Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ 35%, 0,87 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания постановки экспериментов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа содержит 27 таблиц и иллюстрирована 13 рисунками. Список использованной литературы включает 156 наименований, в том числе 74 зарубежных источника.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Объектами исследования являлись гидробионты средних и высоких уровней трофических цепей водных биоценозов. Исследованы представители следующих систематических групп водных организмов:

- зообентос: брюхоногие моллюски - роговая катушка Coretus corneus;

- ихтиофауна: карповые рыбы - обыкновенный карп Cyprinus carpio;

- бесхвостые амфибии: головастики шпорцевой лягушки Xenopus laevis.

Токсическими агентами выступали следующие пестициды:

химический класс производных арилоксифеноксипропионовых кислот: гербициды Фюзилад форте 150 г/л к.э. и Фуроре супер 7,5 эмв.;

химический класс тиазолов: инсектициды Актара 40% и Тиаклоприд (действующее вещество инсектицида Калипсо).

Токсическую нагрузку создавали на уровне ЛК₁₆ (концентрация вещества, при действии которой гибель составляет 16%) каждого пестицида для соответствующего тест-объекта. ЛК₁₆ является аналогом пороговой концентрации (термин широко распространен в токсикологии), т.е., малотоксична. Изучение воздействия таких концентраций представляет особый интерес, поскольку оно позволяет прогнозировать опасность сублетальных уровней загрязнения водоемов по ранним реакциям организмов.

Поскольку особый интерес представляют ранние стадии формирования ответных реакций организмов, эксперимент был организован в виде острого опыта продолжительностью 4 суток. Отборы проводились через 24, 48 и 96 часов после внесения токсикантов в аквариумы.

При работе с головастиком, а также с жабрами и печенью карпа готовили цельный 5% гомогенат, при работе с катушкой - 10% гомогенат на физиологическом растворе, содержащем 0,1% Тритон Х-100. Кровь карпа получали из хвостовой вены; после свертывания от тромба центрифугированием отделяли сыворотку крови.

Исследования проводили по следующим показателям: определяли содержание молекулярного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) (Стальная, Гаришвили, 1977) и интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) в системе Н₂О₂-люминол (Левин, 1988). Исследовали активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы (СОД) (Fried, 1975 и Черемисина и др., 1994), каталазы (КТ) (Королюк и др., 1988). Состояние ГС определяли по содержанию восстановленного глутатиона (GSH) (Ellman, 1959), активности ферментов глутатион-S-трансферазы (ГSТ) (Habig et.al., 1974) и глутатионредуктазы (ГР) (Юсупова, 1989). Состояние системы детоксикации ксенобиотиков оценивали по активности ацетилэстеразы (АЭ) (Покровский, Арчаков, 1968) и карбоксилэстеразы (КЭ) (Временные методические указания, 1987). Содержание белка (ОБ) определяли по методу Лоури (Lowry et.al.,1951).

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке (Лакин, 1973). Средние значения сравнивали по t-критерию Стьюдента для малых выборок, оценивая резко отклоняющиеся варианты по критерию Шовене (Кокунин, 1975).

Общая схема проведения исследований приведена на схеме.

Общая схема проведения исследований

Воздействие пестицидов на исследованные биохимические системы. В работе изучены 3 биохимические системы: процесс ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов, глутатионовая система и активность ферментов детоксикации. Рассмотрим каждый исследованный показатель по отдельности.

Изменения интенсивности ХЛ у моллюсков и в сыворотке крови карпа приведены на рис. 1.

Рисунок 1. Изменения интенсивности ХЛ у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия.

Как видно из рис. 1, у моллюсков фуроре и фюзилад активировали ХЛ на 1-е сутки (+66% и +45%), а затем ХЛ снижалась до контрольных величин на 2-е сутки и ниже контроля - на 4-е (-21% и -15%). Тиазолы, не влияя на интенсивность ХЛ на 1-е сутки, подавляли ее на 2-4-е сутки (-24…-59%). Таким образом, динамика ХЛ у моллюсков при воздействии обоих классов пестицидов была аналогичной: первичная активация или близость к контролю и подавление на протяжении остальной части эксперимента.

В сыворотке крови карпа эффект проявился только при воздействии пестицидов первой группы: фуроре и фюзилад повышали ХЛ, причем активирование усиливалось по мере протекания эксперимента с +40…0% до +111…+85%.

Динамика содержания МДА у гидробионтов показана на рис. 2.

малоновый диальдегид интоксикация пестицид

Рисунок 2. Изменение содержания МДА у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как следует из рис. 2, у головастика воздействие пестицидов первого класса практически не проявилось. Для тиазоловых пестицидов характерно повышение уровня МДА по мере протекания опыта: на 1-е сутки возрастание МДА на 0…+9% относительно контроля, а на 4-е: +19…+42%.

В организме моллюсков пестицидная интоксикация проявилась не очень отчетливо. Фюзилад исходно значительно повышал уровень МДА (+49% на 1-е сутки), затем он снижался до +16%, а на 4-е сутки был на контрольном уровне. При воздействии актары и тиаклоприда обнаружено снижение содержания МДА на 2-е сутки на -11…-20%.

В печени карпа фуроре и фюзилад на 1-е сутки снижали содержание МДА (-22…-15%), а затем оно повышалось до контрольных величин, а при действии фюзилада на 4-е даже превышало контроль (+18%). Воздействие актары повышало уровень МДА на 2-е сутки (+13%), а тиаклоприда - на 1-е (+13%).

В жабрах карпа эффект интоксикации проявился только при воздействии пестицидов первой группы, и динамика была следующей: первичное снижение уровня МДА (-37…-40%), затем уровень МДА стремился к контролю, а на 4-е сутки превышал контроль (+42…+23%).

Большинство работ, посвященных влиянию поллютантов различной природы на живые организмы, свидетельствуют о том, что токсическое воздействие сопровождается интенсификацией ПОЛ. Так, введение крысам линдана сопровождалось через 4 часа приростом МДА и повышением ХЛ в печени (Videla et.al., 2000). Аналогично у крыс интоксикация хлорпирифосом приводила к повышению МДА в переднем мозге (Verma, Srivastava, 2001), а введение малатиона вело к возрастанию МДА в печени и эритроцитах (Akhgari et.al., 2003). У людей, работающих на производстве пиретроидов дельтаметрина и фенвалерата содержание МДА в лимфоцитах значительно превышало контроль (Korraa, Gado, 2000). С ростом импактности акватории содержание МДА у личинок рыб Atherina hepsetus возрастало в несколько раз (Шахматова, 2002). Имеются также косвенные данные о значительной роли перекисного стресса в действии пестицидов: введение общеизвестного антиоксиданта б-токоферола снижало летальное действие параквата на мышей (Shimada et.al., 2002) и ослабляло проявления гепатотоксичности пентахлорфенола (Wang Ying-Jan et.al., 2001).

Обсуждая механизмы прооксидантного действия пестицидов на живые организмы, большинство авторов считает, что ПОЛ-стимулирующий эффект токсикантов осуществляется по косвенным механизмам. В то же время имеются сообщения о прямом физико-химическом воздействии пестицидов на биоструктуры: считается, что пиретроид циперметрин накапливается во внутренней гидрофобной области мембраны эритроцитов и вызывает снижение ее текучести (Gabbianelli et.al., 2002), а прооксидантная активность другого пиретроида бульдока реализуется за счет открытия митохондриальной ЦсА-чувствительной поры (Акиншина, Гутникова, 2000).

Таким образом, полученные нами данные об усилении процессов ПОЛ у головастиков шпорцевой лягушки и в тканях карпа при пестицидном воздействии согласуются с имеющимися данными литературы.

Динамика активности СОД в опыте показана на рис. 3.

Рисунок 3. Изменение активности СОД у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как видно из рис. 3, у головастиков воздействие фуроре и фюзилада вызывало ингибирование фермента на 1-е сутки (-12…-20%), а затем развивалась активация и на 4-е сутки активность превышала контроль на 11 и 10%. Тиазолы также ингибировали активность СОД на 1-е сутки (-14…-18%), а в дальнейшем ингибирование сохранялось только при действии актары (-10%).

У моллюсков воздействие всех пестицидов сопровождалось повышением активности СОД, причем активация сильнее выражена в середине и в конце эксперимента, достигая максимума на 4-е сутки: +45%, +71%, +19% и +16%, соответственно.

В печени карпа для воздействия всех пестицидов (кроме фуроре) характерна активация СОД на 1-2-е сутки (+31…+12% в зависимости от пестицида и экспозиции опыта), а на 4-е сутки активность фермента снижается до контрольного уровня, а при действии фуроре зафиксировано даже ингибирование СОД (-18%).

В жабрах карпа изменения выражены менее четко. Фуроре активирует фермент на 1-е сутки (+14%), тиаклоприд - на 1-е и 4-е (+13% и +9%), фюзилад активирует на 2-е (+29%), а на 4-е - ингибирует (-23%), а актара не оказывает воздействия вообще. В целом, можно говорить о слабо выраженной активации фермента.

Динамика активности каталазы показана на рис. 4.

Рисунок 4. Изменение активности каталазы у гидробионтов при воздействии пестицидов. Показаны достоверные различия

У головастика шпорцевой лягушки фуроре и фюзилад ингибировали фермент на 1-е сутки (-15% и -14%), а затем активность поднималась до показателей нормы. Тиазолы, напротив, не влияли на активность каталазы на 1-е сутки, зато активировали фермент на 2-4-е (+15…+31%).

Для воздействия пестицидов на моллюсков характерна активация каталазы, выраженная в разной степени в разные сроки эксперимента. Наиболее сильно она проявилась при действии фюзилада (+16…+22%), а актара вообще не влияла на активность каталазы.

Весьма сложны изменения активности каталазы в органах карпа.

В печени карпа фуроре ингибировал активность фермента на 2-4-е сутки (-21...-15%). Фюзилад, напротив, активировал каталазу на 1-2-е сутки (+39…+36%). При действии тиаклоприда зафиксирована активация на 2-е сутки (+31%), а актара не влияла на активность фермента.

В жабрах карпа картина изменений была идентичной динамике активности фермента в печени, однако изменения выражены сильнее: фюзилад и тиаклоприд активировали каталазу, фуроре ингибировал ее, а актара не оказывала никакого эффекта.

Анализ литературных данных показал что, в ряде исследований были получены "классические" результаты: токсическое воздействие сопровождалось усилением ПОЛ и активацией антиоксидантных ферментов. К примеру, введение крысам линдана сопровождалось приростом МДА в сыворотке и активацией СОД и каталазы в эритроцитах (Ahmed et.al, 2001). В уже упомянутых выше работах обнаружено, что малатион вызывал повышение уровня МДА и активности СОД и каталазы в эритроцитах и печени крыс (Akhgari et.al, 2003), а у личинок рыб Atherina hepsetus усиление загрязнения водной среды сопровождалось приростом МДА и повышением активности СОД и каталазы. В некоторых работах обнаружен дисбаланс изменения активности этих ферментов-синергистов. Так, загрязнение полихлорбифенилами вызывало у рыб Ameiurus nebulosus активацию СОД в печени и ингибирование каталазы в почках (Otto, Moon, 1996). Пиретроид фенвалерат активировал СОД, но не влиял на активность каталазы и содержание МДА у рыб Oreochromis niloticus (Oruc et.al, 2003). Любопытны данные по влиянию аминотриазола на два вида лягушек: показано, что степень ингибирования каталазы зависит от концентрации токсиканта и видовой принадлежности (Лущак и др., 2003).

Таким образом, полученные нами данные о сложных изменениях активности (с преимущественным активированием) антиоксидантных ферментов СОД и каталазы имеют подтверждения в литературе.

Изменения компонентов глутатионовой системы показаны на рис. 5 - 7.

Рисунок 5. Изменения содержания GSH у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Воздействие пестицидов на головастиков сопровождалось повышением содержания глутатиона на 4-е сутки (фюзилад максимально повышал уровень GSH на 2-е сутки +104%). Для тиазолов, помимо прироста к концу эксперимента, характерно также исчерпание GSH на 1-е сутки (-13 и -37%).

Для пестицидного воздействия на моллюсков характерна обратная картина: не влияя на уровень GSH на 1-е сутки, все пестициды вызывали снижение его уровня по мере протекания эксперимента, достигая максимума на 4-е сутки (-15…-51% в зависимости от пестицида).

В печени и жабрах карпа интоксикация сопровождалась принципиально одинаковой картиной изменений - содержание GSH увеличивалось, повышаясь по мере протекания опыта. В печени наибольший стимулирующий эффект обнаружен для фюзилада и актары, на 4-е сутки уровень GSH превышал контроль на +217% и +235%. Прирост GSH при действии фуроре и тиаклоприда составил "всего" +144%. В жабрах эффект выражен менее четко, и прирост GSH составил в среднем 30-40%

Рисунок 6. Изменения активности ГСТ у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как видно из рис. 6, воздействие всех пестицидов на 1-е сутки сопровождалось ингибированием активности ГСТ на -12…-27% (в зависимости от пестицида). В дальнейшем активность фермента повышалась до нормальных величин, а тиаклоприд даже активировал фермент (+15%).

У всех остальных тест-объектов зафиксирована только активация ГСТ.

У моллюсков активация фермента сильнее выражена при воздействии пестицидов первой группы. Так, фуроре повышал активность на +17…+25%, а фюзилад на +22…+80%. При действии тиазолов активность ГСТ вырастала не более чем на +10%.

В печени карпа активность ГСТ повышалась незначительно - на 10-20%. Фуроре повышал активность на +11…+12%, фюзилад - на +19% (2-е сутки). Воздействие актары активировало фермент на 1-е сутки (+19%), а тиаклоприд - на 2-4-е (+10% и +16%).

В жабрах карпа активация ГСТ проявилась сильнее, чем в печени. При действии фуроре активность фермента возрастала на +29% и +85% (2-4-е сутки), а фюзилада +49% и +33% в те же сроки опыта. Актара повышала активность фермента на +40% (2-е сутки), а тиаклоприд на +20…+25% на протяжении всего опыта. Следует отметить, что в большинстве случаев активация ГСТ в жабрах стала проявляться после 1-х суток эксперимента.

На рис. 7 показаны изменения активности глутатионредуктазы.

Рисунок 7. Изменения активности ГР у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как видно из рис. 7, для головастика характерно снижение активности ГР в ответ на пестицидное воздействие. Пестициды первой группы подавляли фермент на 1-е сутки (-17% и -26%), а затем его активность возрастала до контрольных величин, а при действии фюзилада даже превышала контроль на 4-е сутки (+13%). Актара стабильно ингибировала фермент, причем эффект усиливался по мере протекания эксперимента с -12 до -29%. Тиаклоприд снижал активность ГР только на 4-е сутки (-15%).

При воздействии пестицидов на моллюсков проявилась химическая природа токсикантов. Фуроре и фюзилад активировали фермент, причем активация возрастала в ходе эксперимента (фуроре: 0…+38%, фюзилад: +22…+51%). Тиазолы воздействия на ГР практически не оказывали, обнаружено только активация фермента при действии тиаклоприда на 1-е сутки (+10%).

В печени карпа пестицидная интоксикация сопровождалась повышением активности ГР, которое было довольно сильным, но проявилось в разные отрезки эксперимента. Фуроре повышал активность ГР на 1-2-е сутки (+41% и +18%), а фюзилад - на 2-е (+49%). При воздействии актары активность фермента повышалась на 1-2-е сутки (+46% и +56%), а тиаклоприда - на 1-е (+28%).

В жабрах карпа активность ГР также повышалась: изменения носили спорадический характер и были выражены слабее, чем в печени. При действии пестицидов первой группы активность возрастала только в опыте с фюзиладом на 2-е сутки (+24%). Актара активировала фермент на 1-е и 4-е сутки (+24% и +27%), а тиаклоприд - только на 4-е (+30%).

Таким образом, пестицидное воздействие на головастика шпорцевой лягушки сопровождалось повышением уровня GSH и снижением активности глутатионовых ферментов. У моллюсков картина изменений была обратной: снижение GSH и активация ГСТ и ГР. В печени и жабрах карпа активировалась вся глутатионовая система: возрастало содержание GSH и повышалась активность ГСТ и ГР, причем изменения в печени (кроме ГР) выражены сильнее, нежели в жабрах.

Анализ литературных данных свидетельствует, что глутатионовой системе, в том числе у рыб, посвящено довольно большое число работ, причем основной упор делают на исследование активности глутатионтрансферазы и содержание глутатиона.

Показано (Pena-Llopis et.al, 2002), что при воздействии фосфорорганического фенитротиона у мидий и гребешков содержание GSH снижается. Проводится корреляция между уровнем GSH и выживаемостью. Введение хлорпирифоса и линдана крысам приводило к снижению GSH в мозге (Verma et.al, 2001) и в цельной крови (Ahmed et.al, 2001).

В ряде работ, выполненных на разных тест-объектах, получены различные результаты. Алкилфенолы повышают уровень GSH в печени атлантической трески, но не влияют на активность ГСТ (Hasselberg et.al, 2001). Полихлорбифенилы у европейского угря селективно повышают активность ГСТ в печени, но не в почках (Perez Lopez et.al, 2002). А в исследованиях (Otto, Moon, 1996) показано, что полихлорбифенилы у рыб Ameiurus nebulosus повышают активность ГСТ в печени, почках и в мышцах. Уровень GSH в этих органах значительно снижен.

Еще в ряде исследований получены данные об активации ГСТ: в сыворотке крови тиляпии при действии альдикарба (El-Khatib, 2001) и в почках (но не в жабрах) у карповых рыб при воздействии гербицидов 2,4-Д и азинфосметила (Oruc Elif, Uner Nevin, 2002).

В других исследованиях обнаружено ингибирование ГСТ. Так, дильдрин и малатион у рыб Sparus aurata снижали активность ГСТ в микросомах печени (Pedrajas et.al, 1995). Фосфорорганический инсектицид диметоат у египетского канального сомика также снижал активность ГСТ в печени, почках и жабрах, но повышал активность глутатионредуктазы в печени и почках (Hamed et.al, 1999). Тяжелые металлы Cd, Ni, Hg, Cu также ингибируют ГСТ в печени кефали-остроноса (Sen Alaattin et.al, 2001) и в семенниках крыс (Ada et.al, 2001).

Разнородность приведенных данных может объясняться всеми тремя факторами формирования ответных реакций: видоспецифичностью, дозозависимостью и химической природой токсиканта.

Изменения активности ферментов детоксикации показаны на рис. 8 - 9.

Рисунок 8. Изменения активности КЭ у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как видно из рис. 8, у головастика все пестициды снижали активность карбоксилэстеразы, причем это ингибирование усиливалось по мере протекания эксперимента: от -17…-28% на 1-е сутки до -48…-82% на 4-е.

У моллюсков токсическое воздействие проявилось только при действии пестицидов первой группы: -19…-35% при действии фуроре и -8…-21% при действии фюзилада. Актара и тиаклоприд не влияли на активность КЭ.

В органах карпа проявилась зависимость активности фермента от химической природы пестицидов.

В печени фуроре снижал активность КЭ на 1-е сутки (-25%), а затем развивалась стимуляция фермента (+58% и +23% на 2-е и 4-е сутки). При действии фюзилада активность КЭ возрастал на 2-е сутки (+60%). Актара и тиаклоприд стабильно подавляли активность фермента, причем подавление составляло ~ 60%.

В жабрах производные феноксипропионовых кислот практически не влияли на активность фермента, обнаружено только ингибирование на 2-е сутки (-29%) при действии фуроре. Тиазолы подавляли КЭ, причем эффект актары более выражен: -26…-45%. Снижение активности КЭ при действии тиаклоприда зафиксировано только на 2-е сутки (-23%).

Рисунок 9. Изменения активности АЭ у гидробионтов при воздействии пестицидов (% от контроля). Показаны достоверные различия

Как видно из рис. 9, изменения активности ацетилэстеразы у всех тест-объектов были практически такими же, что и карбоксилэстеразы.

У головастиков все пестициды подавляли активность АЭ, начиная со 2-х суток (ингибирование на 1-е зафиксировано только при действии актары -45%). Минимальный ингибирующий эффект обнаружен для фуроре: -15…-11%. Фюзилад и тиаклоприд снижали активность фермента примерно одинаково: -20…-30%. Максимальное подавление характерно для актары - до -57%.

У моллюсков пестициды первой группы ингибировали активность АЭ примерно в такой же степени, что и КЭ: фуроре -18…-34%, фюзилад: -9…-25%. Также ингибирующий эффект проявился у актары: ингибирование на протяжении всего опыта составило -8…-16%. Тиаклоприд на активность АЭ не влиял.

В печени карпа производные арилоксифеноксипропионовых кислот повышали активность АЭ в разные сроки эксперимента: фуроре - 1-е и 4-е сутки (+25% и +34%), а фюзилад - на 4-е (+43%). Тиазолы, напротив, стабильно подавляли активность АЭ в одинаковой степени -35…-64%.

В жабрах карпа фуроре на активность ацетилэстеразы влияния не оказывал. Фюзилад на 1-е сутки снижал активность АЭ на -20%, на 2-е - повышал на +36%, а на 4-е она возвращалась к норме. Тиазолы подавляли активность фермента, причем при действии актары эффект был более выражен: от -21% на 1-е сутки до -45% на 4-е. Ингибирование фермента тиаклопридом составило -19%.

Таким образом, динамика активности как карбоксил-, так и ацетил- эстеразы у любого тест-объекта была аналогичной. У головастиков все пестициды подавляли активность обеих эстераз. У моллюсков ингибирующий эффект характерен для производных арилоксифеноксипропионовых кислот, для тиазолов этот эффект выражен в очень небольшой степени. В печени карпа можно говорить о стимулирующем эффекте производных феноксипропионовых кислот, а в жабрах зафиксированы небольшие случайные изменения. Тиазоловые пестициды подавляли активность обеих эстераз и в печени и в жабрах.

Анализ литературы показал, что исследования в основном посвящены ацетилхолин- и бутирилхолин- эстеразам. Количество работ по карбоксил- и, тем более, ацетил- эстеразам невелико. К сожалению, ряд авторов вообще не выделяют конкретных ферментов и сообщают о "карбоксилэстеразах", "холинэстеразе" и даже о "эстеразах в целом". Это тем более прискорбно, потому что давно были проведены работы, в которых сообщается о карбоксил- и ацетил- эстеразах как о самостоятельных ферментах: у краба Scylla serrata (Ezhilarasi, Subramoniam, 1984) и мидии (Ozretic, Mirjana, 1994).

В большинстве работ сообщается об ингибировании карбоксил- и ацетил- эстераз при токсических воздействиях. Параоксон ингибирует КЭ у двустворчатого моллюска Corbicula fluminea (Basak et.al, 1998). Монокротофос также подавляет КЭ у рыб Sciaenops ocellatus (Ru Shaoguo et.al, 2003). Аналогично КЭ ингибируется при загрязнении водных экосистем хлорзамещенными углеводородами - в печени панцирной щуки (Huang et.al, 1997), полиароматическими углеводородами - в печени молоди кумжи (Sanchez-Hernandez et.al., 1998). Интересно недавнее сообщение, что инсектициды эсфенвалерат и диазинон повышали активность АЭ и КЭ у толстолоба (Denton Debra et.al., 2003). Таким образом, из литературы известны факты как ингибирования, так и активирования карбоксил- и ацетил- эстераз у разных тест-объектов при различных токсических нагрузках.

В обзоре Кошмана (Cashman et.al., 1996) предложен механизм ингибирования карбоксил- и ацетил- эстераз фосфорорганическими соединениями. Согласно ему, карбоксилэстеразы способны осуществлять гидролиз сложноэфирных связей в молекулах фосфорорганических соединений (например, пестицидов малатиона, хлорпирифоса), тем самым реализуя путь детоксикации. Однако если эти соединения поступают на другой путь детоксикации и подвергаются окислительной трансформации (путь цитохрома Р-450), то оксо- метаболиты не подвергаются гидролизу, но, напротив, связываются с полипептидной цепью эстеразы и блокируют активность фермента. Вполне возможно, что исследованные в нашей работе пестициды также способны оказывать подобные эффекты, причем различия в метаболических путях трансформации у разных организмов могут приводить к появлению различных метаболитов, которые могут вызывать различные эффекты.

Видоспецифичность ответных реакций. Анализ полученных нами результатов позволяет выделить 4 основные типа изменений того или иного показателя:

? показатель изменяется одинаково у всех тест-объектов;

? динамика показателя у разных тест-объектов принципиально идентична, хотя имеются определенные особенности;

? показатель изменяется у разных тест-объектов по-разному;

? изменения показателя сами по себе очень сложны, поэтому не представляется возможным сравнивать их у разных тест-объектов.

Анализируя общий характер направленности изменений и динамику, можно сделать следующий вывод: фактор таксономического положения тест-объекта играет важнейшую роль в формировании ответных биохимических реакций организма. Нами не обнаружено ни одного показателя, динамика которого совпадала у всех тест-объектов. Можно говорить лишь об общем характере направленности изменений того или иного показателя. Видоспецифичность ответных реакций присутствует в динамике всех показателей, что особенно ярко демонстрируют изменения ХЛ и уровня глутатиона.

Зависимость формирования ответных реакций от химического строения пестицидов. Анализируя полученные результаты по данному критерию можно выделить три типа ответных реакций:

? показатель изменяется одинаково при действии всех пестицидов;

? изменения показателя зависят от химической природы пестицидов;

? не представляется возможным установить зависимость изменений показателя от химизма пестицидов.

Анализ данных свидетельствует, что абсолютной зависимости либо независимости изменений того или иного показателя от химической природы пестицидов для всех тест-объектов не зафиксировано. Иными словами, не обнаружено показателя, который бы у всех тест-организмов изменялся в одну сторону при действии пестицидов одного класса, и в другую сторону - при воздействии пестицидов второго класса. Соответственно, отнести показатель к одному из трех классов ответных реакций можно с определенной степенью приближения.

Как и в случае зависимости от тест-объекта, нами обнаружено, что химическая природа пестицидов играет определенную роль в формировании ответных реакций организма. Практически не зависят от химизма пестицидов изменения показателей глутатионовой системы и активность СОД. Показатели ПОЛ и ферменты детоксикации, напротив, зависят от этого очень сильно.

Информативность и полезность изученных биохимических показателей для диагностики состояния гидробионтов. Анализ полученных нами результатов свидетельствует, что все изученные показатели у всех тест-объектов изменялись в ответ на токсическое воздействие пестицидов. Динамика и характер изменений позволяет нам разделить все показатели на 2 группы:

? показатели с достоверно выраженными изменениями;

? показатели, у которых изменения выражены незначительно.

К первой группе можно отнести следующие показатели:

· интенсивность ХЛ;

· содержание восстановленного глутатиона GSH;

· конъюгирующая активность глутатион-S-трансферазы ГСТ;

· активность СОД;

· активность карбоксил- и ацетил- эстераз.

Суммируя все вышеизложенное, можно сделать несколько заключений.

Маркерами токсического воздействия пестицидов классов производных арилоксифеноксипропионовых кислот и тиазолов (неоникотиноидов) на гидробионтов являются: интенсивность ХЛ; содержание восстановленного глутатиона GSH; конъюгирующая активность глутатион-S-трансферазы ГСТ; активность СОД, а также активность карбоксил- и ацетил- эстераз. Изменения этих показателей хорошо выражены и имеют яркую динамику.

Однако, поскольку для ХЛ показана зависимость ответной реакции и от тест-объекта и от химической природы пестицида, это ограничивает применение данного показателя для диагностических целей.

Сложная динамика активности СОД по мере протекания эксперимента, где зафиксировано изменение эффекта с "+" на "-" (активация сменяется ингибированием) (печень карпа) либо наоборот (головастик), также ограничивает диагностическую ценность данного показателя.

Характерное для эстераз ингибирование можно рассматривать как типичный ответ на интоксикацию, хотя ингибирование ферментов арилоксифеноксипропионатами у моллюсков и стимулирование - в печени карпа требует дальнейших исследований.

В случае уровня GSH видоспецифичность реакции компенсируется четко выраженным ответом на интоксикацию, а огромные изменения GSH в печени карпа также свидетельствуют в пользу ценности этого показателя.

Конъюгирующая активность ГСТ в трех постановках эксперимента возрастает в ответ на пестицидную интоксикацию. Небольшое ингибирование фермента у головастика на 1-е сутки эксперимента можно объяснить особенностями ответа ювенильного быстро развивающегося организма.

Таким образом, если маркерами пестицидной интоксикации являются 6 показателей, то для диагностических целей можно рекомендовать только показатели глутатионовой системы: содержание восстановленного глутатиона, конъюгирующую активность ГСТ, а также (с определенными ограничениями) активность ГР.

Выводы

1. Воздействие пестицидов на уровне пороговой концентрации в остром опыте сопровождается достоверным увеличением интенсивности ХЛ у моллюсков в течение первых суток эксперимента, а в тканях карпа, в течение 96 часов опыта, достигая максимума к четвертым суткам эксперимента. У головастика шпорцевой лягушки в ходе всего эксперимента отмечали возрастание уровня МДА.

2. Пестицидная интоксикация при краткосрочном воздействии на уровне пороговой концентрации в основном сопровождается увеличением активности СОД и каталазы. Максимальная активность СОД, более чем в 1,5 раза, выявлена у моллюсков. У головастика шпорцевой лягушки активность обоих ферментов в 1-е сутки эксперимента незначительно, но достоверно подавлялась, а затем возрастала (2-е, 4-е сутки) до контрольного уровня или превышала его. В тканях карпа активность СОД и каталазы возрастала в 1,3-1,7 раза, после чего снижалась до контрольных значений.

3. В остром опыте токсическое воздействие пестицидов на уровне пороговых концентраций приводит к возрастанию уровня глутатиона в печени карпа к концу опыта более чем в 2 раза. Для головастика шпорцевой лягушки характерно незначительное, но достоверное подавление всех звеньев глутатионовой системы в начале эксперимента. В процессе опыта все показатели достигают контрольных значений, а уровень глутатиона достоверно превышает их. Особенность ответной реакции у моллюсков проявилась снижением глутатиона с середины эксперимента в 1,5 раза.

4. Активность карбоксил- и ацетил- эстераз (ферментов детоксикации) в большинстве случаев снижена; максимальное ингибирование карбоксилэстеразы (в 1,8 раза) зафиксировано у моллюсков. Однако в печени карпа обе эстеразы достоверно активировались, преимущественно на 2-е сутки.

5. Видоспецифичность ответных реакций (зависимость от тест-объекта) в той или иной мере присутствует в динамике всех показателей, что особенно ярко демонстрируют изменения интенсивности ХЛ и уровня глутатиона. ХЛ у моллюсков, повышенная в начале опыта, к концу эксперимента снижается. В сыворотке крови карпа, напротив, интенсивность ХЛ постоянно возрастает. Уровень GSH у головастиков в начале опыта снижен, а затем постепенно возрастает и к концу эксперимента превышает контроль. У моллюсков содержание GSH падает, начиная с середины опыта. В печени карпа динамика GSH резко восходящая. В жабрах уровень GSH возрастает, однако четкой динамики не зафиксировано.

6. Фактор химической природы пестицида проявился по-разному. Практически не зависят от класса пестицидов изменения показателей глутатионовой системы и активность СОД. Показатели уровня СРП, ПОЛ и активности ферментов детоксикации в довольно большой степени зависят от природы пестицидов.

7. Маркерами токсического воздействия пестицидов на гидробионтов являются: интенсивность ХЛ; содержание GSH; конъюгирующая активность ГSТ; активность СОД, а также активность карбоксил- и ацетил- эстераз. Изменения этих показателей хорошо выражены и имеют яркую динамику.

8. Для диагностических целей можно рекомендовать показатели глутатионовой системы: содержание GSH, конъюгирующую активность ГСТ, а также (с определенными ограничениями) активность ГР.

Список использованных сокращений

АОЗ - антиоксидантная защита

АФК - активные формы кислорода

ГSТ - глутатион-S-трансфераза

ГР - глутатионредуктаза

ГС - глутатионовая система

д.в. - действующее вещество

КТ - каталаза

ЛК₁₆ - минимальная летальная концентрация

МДА - малоновый диальдегид

ПДК - предельно допустимая концентрация

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРП - свободно-радикальные процессы

ХЛ - хемилюминесценция

GSH- глутатион восстановленный.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Moskvichov D.V., Levina I.L., Gvozdenko E.S. Lipid peroxidation and activity of antioxidant enzymes in tadpole of clawed frog under the action of diazole pesticides.// Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health. - Smolensk, Russia, 2003 - C. 194-195. 0,08 п.л., 40%.

2. Москвичев Д.В., Левина И.Л., Гвозденко Е.С., Зинчук О.А. Оценка глутатионовой системы у осетровых и карповых рыб как маркера воздействия азоловых пестицидов.// В сбор. Научные труды международного биотехнологического центра МГУ. - Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова 2004 - С. 129.0,04 п.л., 30%

3. Левина И.Л., Москвичев Д.В., Щербакова Н.И., Гвозденко Е.С. Особенности биохимической адаптации брюхоногих моллюсков к воздействию пестицидов новых поколений. // В сбор. Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. - Петрозаводск 2004 - С. 80-81.0,08 п.л., 20%.

4. Москвичев Д.В., Левина И.Л., Гвозденко Е.С., Зинчук О.А. Ранние адаптивные изменения активности ферментов биотрансформации у головастиков шпорцевой лягушки и брюхоногих моллюсков при пестицидной нагрузке. // В сбор. Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. - Петрозаводск 2004 - С. 94-95. 0,08 п.л., 30%.

5. Левина И.Л., Гвозденко Е.С., Зинчук О.А., Москвичев Д.В., Щербакова Н.И. Действие тиазоловых пестицидов на процессы детоксикации и антиоксидантной защиты у рыб.// В мат. конф. Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных. - Тез.конф. - Саранск 2005.- С. 126-131. 0,25 п.л., 40%.

6. Левина И.Л., Зинчук О.А., Москвичев Д.В., Гвозденко Е.С. Адаптивные изменения активности этераз у бесхвостых амфибий и брюхоногих моллюсков при пестицидном воздействии. // В сбор. Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. - Петрозаводск 2005 - С. 101-105. 0,21 п.л., 30%

7. Левина И.Л., Москвичев Д.В., Гвозденко Е.С., Шепило В.Ю. Изменения про/антиоксидантного баланса у рыб и брюхоногих моллюсков при воздействии гербицидов класса арилоксифеноксипропионовых кислот.// В мат. конф. Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека.- Смоленск 2005. - С. 60-62.0,13 п.л., 30%.

8. Гвозденко Е.С., Внуков В.В. Влияние пестицидов нового поколения на состояние глутатионовой системы у рыб.// Известия ВУЗов. Северо-кавказский регион. №12 2006. - с. 55-59. 0,5 п.л., 80%.

Размещено на Allbest.ru