., 1982; Калякина В.И. с соавт., 1988; Шевцов В.И., Попков А.В., 1998; Herzenberg J.E. et al., 1994; Maffulli N., 2001]. По мнению исследователей, в процессе дистракционного остеосинтеза сустав подвергается действию комплекса факторов, однако значение каждого из них еще не получило полной теоретической оценки. Вынужденное ограничение функции удлиняемой конечности сопровождается изменением распределения нагрузки на суставные поверхности, изменением состояния периферических нервов, сосудистого русла, что влечет нарушение трофических процессов в костной ткани и элементах сустава [Дьячкова Г.В., 1982; Стецула В.И., Мороз Н.Ф., 1990; Грачева Л.И., 1992; Шевцов В.И. с соавт., 1999; Стецула В.И., Веклич В.В., 2003].

При дозированном удлинении сегмента конечности на 30% с темпом 1,0 мм за 2 приема и 0,75 мм за 1 прием были выявлены деструктивные изменения смежных суставов: истончение, разволокнение суставного хряща, снижение интенсивности метахромазии межклеточного вещества, в части наблюдений выявлены некротические изменения [Stanitski D.F., 1994; Stanitski D.F. et al., 1996; Nakamura E. et al., 1993, 1995; Fink B. et al., 2001]. Авторы предположили, что глубина изменений суставного хряща зависит от длительности периода дистракции и фиксации конечности в аппарате. По мнению E.Nakamura, H.Mizuta, K.Takagi (1995), повышение дробности удлинения может предотвратить повреждения хрящей смежных суставов.

При повышении дробности дистракции и, соответственно, малой величине разового удлинения активируется остеогенез и адаптационный рост мягкотканных структур, минимальны их дистрофические изменения [Шрейнер А.А. с соавт., 1999].

В последнее десятилетие внедрен ряд новых методик оперативного удлинения конечностей, в том числе с применением высокодробной дистракции в автоматическом режиме [Шевцов В.И. с соавт., 1998; 1999], что позволило снизить травматичность хирургической коррекции длины конечностей и приблизить адаптивные реакции тканей на растяжение к процессам естественного роста [Илизаров Г.А. с соавт., 1982; Шевцов В.И. с соавт., 1996; Шевцов В.И., Попков А.В., 1998].

Дальнейшее развитие этого направления требует изучения состояния физиологических резервов, резистентности и адаптивности тканей удлиняемой конечности в зависимости от режима дистракции, в том числе адекватной оценки реактивных изменений и репаративных потенций суставного хряща.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение особенностей структурно-функционального реагирования и восстановления суставного хряща наружного мыщелка бедра при разных режимах удлинения голени.

Для достижения цели были поставлены задачи:

1. Изучить динамику морфофункциональных изменений суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени с темпом 1,0 мм при: а) 60-кратной и б) 8-кратной дробности.

2. Исследовать реактивные изменения клеточных элементов суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени с целью определения градаций их зрелости и регенераторных потенций.

3. Провести сопоставительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща наружного мыщелка бедра при разных режимах удлинении голени и у интактных собак.

4. Разработать способы объективной количественной оценки состояния суставного хряща наружного мыщелка бедра на разных (органном, тканевом, клеточном) уровнях структурной организации в условиях удлинения смежного сегмента конечности.

Научная новизна. Впервые на достаточном экспериментальном материале с применением современных методов световой и электронной микроскопии, компьютерной морфо-, стереометрии проведено гистологическое исследование суставного хряща наружного мыщелка бедра в процессе удлинения голени при дробных режимах ручной и автоматической дистракции. Разработаны способы объективной оценки состояния суставного хряща на разных (органном, тканевом, клеточном) уровнях структурной организации. Разработана и адаптирована к объекту исследования технология изготовления гистологических препаратов, позволяющая проводить комплексные количественные исследования цифровых изображений. Определены градации зрелости и признаки регенерации хрящевых клеток (ядерно-цитоплазматический индекс, количество и численный состав изогенных групп), что позволило выявить потенциальные возможности клеточных элементов и хряща в целом. Получена новая информация о влиянии на состояние суставного хряща разных режимов дистракции и даны теоретические обоснования о возможности использования этих режимов в клинической практике.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований служат основой для разработки щадящих методик дистракционного остеосинтеза, учитывающих состояние смежных с удлиняемым сегментом конечности суставов и направленных на профилактику развития в них патологических процессов. Разработанная и адаптированная к объекту технология изготовления гистологических препаратов, позволяющая проводить количественное исследование с применением компьютерных технологий, может быть использована в научно-клинических и экспериментально-морфологических подразделениях при диагностике суставной патологии и количественном исследовании реактивности и пластичности суставного хряща в разных экспериментальных условиях. Некоторые положения диссертации относятся к фундаментальным и представляют теоретический интерес.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной конференции молодых ученых «Медицина в XXI веке: эстафета поколений» (г.Курган, 13-15 июня, 2001 г.), областной научно-практической конференции «IV Зауральский фестиваль научно-исследовательского, технического и прикладного творчества молодежи и студентов Курганской области» (г.Курган, 30 мая, 2002 г.), Международной конференции «Информационные технологии и системы: наука и практика» (г.Владикавказ, 26 октября, 2002 г.), Всероссийской конференции «Молодые ученые медицине» (г.Самара, 25-26 сентября, 2003 г.), Всероссийской научной конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях» (г.Оренбург, 18-20 октября, 2003 г.), Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей» (г.Санкт-Петербург, 8-9 апреля, 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Морфо-функциональные аспекты регенерации и адаптационной дифференцировки структурных компонентов опорно-двигательного аппарата в условиях механических воздействий» (г.Курган, 20-21 октября, 2004 г.), заседании научного общества ортопедов-травматологов ФГУН «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Росздрава» (г.Курган, ноябрь, 2004 г.), научно-практической конференции с международным участием «От фундаментальных исследований - к прогрессу в медицине» (г.Харьков, 17-18 января, 2005 г.), Всероссийской молодежной конференции «Физиология и медицина» (г.Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005 г.), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые: новые идеи и открытия» (г.Курган, 14-16 июня, 2006 г.).

Реализация результатов исследования. Результаты проведённых исследований используются при выполнении плановых научно-исследовательских работ в ФГУН «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова Росздрава», в ПНИЛ “Управляемые гисто- и органогенезы” Курганского филиала Южно-Уральского научного центра РАМН, включены в программу кафедры травматологии и ортопедии ФПК и ППС Тюменской государственной медицинской академии. Публикации. По теме диссертации опубликовано десять научных работ, из них три статьи в рецензируемых журналах. Оформлено одно рационализаторское предложение «Метод количественной оценки метахромазии в цифровых изображениях гистохимических препаратов суставного хряща» (удостоверение №29/2003 г. РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изменения суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности зависят от величины разового удлинения. Регенерация суставного хряща в данных условиях эксперимента осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов.

2. Высокодробная автодистракция позволяет снизить травматизацию смежных суставов и обеспечивает лучшие условия для восстановления структуры суставного хряща по сравнению с ручным режимом.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста (без приложения). Состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов. Работа содержит 76 иллюстраций, 10 таблиц (не считая таблиц приложения). В списке литературы 215 наименований, из них отечественных авторов - 152, зарубежных - 63. Приложение включает 1 таблицу.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 24 взрослых беспородных собаках I категории (высота голени 18-21 см) в возрасте 2-3 лет с массой тела 18-25 кг, из них 5 интактных составили контрольную серию, а остальные 19 животных - 2 опытных серии. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли согласно приказу МЗ СССР № 755 1977 г. Через 5 дней после закрытой флексионной остеоклазии у всех опытных животных начинали дозированное удлинение правой голени аппаратом Илизарова на одинаковую величину - 28 мм, но в разных режимах (табл. 1). Период дистракции в обеих сериях составил 28 дней. В 1-й серии удлинение достигали с помощью автоматического дистрактора со скоростью 1 мм за 60 приемов (величина разового удлинения 0,016 мм), во 2-й серии - путем ручного поворота гаек на резьбовых стержнях аппарата со скоростью 1 мм за 8 приемов (величина разового удлинения 0,125 мм).

Таблица 1. Характеристика экспериментальных серий

После прекращения дистракции костные фрагменты фиксировали аппаратом до формирования корковой пластинки в регенерате, затем аппарат снимали и животных наблюдали еще в течение месяца. Оперативные вмешательства выполняли под тиопенталовым внутривенным наркозом, животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов. Морфологическое исследование проводили на этапах эксперимента: через 28 дней дистракции, 30 дней фиксации и 30 дней после снятия аппарата.

Результаты эксперимента оценивали на макро- и микроскопическом уровнях. Были использованы следующие методы: клинико-экспериментальный, анатомический, гистологический, гистохимический, метод компьютерной морфо- и стереометрии, статистический, метод сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского электронно-зондового микроанализа.

Регистрировали функциональное состояние оперированной конечности. Суставные поверхности оценивали макроскопически (форма, контур, цвет). Изображения макропрепаратов оцифровывали и анализировали на аппаратно-программном комплексе «ДиаМорф» (Москва).

Для морфологического исследования на светооптическом уровне часть материала обрабатывали по общепринятым гистологическим методикам. Целлоидиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по ван Гизону. Часть материала фиксировали в смеси 2% параформальдегида, 2% глютаральдегида и 0,1% пикриновой кислоты на фосфатном буфере при рН 7,4, постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия с добавлением 1,5% красной кровяной соли, дегидратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в аралдит, при этом для получения репрезентативных препаратов с учетом резко выраженной вертикальной анизоморфии суставного хряща кусочки ориентировали так, чтобы плоскость среза была перпендикулярна суставной поверхности. Полутонкие срезы толщиной 1,0 мкм готовили на ультратоме "Nova" фирмы LKB (Швеция). Микропрепараты окрашивали метиленовым синим или метиленовым синим-основным фуксином (по Уикли), исследовали на фотомикроскопе фирмы "Оpton" при увеличениях 80х; 200х; 500х, 1250х, наиболее интересные поля зрения фотографировали и/или оцифровывали. При описании микропрепаратов использовали деление суставного хряща на 3 зоны: поверхностная, промежуточная (средняя) и глубокая (базальная) [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Семченко В.В. с соавт., 1999]. На полутонких срезах ставили ШИК-реакцию на гликоген и гликопротеиды [Авцын А.П. с соавт., 1971], для выявления гликозаминогликанов применяли тиазиновый краситель - метиленовый синий [Кононский А.И., 1976; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Реакции проводили в максимально одинаковых условиях, все препараты (полутонкие срезы) окрашивали одновременно в одной порции красителя.

При проведении морфо- и стереометрических исследований суставного хряща учитывали:

1) его ориентацию, 2) толщину среза, 3) способ получения репрезентативной выборки. Универсальными для определения количественных характеристик структур суставного хряща являются полутонкие срезы толщиной 0,5-1 мкм; однако их малая - до 1 мм² - стандартная площадь затрудняет получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Чтобы преодолеть указанное противоречие, мы разработали и апробировали в повседневной практике ряд технических приемов, позволивших увеличить площадь одномикронных полутонких срезов до 4-8 мм²:

- применение специального режима проводки материала (увеличение сроков экспозиции и дополнительная пропитка в смоле с катализатором при комнатной температуре);

- площадь основания пирамидки при ее высоте до 1,0 мм должна быть как минимум в 4 раза больше площади среза, что позволяет избежать вибрации блока и образования механических дефектов на срезах при ультратомировании;

- тщательный контроль качества и отбор стеклянных ножей, либо использование алмазного ножа с достаточной длиной режущей кромки;

- применение специальных приемов фиксации срезов к предметному стеклу [Щудло М.М., 1982] для предотвращения появления при окраске неровностей и складок из-за различных биомеханических свойств тканевых составляющих исследуемых объектов.

Использование полученных по описанной технологии полутонких срезов большой площади позволило оцифровывать достаточное количество качественных изображений для формирования репрезентативной выборки и получать достоверные количественные характеристики объекта, пренебрегая эффектом Холмса. Стереологический анализ проводили по сериям полутонких (0,5-1,0 мкм) срезов, исследовали каждый 20-ый срез. Систематический ввод полей зрения рядами, ориентированными строго по длиннику среза, обеспечивал получение наиболее репрезентативной выборки. Выборку формировали тотально, при этом количество анализируемых структур, целиком попавших в поле зрения, оказывается максимальным. Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра. Изображения хряща при увеличении 80 оцифровывали на АПК «ДиаМорф» (Россия) в программе «Color». В программе «DiaMorph-Medias» по специально разработанному макросу на оцифрованных изображениях определяли толщину (h, мкм) хряща. На оцифрованных изображениях при увеличениях 500, 1250 с помощью этой же программы по специально разработанному макросу подсчитывали число следов хондроцитов, площади их и межклеточного вещества в поле зрения. В изображениях каждого поля зрения подсчитывали число следов всех хондроцитов, число двух- и четырехчленных изогенных групп. Рассчитывали численную плотность (NA - число структур в единице площади среза, с размерностью мкм^-2) всех хондроцитов (NA_хц), численную плотность клеток в составе изогенных групп - пролиферировавших хондроцитов (NA_пхц) и величину их пула (ВППхц) - выраженное в процентах отношение NA_пхц/NA_хц. Пролиферативную активность клеток оценивали косвенно по результату пролиферации - количеству изогенных групп, поэтому использовали название параметра в прошедшем времени «численная плотность пролиферировавших хондроцитов». Производили цито-, кариометрию, на основании чего определяли расчетные величины, такие как объемная плотность ядра (VV_ядр, в долях единицы), объемная плотность цитоплазмы (VV_цит, в долях единицы), ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ) VV_ядр/ VV_цит, определяли максимальный (d_max, мкм) и минимальный (d_min, мкм) диаметры, фактор формы (F_f, в долях единицы) клетки и ядра.

Для исследования рельефа суставной поверхности, фиксированные в альдегидном фиксаторе кусочки промывали в дистиллированной воде. Затем материал дегидратировали в спиртах, пропитывали в камфене (3,3-диметил-2- метиленбицикло[2,2,1] гептан) высушивали на воздухе, напыляли алюминием, медью или серебром в вакуумном напылителе «JEE-4 Х/5 В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония) и изучали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония).

Для рентгеновского электронно-зондового микроанализа поверхности эпоксидных блоков напыляли алюминием, медью или серебром и исследовали на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе «INKA Energy 200» (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированном на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония), при ускоряющем напряжении 20 кэВ. Определяли распределение и концентрацию кальция, фосфора и серы в суставном хряще наружного мыщелка бедра в различные периоды чрескостного дистракционного остеосинтеза. На всех этапах работы соблюдали одинаковые условия эксперимента и обработки материала по методикам.

Анализ цифрового материала был проведен общепринятыми для медико-биологических исследований методами вариационной и непараметрической статистики. Достоверность различий оценивали в программе Microsoft Excel 97 (программное обеспечение AtteStat, версия 1.0, Гайдышев И.П., 2003), в зависимости от характера распределения и объема выборок использовали критерий Вилкоксона, критерий Стьюдента. Первичный материал и результаты его обработки архивировали в базы данных разного уровня: оперативный архив формировали на жестком диске компьютера, тактический и стратегический - на компакт-дисках (СD-RW и СD-R соответственно). По нашему опыту, такая трехуровневая система необходима и достаточна для сохранности информации, и, в то же время, обеспечивает условия для текущего и ретроспективного анализа данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Гистоморфометрические характеристики суставного хряща интактных собак

При макроскопическом исследовании толщина хряща, покрывающего наружный мыщелок бедренной кости, не изменена, суставные поверхности гладкие, блестящие, жемчужно-белого цвета. При изучении в СЭМ рельеф поверхности суставного хряща имел регулярную волнистость и соответствовал описанной в литературе интактной суставной поверхности мыщелков бедренной кости. Результаты количественного исследования показали, что основные количественные изменения хондроцитов по мере удаления от поверхности заключались в увеличении размеров клеток и их ядер (табл. 2).

Таблица 2. Количественные характеристики хондроцитов (мm) суставного хряща интактных животных

Рис. 7. Динамика численной плотности (мкм^-2) хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща на этапах эксперимента, * - достоверные отличия между контролем и опытными сериями при p<0,05.

Компенсаторно-приспособительные процессы выражались и повышением биосинтетического потенциала клеточной популяции суставного хряща. Во всех сериях хондроциты неповрежденных участков поверхностной зоны отличались большими размерами, округлой формой, отсутствием признаков вакуольной дистрофии. Межтерриториальный матрикс был гомогенен, выявлена интенсивная метахромазия территориального матрикса промежуточной и глубокой зон.

При количественном исследовании на клеточном уровне наиболее ярко выражены изменения хондроцитов неповрежденных участков поверхностной зоны. В обеих экспериментальных сериях на протяжении всего эксперимента в неповрежденных участках выявлено снижение ядерно-цитоплазматического индекса в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром, наиболее выраженным в 1-й серии (рис. 8).

Во 2-й серии к концу эксперимента ядерно-цитоплазматический индекс приближался к контрольным значениям.

Рис. 8. Динамика ядерно-цитоплазматического индекса хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща наружного мыщелка бедра на этапах эксперимента.

Судя по увеличению фактора формы и минимального диаметра, клетки округлялись. Во всех сериях на протяжении всего эксперимента минимальный диаметр клеток превышал норму. Максимальные значения данного параметра выявлены в 1-й серии на этапах дистракции и фиксации (рис. 9).

Рис. 9. Динамика минимального диаметра хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща наружного мыщелка бедра на этапах эксперимента.

К концу эксперимента в 1-й и 2-й сериях наблюдалось снижение анализируемого параметра относительно предыдущих сроков. Известно, что функционально активные клетки больше по размерам и имеют округлую форму [Хэм А., Кормак Д, 1983; Данилов Р.К. с соавт., 2000]. Полученные данные свидетельствовали об активно развивающихся процессах внутриклеточной регенерации (гипертрофии, гиперплазии структурных компонентов), усилении биосинтетических процессов - синтезе компонентов межклеточного вещества.

Максимальные количественные характеристики клеток промежуточной и глубокой зон в 1-й и 2-й сериях выявлены в срок 30 дней фиксации (рис. 10).

Рис. 10. Динамика минимального диаметра клеток и их ядер в промежуточной зоне суставного хряща на этапах эксперимента.

Известно, что увеличение размеров ядер коррелирует с усилением белкового синтеза или с содержанием ДНК [Данилов Р.К. с соавт., 2000]. Увеличение параметров, характеризующих размер и форму клеток и их ядер, свидетельствовало об усложнении структуры хондроцитов, усилении биосинтетической и пролиферативной активности. По мнению ряда авторов, увеличение числа активно продуцирующих клеток, способных создавать новые участки матрикса - основной источник восстановительных процессов в суставном хряще [Павлова В.Н. с соавт., 1988; Котельников М.Г., 2003; Лаврищева Г.И. с соавт., 1996, 2002; Данилов Р.К. с соавт., 2004; Newman A.P., 1998]. Оба процесса тесно взаимосвязаны, и именно этим определяется и пролиферация, и дифференцировка, и жизнеспособность восстанавливающегося хряща [Павлова В.Н., с соавт., 1988].

Во 2-й серии в промежуточной и глубокой зонах на этапах дистракции и через месяц после снятия аппарата ядерно-цитоплазматический индекс был выше нормы. При светооптическом исследовании полутонких срезов именно в этих зонах хряща наряду с высокодифференцированными были обнаружены клетки менее дифференцированные, которые имели небольшие размеры, крупное округлой формы ядро, меньший объем цитоплазмы и небольшое количество гликогена. Присутствие таких клеток, вероятно, является отражением их дедифференцировки и восстановления пролиферативных потенций. Известно, что дедифференцировка, как реактивно-приспособительное изменение клеток, сопровождается увеличением относительных объемов ядер [Мяделец О.Д., 2002; Данилов Р.К. с соавт., 2004].

По данным литературы при суставной патологии выявлено снижение количественных характеристик хрящевых клеток: уменьшаются размер и фактор формы клеток [Кормильченко В.В. с соавт., 2002; Редько К.Г. с соавт., 2002].

Полученные нами данные свидетельствовали о достаточно высокой степени выраженности компенсаторных реакций хрящевой ткани наружного мыщелка бедра в данных условиях удлинения голени.

При гистохимическом исследовании гликозаминогликанов в обеих сериях интенсивность реакции усиливалась по направлению от поверхностной зоны к субхондральной кости. Электронно-зондовый микроанализ подтвердил вышеописанное распределение. Концентрация серы увеличивалась от поверхностной зоны к глубокой. Окраска основными красителями выявляла ослабление интенсивности базофилии межклеточного вещества поверхностной зоны. Метахромазия выявлялась лишь в участках разволокнения на поверхности коллагеновых волокон и наиболее была выражена во 2-й серии. В промежуточной и глубокой зонах ортохроматически окрашенные участки соседствовали с обширными слабо метахроматичными полями, выявлена интенсивная метахромазия территориального матрикса. Полученные данные согласуются с результатами исследований DF. Stanitski (1994), DF. Stanitski с соавт. (1996), E. Nakamura с соавт. (1995), S.C. Hung с соавт. (1997).

К концу дистракции методом электронно-зондового микроанализа выявлено снижение концентрации серы в обеих сериях эксперимента по сравнению с интактным хрящом. Через месяц фиксации наблюдалась тенденция к увеличению исследуемого параметра относительно предыдущего срока, относительно контроля концентрация серы снижена в 1-й и 2-й сериях на 48% и 46% соответственно. Динамика концентрации кальция на этапах эксперимента выглядела следующим образом: к концу дистракции в обеих сериях концентрация кальция незначительно превышала контрольные значения. Через месяц фиксации наблюдалось дальнейшее увеличение исследуемого параметра, наиболее выраженное в поверхностной и промежуточной зонах.

H.I. Roach et al. (1995), Y. Ischikawa, L.N.Y. Wu, B.R. Genge (1997) И H.S. Cheung, L.M. Ryan (1999) обнаружили, что апоптотические тела, происходящие из хондроцитов, продуцируют осаждаемый кальций. По данным биохимических исследований увеличение кальция объясняется накоплением гликановым компонентом протеогликанов анионных групп, которые улавливают и связывают кальций субхондральной кости [Десятниченко К.С. с соавт., 1999; Попков А.В. с соавт., 2001]. К концу эксперимента концентрация кальция в обеих сериях превышала контроль, максимальные значения отмечены во 2-й серии, что вероятно обусловлено более выраженной деструкцией протеогликанового компонента (разволокнением межклеточного вещества). И в 1-й, и во 2-й сериях фосфор в некальцифицированном хряще не обнаружен.

Интенсивность деструктивных процессов была выше во 2-й серии что, вероятно, связано с большей (величина разового удлинения - 0,125 мм), чем при автодистракции (величина разового удлинения - 0,016 мм), величиной одномоментного удлинения, в следствии чего, у животных этих серий наблюдалось более выраженное снижение двигательной активности. Установлено, что при снижении двигательной активности происходит изменение величины и периодичности циклических нагрузок на суставной хрящ и неизбежное нарушение диффузионно-нагрузочного механизма снабжения его трофическими и пластическими веществами [Стецула В.И., Веклич В.В., 2003]. Возможность и степень восстановления суставной поверхности иллюстрируют данные, полученные через месяц после снятия аппарата. Возврат к двигательному стереотипу способствовал восстановлению структуры суставного хряща. В 1-й серии репаративная регенерация по типу реституции завершается формированием суставной поверхности, приближающейся по структуре к интактной - с восстановлением гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны и толщины хряща. Количественный анализ на тканевом уровне выявил, что у животных 2-й серии в период дистракции и фиксации конечности в аппарате уменьшение толщины хряща происходило в меньшей степени, чем в 1-й серии (рис. 11), что вероятно, обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного вещества поверхностной зоны. При этом возникает набухание основного вещества и коллагеновых волокон в результате накопления и перераспределения гидрофильных гликозаминогликанов, дающих реакцию метахромазии [Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981].

Рис. 11. Динамика толщины суставного хряща наружного мыщелка бедра на этапах эксперимента, *** - достоверные отличия между контролем и опытными сериями при p<0,001.

Во 2-й серии регенерация суставного хряща имела незавершенный характер. В части наблюдений выявлены небольшие участки, в которых отсутствовала бесклеточная пластинка, определялись вскрытые клеточные лакуны, признаков разволокнения межклеточного вещества не обнаружено.

Заключение

В обеих экспериментальных сериях при удлинении смежного сегмента конечности в суставном хряще развивались разнохарактерные процессы: деструктивные, дегенеративые, репаративные и обратимые реактивные изменения. Степень выраженности изменений в суставном хряще различна при изученных режимах дистракции и зависит от дробности дистракции - величины разового удлинения. О включении механического компонента в патогенез свидетельствует локализация деструктивного процесса в участках высокой нагрузки. Сканирующая электронная микроскопия и светооптическое исследование полутонких срезов выявили, что деструктивные изменения суставного хряща при данных условиях эксперимента имеют очаговый характер и проявляются утратой бесклеточной пластинки, разволокнением поверхностной зоны хряща, гибелью и деструкцией части хондроцитов поверхностной и глубокой зон. Наблюдаемые изменения сопровождаются снижением толщины хряща, численной и объемной плотности клеток поверхностной и глубокой зон, концентрации серы. Наиболее интенсивно деструктивные изменения выражены при 8-кратной дробности дистракции, выявлено увеличение частоты встречаемости участков разволокнения в поверхностной зоне и нарушение целостности базофильной линии.

Морфологические изменения клеток можно разделить на два вида. Первый - это гибель и деструкция клеток, расположенных в очагах разволокнения. Второй вид изменений - реактивные, клетки, неповрежденных участков становились округлыми, увеличивались их размеры, признаков дегенерации или деструкции в таких клетках не отмечено.

Репаративная регенерация суставного хряща осуществлялась за счет механизмов, лежащих в основе его роста и физиологической регенерации - интерстициального роста - пролиферативных и биосинтетических процессов, за счет которых происходит увеличение объема матрикса суставного хряща. Выраженность процессов пролиферации и биосинтеза в суставном хряще при разных режимах дистракции различна и зависит от степени повреждения. При 8-кратной дробности дистракции в суставном хряще более выражены пролиферативные процессы: выявлены максимальные значения пула пролиферировавших хондроцитов, численной плотности клеток промежуточной зоны; при 60-кратной - биосинтетические: выявлены максимальные значения параметров, характеризующих размер и форму клеток, более выражено снижение ядерно-цитоплазматического индекса.

Полученные данные о компенсаторно-приспособительных процессах хрящевой ткани согласуются с литературными [Модяев В.П., 1983; Павлова В.Н. с соавт., 1988; Мажуга П.М., 1999; Лаврищева Г.И. с соавт., 2002; Mankin H.I., 1982; Hesse J., 1989; Caplan A.I. et al., 1997; Newman A.P., 1998; Hunziker E.B., 2002]. Регенерационный гистогенез растущих тканей (к которым относится хрящевая ткань) включает процессы, как клеточной пролиферации, так и внутриклеточных биосинтезов сопровождающихся увеличением объема клетки [Данилов Р.К. с соавт., 2004].

При автодистракции восстановление суставного хряща протекает более интенсивно. К концу эксперимента репаративная регенерация по типу реституции завершалась восстановлением толщины хряща и формированием суставной поверхности приближающейся по структуре к интактной.

При удлинении конечности со скоростью 1 мм за 8 приемов (ручные подкрутки) регенерация суставного хряща к сроку 30 дней без аппарата имела незавершенный характер, в части наблюдений выявлены небольшие участки, в которых отсутствовала бесклеточная пластинка, определялись вскрытые клеточные лакуны, признаков разволокнения межклеточного вещества не обнаружено.

Примененная технология компьютерной морфо- и стереометрии по полутонким срезам большой площади позволила получить объективную информацию о степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности. Выполненное исследование расширяет и углубляет имеющиеся представления об особенностях структурно-функционального реагирования и восстановления суставного хряща наружного мыщелка бедра в зависимости от режима удлинения смежного сегмента конечности.

1. При удлинении голени в суставном хряще наружного мыщелка бедра выявлены структурно-функциональные изменения реактивного и/или деструктивно-репаративного характера, степень которых зависит от величины разового удлинения.

2. Деструктивные изменения суставного хряща при данных условиях эксперимента имеют очаговый характер и проявляются утратой бесклеточной пластинки, разволокнением поверхностной зоны хряща, гибелью и деструкцией части хондроцитов поверхностной и глубокой зон, снижением толщины хряща, численной и объемной плотности клеток поверхностной и глубокой зон, концентрации серы. Более интенсивно деструктивные изменения выражены при 8-кратной дробности дистракции: выявлено увеличение частоты встречаемости участков разволокнения в поверхностной зоне и нарушение целостности базофильной линии.

3. В неповрежденных участках хондроциты демонстрируют реактивные изменения адаптивного характера, проявляющиеся активизацией пролиферативных (увеличены пул пролиферировавших хондроцитов, численная плотность клеток промежуточной зоны) и биосинтетических (гипертрофия клеток всех зонах и, особенно, неповрежденных участков поверхностной зоны, снижение ядерно-цитоплазматического индекса) процессов, за счет которых происходит регенерация хряща.

4. Выраженность процессов пролиферации и биосинтеза в суставном хряще при разных режимах дистракции различна и зависит от степени повреждения. При 8-кратной дробности дистракции в суставном хряще более выражены пролиферативные процессы (выявлены максимальные значения пула пролиферировавших хондроцитов, численной плотности клеток промежуточной зоны), при 60-кратной - биосинтетические (выявлены максимальные значения параметров, характеризующих размер и форму клеток, более выражено снижение ядерно-цитоплазматического индекса).

5. Высокодробная автодистракция с темпом 1 мм позволяет снизить травматизацию смежных суставов и обеспечивает высокую эффективность адаптационных реакций, направленных на восстановление структуры суставного хряща.

6. Сопоставительный анализ комплекса количественных параметров суставного хряща на тканевом и клеточном уровнях (толщины хряща, численной и объемной плотностей клеток, минимального и максимального диаметров, фактора формы клеток и их ядер, ядерно-цитоплазматического индекса, количества и численного состава изогенных групп) у экспериментальных и интактных животных дает объективную информацию о степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности.

7. Разработанная и адаптированная технология изготовления полутонких срезов суставного хряща большой площади позволяет проводить доказательные количественные исследования на разных уровнях структурной организации и является методом выбора гистологических исследований. Применение трехуровневой системы архивирования информации обеспечивает условия для текущего и ретроспективного анализа данных, корректировки и контроля результатов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанные нами технические приемы получения полутонких срезов большой площади (специальный режим проводки материала, приемы формирования пирамидки при затачивании блока перед ультратомированием и особенности фиксации срезов к предметному стеклу) могут быть рекомендованы в качестве адекватных способов обработки материала, позволяющих минимизировать эффект Холмса и сформировать репрезентативные выборки для последующего стереологического анализа.

2. Технология количественной оценки суставного хряща на тканевом и клеточном уровне (по полутонким срезам большой площади) может быть рекомендована как метод выбора при необходимости объективно количественно оценить степень реактивно-деструктивных изменений и эффективность восстановительных процессов в суставном хряще при разных условиях эксперимента.