Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

Белорусский государственный университет

Химический факультет

Кафедра аналитической химии

Реферат

Определение гормональных препаратов в продуктах питания

Выполнила: студентка 4 курса 6 группы

Реут Кристина Владимировна

Минск, 2018

1. Гормональные препараты в продуктах питания

Гормоны - органические соединения, вырабатываемые определенными клетками и предназначенные для управления функциями организма, их регуляции и координации. У высших животных есть две регуляторных системы, с помощью которых организм приспосабливается к постоянным внутренним и внешним изменениям. Одна из них - нервная система, быстро передающая сигналы (в виде импульсов) через сеть нервов и нервных клеток; другая - эндокринная, осуществляющая химическую регуляцию с помощью гормонов, которые переносятся кровью и оказывают эффект на отдаленные от места их выделения ткани и органы. Химическая система связи взаимодействует с нервной системой; так, некоторые гормоны функционируют в качестве медиаторов (посредников) между нервной системой и органами, отвечающими на воздействие. Так гормоны регулируют активность всех клеток организма. Они влияют на остроту мышления и физическую подвижность, телосложение и рост, определяют рост волос, тональность голоса, половое влечение и поведение. Благодаря эндокринной системе человек может приспосабливаться к сильным температурным колебаниям, излишку или недостатку пищи, к физическим и эмоциональным стрессам. Повышение или снижение гормонального уровня, наряду с уменьшением или увеличением чувствительности гормональных рецепторов может привести к эндокринным заболеваниям.

Стероидные гормоны - группа физиологически активных веществ (половые гормоны, кортикостероиды и др.), регулирующих процессы жизнедеятельности у животных и человека. У позвоночных стероидные гормоны синтезируются из холестерина в коре надпочечников, клетках Лейдига семенников, в фолликулах и желтом теле яичников, а также в плаценте. В связи с высокой липофильностью стероидные гормоны относительно легко диффундируют через плазматические мембраны в кровь, а затем проникают в клетки-мишени.

Гормональные нарушения связаны с хроническим дисбиозом, гормональными или гормоно-ингибирующиим добавками в продуктах питания, а также постоянным дефицитом ортомолекул.

Большинство производителей используют корма генной модификации, а также вводят гормональные препараты в организм животного за несколько месяцев до убоя для стимулирования роста мышечной ткани.

Многие ветеринарные препараты несут серьёзную опасность для здоровья человека при их хроническом поступлении. Так, например, гормональные препараты, особенно опасные для здоровья детей и подростков, обладают генотоксичными, иммунотоксичными, эмбриотоксичными и канцерогенными свойствами (рак груди, рак предстательной железы), вызывают нарушения гормонального баланса, провоцируют аутоиммунные и аллергические заболевания, приводят к деградации репродуктивной функции человека, вызывают нарушения в развитии плода и ребенка.

Стимуляторы роста с/х животных гормонального действия, особенно синтетические нестероидные соединения типа диэтилстильбэстрола, не разрушаются в организме животных, и их остаточное количество длительно сохраняется в мясных продуктах. При использовании диэтилстильбэстрола для откорма животных в мясе увеличивается содержание влаги и жира. В большинстве стран мира диэтилстильбэстрол не применяется в животноводстве из-за его канцерогенных свойств.

Диэтилстильбэстрол (DES или стильбэстрол), мощный синтетический половой гормон, добавлением в комбикорм или путём прямых инъекций которого можно добиться существенного наращивания массы животного при уменьшении объёма потребляемых кормов, был запрещён к применению в США в 1979 году, когда были обнародованы данные исследований, связывающие это вещество с развитием рака и бесплодия у человека. Но даже спустя год после его официального запрета, в ходе детального расследования, проведённого Управлением по контролю за продуктами и медикаментами (FDA) совместно с Департаментом сельского хозяйства США было обнаружено, что более 200 000 голов крупного рогатого скота по всей стране нелегально подвергались инъекциям DES. Препарат этот по сей день легально применяется при разведении мясных пород скота в Мексике, откуда животные затем экспортируются в США.

Даже с запретом DES, мясная промышленность не испытывает недостатка в разрешённых к применению гормональных препаратах - стимуляторах роста. Так, по состоянию на сегодняшний день, широко применяются меленгестрол ацетат (MGA, обеспечивающий прибавку в весе на 6 процентов эффективнее нежели запрещённый DES), зеранол, прогестерон, тестостерон пропионат, фуразолидон, тринитро-4-гидроксифенил мышьяковой кислоты, арсанилат натрия и тилозин фосфат. Мышьяк, ещё один печально известный канцероген, добавляется в корма животных в составе разнообразных мышьяк-содержащих соединений, также используемых в качестве стимуляторов роста. Помимо этого, мышьяк входит в состав дезинфекционных растворов, в которые "окунают" животных чтобы избавиться от клещей и прочих паразитов.

Многие препараты запрещены в странах Европейского союза, т.к. их использование в животноводстве и птицеводстве приводит к накоплению в продуктах животного происхождения этих веществ.

Среди них:

1) Стильбены, к группе которых относятся диэтилстильбестрол, диеноэстрол и гексоэстрол являющиеся высокоэффективными синтетическими анаболическими стероидами, обладающими сильной эстрогенной активностью. Было доказано, что стильбены обладают выраженными канцерогенными свойствами.

2) Этинилэстрадиол является синтетическим гормоноподобным веществом, обладающим эстрогенной активностью.

3) Тестостерон является эндогенным мужским (андрогенным) половым гормоном, обладающим анаболическим действием. Тестостерон вырабатывается в половых железах самцов и необходим для нормального функционирования репродуктивной системы, формирования вторичных половых признаков. Постоянная выработка тестостерона начинается в период полового созревания и продолжается до периода угасания половой функции. Тестостерон стимулирует синтез белка в организме, а это, в свою очередь, приводит к увеличению массы тела, особенно мышечной. Систематическое использование тестостерона с целью стимуляции роста мышечной массы животного запрещено. Показано, что экзогенный тестостерон может причинить риск здоровью человека, в том числе вызывать рак предстательной железы

4) Метилтестостерон является синтетическим анаболическим стероидом, обладающим, подобно тестостерону, андрогенной активностью. Метилтестостерон назначают самцам при половом недоразвитии, при сосудистых и нервных расстройствах. Применение препарата при соответствующих показаниях и в соответствующих дозах приводит к усилению половой функции, стимулированию роста недоразвитых половых органов, развитию вторичных половых признаков. Препарат рекомендуют также самцам при импотенции вследствие переутомления, а женским особям при метритах и вагинитах. Использование метилтестостерона в животноводстве и птицеводстве приводит к его накоплению в продуктах животного происхождения и запрещено.

5) 19-нортестостерон является синтетическим анаболическим стероидом, обладающим андрогенной активностью. Некоторые эфиры 19-нортестостерона применяются в ветеринарной практике по показаниям в лечебных целях, однако систематическое использование 19-нортестостерона с целью стимуляции роста мышечной массы животного запрещено.

6) Кленбутерол принадлежит к группе веществ, называемых b-агонистами. Известно, что b-агонисты стимулируют рост мышечной массы и регулируют соотношение жировой и мышечной ткани при выращивании сельскохозяйственных животных и птицы. Доказано, что кленбутерол и другие b-агонисты при их потреблении с пищей могут спровоцировать тахикардию и резкий подъем кровяного давления. При хроническом поступлении кленбутерола и других b-агонистов в организм человека могут наблюдаться нарушения обмена веществ.

7) Зеранол - высокоэффективный синтетический анаболик, обладающий эстрогенными свойствами. Микотоксин зераленон, который называют иногда «растительным гормоном», обладает втрое меньшей эстрогенной активностью, чем синтетический зеранол. В силу своих анаболических свойств зеранол нелегально используется в животноводстве для стимуляции роста мышечной массы и повышения усвояемости кормов. Зеранол может причинить существенный риск здоровью человека. Поступая с продуктами животного происхождения в организм человека, зеранол может вызывать клинические признаки гиперэстрогенизма, бесплодие, нарушения в развитии детей и подростков. Использование зеранола в животноводстве запрещено.

8) Тренболон является высокоэффективным синтетическим анаболическим стероидом, обладающим также сильной андрогенной активностью. Тренболон вызывает трансформацию клеток, и может причинить риск здоровью человека. Использование тренболона в животноводстве и птицеводстве приводит к его накоплению в продуктах животного происхождения и запрещено.

Для определения остатков ветеринарных препаратов используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании. В последнее время для скрининга остатков ветеринарных препаратов применяется удобный и быстрый иммуноферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС). Также используются методические указания по количественному определению семи основных синтетических гормональных препаратов в продовольственном сырье животного происхождения с помощью тест-систем серии RIDASCREEN®.

Продовольственное сырье и пищевые продукты животного происхождения должны быть полностью свободны от остатков гормональных препаратов, бета-агонистов и некоторых антибиотиков (например, левомицетина и нитрофуранов). Ветеринарные препараты, использующиеся в терапевтических целях должны применяться при условии обязательной выдержки животных перед забоем до полного вывода остатков ветеринарных препаратов из организма животного.

2. Определение остаточных количеств гормонов в продуктах животноводства методом ГЖХ

гормональный препарат питание

Пищевые продукты могут контаминироваться различными гормональными препаратами (ГП), использующимися в качестве лекарственных средств, а также для интенсификации воспроизводства и продуктивности животных и птицы.

Многие гормоны обладают выраженной анаболической активностью - способностью стимулировать ускоренный рост тканей и синтез белка в организме. Следствием применения гормональных препаратов (ГП), их аналогов и производных в сельском хозяйстве явилось обнаружение остаточных количеств этих веществ в мясе, мясных продуктах, молоке, молочных продуктах и яйцах. К ГП относятся некоторые полипептидные и белковые гормоны (инсулин, соматотропин и др.), производные аминокислот - тироидные гормоны, а также стероидные гормоны и их аналоги.

Систематическое употребление продуктов питания, загрязненных ГП является причиной различного рода аллергических реакций, дисбактериозов и других нарушений. Поэтому необходим постоянный контроль остаточных количеств ГП в продуктах питания.

Данному вопросу уделяется должное внимание во многих странах, он неоднократно рассматривался на конференциях, в правительственные программах многих стран, а экспертами ФАО/ВОЗ была разработана инструкция по определению остаточных количеств нормируемых гормонов (диэтилстильбэстрола. тестостерона, эстрадиола-17в) в продуктах животноводства из одной пробы методом газожидкостной хроматографии для контроля остаточных количеств (ОК) ГП в продуктах питания.

Предлагаемый анализ рассчитан на определение свободных и конъюгированных диэтилстильбэстрола. тестостерона и эстраднола-17в в мясе, субпродуктах и молоке. Он основан на экстракции гормонов из пробы мяса, субпродуктов или молока полярными растворителями, разрушении конъюгатов гормонов соляной кислотой, отмывании соляной кислоты, очистке пробы перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями, затем на адсорбционной хроматографической колонке с силикагелем и картридже С18polarplus с последующим модифицированием ангидридом гептафтормасляной кислоты для газохроматографического определения с помощью детектора по захвату электронов и полуполярной капиллярной колонки с силиконовой жидкой фазой НР-50. Нижний предел измерения при использовании газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов составляет 0,3 нг для ДЭС; 0,5 нг для тестостерона и 0,6 нг для эстрадиола-17в в 2 мкл вводимой пробы. Относительная суммарная погрешность измерений при принятой доверительной вероятности Р=0.95 не превышает ±18-20%.

Пробы для количественного определения отбирают из поверхностных слоев продовольствия из 5-10 мест хранения. В каждом месте хранения из поверхностных слоев берут 100-200 г продукта с помощью пробоотборника, ножа или ложки. Однородные продукты смешивают в общую пробу весом 1,0-1,5 кг. Пробы можно помещать в банки с крышками или полиэтиленовые пакеты, последние герметично обвязывают.

Проба, принятая в лаборатории, хранится по возможности при той же температуре, при которой находилось продовольствие при отборе проб. Общую пробу тщательно измельчают, перемешивают и из нее отбирают нужную навеску.

Химические методы обнаружения и идентификации гормонов на тонкослойных и бумажных хроматограммах и электрофореграммах

Для белковых гормонов

Реакции с амидовым черным.

1. Готовят 0,02%-ный раствор амидового черного в смеси метанола и уксусной кислоты (9:1). Фильтруют. После электрофореза полосу бумаги помещают на 10 мин в раствор красителя, после чего многократно промывают 10%-ным водным раствором уксусной кислоты или смесью метанола и уксусной кислоты (9:1).

2. 0,3 г амидового черного растворяют в 100 мл 7%-ной уксусной кислоты, содержащей 30 мл метанола. Фильтруют. После электрофореза полиакриламидный гель погружают в раствор красителя на 2-3 ч. Избыток красителя удаляют длительным промыванием в 7%-ной уксусной кислоте, иногда с применением щадящего электрофореза.

Реакция с кумаси ярким, бриллиантовым синим.

Применяется для окрашивания после электрофореза в полиакримиланом геле. Гель в течение 15-18 ч фиксируют в 20%-ном водном растворе сульфосалициловой кислоты, затем переносят на 2-4 ч (в зависимости от концентрации геля) в 0,25%-ный водный раствор кумаси яркого синего и три -- пять раз промывают 7%-ным раствором уксусной кислоты. Объемы фиксатора и промывной жидкости должны превышать объем геля не менее чем в десять раз.

Для пептидов, производных аминокислот и биогенных аминов

Реакции с нингидрином.

1.Хроматограмму смачивают свежим 1%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После высушивания ее помещают в темноте на 40 ч в стеклянный сосуд, на дне которого находится стаканчик с концентрированной соляной кислотой.

2. Хроматограмму смачивают смесью 1%-ного раствора нингидрина в ацетоне (100 мл), 1%-ного раствора кадмия ацетата в воде (10 мл) и 5 мл уксусной кислоты. Через 2 ч высушивания на воздухе в темноте развивается максимальная окраска (красная).

3. Готовят растворы:

а) 0,1 г нингидрипа в 50 мл абсолютного этанола, 10мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл коллидина;

б) 0,5 г нитрата меди в 50 мл абсолютного этанола.

Перед употреблением растворы смешивают в соотношении 50:3. Хроматограмму опрыскивают, нагревают 4 мин при 110° С. Окраска нестойкая.

Для стероидов

Поглощение УФ света.

Хроматограмму облучают коротковолновым УФ светом.. Все б, в-ненасыщенные кетостероиды, диены инекоторые другие соединения проявляются как темные пятна на светлом фоне. Наиболее часто данный метод применяют для обнаружения Д4-3-кетостероидов. Продолжительность облучения должна быть минимальной во избежаниеразрушения стероидов.

Проявление парами йода.

Это универсальный метод обнаружения органических веществ. Хроматограмму помещают в закрытый сосуд, на дне которого находятся кристаллы йода, выдерживают на воздухе 5 мин для удаления избытка йода. Пятна стероидов приобретают коричневую окраску. Рекомендуют также опрыскивать хроматограмму 1%-ным водным раствором крахмала до появления синих пятен. Обработка крахмалом непригодна для изучения тонкослойных хроматограмм в тех случаях, когда крахмал применен в качестве связующего вещества.

Реакция с анисовым альдегидом -- кислотой.

Общая реакция для стероидов и других органических веществ. Хроматограмму опрыскивают смесью анисового альдегида, концентрированной серной и ледяной уксусной кислот (0,5:1:50). После нагревания в течение 10 мин при 100°С появляются окрашенные пятна. Метод рекомендуется для замены агрессивного обнаружения серной кислотой при тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol.

Реакция с азотной кислотой.

Рекомендуется для обработки пластин Silufol. Хроматограмму опрыскивают 65%-ной азотной кислотой, нагревают 10 мин при 100° С. Ненасыщенные стероиды дают коричневую окраску.

Реакция с фосфорномолибденовой кислотой.

Применяется для обнаружения оксистероидов. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленным 10%-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле, нагревают 5 мин при 80° С.

Реакция с трихлоридом сурьмы -- уксусным ангидридом

Применяется для обнаружения оксистероидов. Альдостерон, кортизон и их ацетаты не окрашиваются. Хроматограмму опрыскивают смесью насыщенного раствора трихлорида сурьмы (яд!) в хлороформе (без примеси этанола) и уксусного ангидрида (8:2), выдерживают в сушильном шкафу 5 мин при 90-100° С. В видимом свете окраска пятен следующая:

прегненолон -- фиолетоваятестостерон -- сине-зеленая

прегненолон-ацетат -- фиоле-дигидротестостерон -- синяя

товаяандростерон -- зелено-коричне-

прогестерон -- синяявая

прогестерон-ацетат -- синяяДЭА -- фиолетовая

F-- красно-коричневаяДЭА-ацетат -- фиолетовая

F-ацетат -- желто-коричневаяандростендиол -- красно-фио-

S-- фиолетоваялетовая

S-ацетат -- фиолетоваяЕ3 -- коричнево-зеленая

В - коричневаяЕ2 -- оранжевая

ДОК -- серо-коричневаяЕ3 -- розовая

ДОК-ацетат -- серо-коричневая

Реакция с трихлоридом сурьмы (реакция Эртеля).

После опрыскивания хроматограммы насыщенным раствором трихлорида сурьмы в хлороформе (без примеси этанола) и нагревания в течение 5 мин при 90--100° С Д5-3в-оксистероиды дают пурпурно-фиолетовую окраску. Реактив проявляет и другие оксистероиды, окраска которых отличается.

Реакция с Н2SО4-этанолом (реакция Эртеля и Эйк-Нес).

Хроматограмму обрабатывают свежеприготовленной смесью концентрированной серной кислоты и абсолютного этанола (2:1). Через 1-2 мин развивается желто-коричневая окраска. Реакция специфична для Д5-3в-окси-стероидов и их ацетатов.

Флюоресцентная реакция с фосфорной кислотой.

После смачивания или опрыскивания хроматограммы 15%-ним водным растворном о-фосфорной кислоты и прогревания в течение 20 мин при 80--90° С кетостероиды в УФ свете дают флюоресценцию -- от голубой до оранжевой.

Щелочная флюоресценция.

Хроматограмму опрыскивают 10%-ным раствором едкого натра в 60%-ном водном метаноле, нагревают 10 мин при 80--100° С. В УФ свете Д4-3-кетостероиды дают желтую флюоресценцию.

Реакции с тетразоловым синим.

Стероиды, имеющие б-кетольную боковую цепь при С-17 (-СО-СН2ОН), восстанавливают тетразоловый синий в формазан, имеющий голубую окраску.

1. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленной смесью 1%-ного водного раствора тетразолового синего и 2 н. едкого натра в метаноле (1:9). Небольшое подогревание (40-60° С) ускоряет появление окраски.

2. Смесь для обработки хроматограммы состоит из 8 мл 1%-ного тетразолового синего в этаноле, 12 мл 4 н. едкого натра и 20 мл дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.

Реакция с азотнокислым серебром.

К 10 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра последовательно прибавляют десять капель концентрированного аммиака и 5 мл 10%-ного раствора едкого натра (реактив Толленса). Полосу бумаги смачивают свежеприготовленным реактивом и сушат на воздухе 1 мин (не допускать появления окраски фона!). Хроматограмму на несколько секунд опускают в 5%-ный раствор гипосульфита и промывают 1-2 мин в дистиллированной воде. Стероиды, имеющие б-кетольную боковую цепь, окрашиваются в коричневый цвет.

Реакция с м-динитробензолом (реакция Циммермана).

Относительно специфична для 17-кетостероидов. Хроматограмму опрыскивают свежеприготовленной смесью 2%-ного раствора м-динитробензола в этаноле с 50%-ным водным едким кали (4:1). нагревают 3-5 мин при 50-60°С. Пятна стероидов окрашиваются в фиолетовый цвет

Спектроскопия сернокислых хромогенов.

К сухим остаткам элюатов стероидов (20--40 мкг) и контрольного («пустого») участка хроматограммы прибавляют по 2 мл концентрированной серной кислоты. Через 2 ч снимают спектр абсорбции стероида против контроля в диапазоне 220--600 нм.

Ацетилирование.

К сухому остатку элюата стероида (10--15 мкг) прибавляют две капли уксусного ангидрида и четыре капли пиридина, оставляют на ночь. Высушивают струей азота, добавляя несколько раз по 0,5 мл метанола.

Реакция с фенилгидразином (Портера -- Сильбера).

Специфична для стероидов с 17, 21-диокси-20-кетогруппировкой (17-ОКС). К сухому остатку элюата стероида или его раствору в 0,5 мл метанола прибавляют 4 мл свежеприготовленного фенилгидразинового реактива. Нагревают на водяной бане 20 мин при 60°С, охлаждают в водопроводной воде. В результате реакции образуются фенилгидразоны, имеющие максимум абсорбции при 410 нм. Фенилгидразиновый реактив состоит из 4,3 мг перекристаллизованного из спирта солянокислого фенилгидразина, растворенного в 10 мл смеси концентрированной серной кислоты (62 мл), дистиллированной воды (38 мл) и перегнанного этанола (50 мл).

Список литературы

1) Биохимия: Учебник / Под ред. Е.Д. Северина. - 2-е изд., испр. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 784 с.

2) Клиническая фармакология НПВС [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.volgadmin.ru/vorma/archiv/4/1.htm. - Дата доступа: 10.09.2015.

3) Praveen Rao1, P.N. Evolution of Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs (NSAIDs): Cyclooxygenase (COX) Inhibition and Beyond / P. N. Praveen Rao1, Edward E. Knaus // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. - 2008. - Vol. 11, № 2. - P. 81-110.

4) Structural analysis of NSAID binding by prostaglandin H2 synthase: time-dependent and time-independent inhibitors elicit identical enzymeconformations / B.S. Selinsky [et al] // Biochemistry. - 2001. - Vol. 40. - P. 5172-5180.

Размещено на Allbest.ru