Вплив альфа-кетоглутарату на стійкість Drosophila me/anogaster до різних токсикантів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив альфа-кетоглутарату на стійкість Drosophila me/anogaster до різних токсикантів

Робота є фрагментом НДР "Вивчення молекулярних механізмів адаптації живих організмів до несприятливих чинників і розробка способів підвищення адаптаційного потенціалу", № держ. реєстрації 0115U002304.

Вступ. Протягом останніх десятиріч плодова мушка Drosophila melanogaster стала популярним модельним об'єктом у токсикологічних дослідженнях. На D. melanogaster вивчається мутагенний, нейротоксичний і ембріотоксичний вплив різних ксенобіотиків (ртуті, свинцю, алюмінію, хрому, пестицидів тощо) та ведеться пошук речовин, які б ослаблювати чи повністю нівелювали ефекти ток- сикантів [3, 4, 13, 15, 17]. У попередніх наших роботах виявлено, що додавання до їжі альфа- кетоглутарату (АКГ) може послаблювати токсичну дію нітропрусиду натрію та етанолу на розвиток D. melanogaster [6, 7]. Альфа-кетоглутарат (АКГ) - важливий інтермедіат циклу Кребса, який бере участь в забезпеченні клітин енергією та в метаболізмі амінокислот, а також може діяти як антиоксидант [7, 8].

Метою даної роботи було дослідити здатність харчового альфа-кетоглутарату послаблювати токсичну дію на розвиток D. melanogaster деяких ксенобіотиків (хлориду алюмінію, біхромату калію, кумену гідропероксиду та 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти), одним з механізмів впливу яких є розвиток оксидативного стресу.

У роботі використано мух D.melanogaster лінії Canton S, наданої Блумінтонським центром стоків (Індіана, США). Експериментальні культури D. melanogaster вирощували на дріжджово-сахарозному середовищі, яке містило 5% сухих пекарських дріжджів, 5% сахарози, 1% агару та 0,18% ніпагіну для запобігання росту цвілевих грибів (контрольне середовище). Залежно від умов експерименту у середовище додатково вносили 10 мМ АКГ (у формі натрієвої солі), 10 мМ AlCl₃, 1 мМ K₂Cr₇O₄, 1 мМ гідропероксид кумену або 5 мМ 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) (дослідні середовища). У кожну банку вносили однакову кількість яєць (по 100 штук). Культивування проводили при 25 °C, постійній вологості та світловому режимі: день:ніч - 16:8. Динаміку лялькування визначати шляхом підрахунку кожного дня, починаючи з 4 доби розвитку, кількості залялькованих личинок до появи останньої лялечки. Кількість спожитої їжі визначали непрямим методом, який базується на визначенні кількості спожитого разом із живильним середовищем харчового барвника діамантового синього FD&C BlueN1, максимум поглинання якого знаходиться при 629 нм [2, 16]. Розділення дорослих мух за статями здійснювали шляхом легкого анастезування СО2.

У кожному повторі індуковану рухову активність визначали для 30 особин кожної статі. Статистичну обробку отриманих даних здійснювали за допомогою комп'ютерної програми “Mynova”. Як статистичні показники брали середнє арифметичне х (М) та похибку середнього арифметичного Sх або m. Порівняння середніх арифметичних проводили за допомогою критерію Даннета.

Результати досліджень та їх обговорення. Нами було досліджено розвиток D. melanogaster на середовищах, які містили додатково 5 мМ 2,4-Д, 10 мМ AlCl₃, 1 мМ K₂Cr₂O₇ та 1 мМ гідропероксиду кумену окремо та у суміші з 10 мМ АКГ. Контрольне середовище не містило токсикантів та АКГ. Концентрації токсикантів були підібрані таким чином, щоб вони ефективно пригнічували розвиток личинок [13, 15]. Концентрація АКГ була взята на основі наших попередніх досліджень [6, 7].

Додавання лише АКГ до живильного середовища не впливало на динаміку заляльковування личинок. Вирощування на середовищі з 5 мМ 2,4-Д суттєво знижувало як швидкість заляльковування, так і кількість утворених лялечок.

Личинки починали лялькуватися лише на 9 добу, тоді як у контролі - на 5-ту. Загальна кількість утворених лялечок на середовищі з 2,4-Д досягала лише 5% від кількості внесених яєць. Токсичність 2,4-Д, очевидно, пов'язана з індукцією сильного оксидативного стресу у тканинах личинок та пошкодженням білків та ліпідів, як це спостерігалось в інших організмів [5, 17]. За сумісного культивування на середовищі з 2,4-Д і АКГ токсична дія 2,4-Д проявлялась слабше: личинки починали ля- льковуватися на сьому добу і загальна кількість утворених лялечок досягала 35%.

За розвитку мух на середовищі з 1 мМ гідропе- роксиду кумену, який є сильним індуктором пероксидного окислення ліпідів [1], захисний ефект АКГ не спостерігався: відсоток утворених лялечок був подібним на середовищах, які містили гідропероксид кумену та суміш «гідропероксид кумену + АКГ» та нижчим на 30%, ніж на контрольному середовищі. Це свідчить про те, що захисні механізми АКГ можуть бути специфічними.

Біхромат калію призводив до зниження швидкості заляльковування та кількості лялечок, порівняно з контролем: личинки починали лялькуватися на сьому добу, і загальна їхня кількість на десяту добу становила 15%. За додавання АКГ до середовища з даним ксенобіотиком спостерігалося як збільшення швидкості заляльковування, так і загальної кількості утворених лялечок - до 45%.

На середовищі з 10 мМ хлоридом алюмінію швидкість заляльковування та загальна кількість утворених лялечок була нижчою на 50%, ніж на контрольному середовищі. За додавання АКГ до їжі з 10 мМ AlCl₃ відсоток залялькованих личинок зростав до 80%.

Динаміка заляльковування D. melanogaster Canton S на дріжджово-сахарозному середовищі, яке містило 1 мМ K2Cr2O7 окремо та у суміші з 10 мМ АКГ, n=4-5 (по 100 яєць у кожному повторі).

Динаміка заляльковування D. melanogaster Canton S на дріжджово-сахарозному середовищі, яке містило 10 мМ ДІСІз окремо та у суміші з 10 мМ АКГ, n=4-7 (по 100 яєць у кожному повторі).

Оскільки наявність токсикантів у середовищі може впливати на швидкість споживання їжі мухами [9, 10] ми визначили інтенсивність споживання їжі личинками ІІІ стадії розвитку, які розвивалися на контрольному середовищі та середовищах, які містили 10 мМ AlCl₃ окремо та у суміші з 10 мМ АКГ (рис. 5).

Наявність 10 мМ AlCl₃ у середовищі не впливала на споживання їжі личинками, проте, неочікува- но, за одночасного додавання АКГ личинки споживали їжі значно більше, ніж контрольні особини та особини на алюміній-вмісному середовищі. Варто зауважити, що додавання лише АКГ до їжі не впливало на інтенсивність харчування личинок [7].

У дводенних мух, вирощених на контрольному та дослідних середовищах, які містили 10 мМ AlCl₃ окремо та у суміші з 10 мМ АКГ, визначили індуковану рухову активність, яка є показником загальної фізіологічної активності мух [12]. Самці і самки, вирощені на середовищі з алюмінієм, мали суттєво нижчу локомоторну активність, ніж контрольні особини.

Відомо, що іони алюмінію можуть викликати порушення у нервовій системі мух [17]. Cвоєю чергою, порушення функціонування нервової системи може зумовлювати зниження локомоторної активності як показника нейром'язової активності мух. За сумісного впливу алюмінію хлориду та АКГ, рухова активність мух не відрізнялась від таких значень у контрольних мух, що свідчить про захисну дію АКГ.

Встановлено, що за сумісного споживання АКГ послаблює токсичну дію низки ксенобіотиків (2,4-Д, AlCl₃, K₂Cr₂O₇) на розвиток D. melanogaster Canton S, що відображається у збільшенні швидкості заляльковування та загальної кількості утворених лялечок. Личинки на середовищі, яке містило AlCl₃ та АКГ споживали значно більше їжі, порівняно з личинками на контрольному та AlCl3-вмісному середовищі. Дводенні самці та самки, вирощені на середовищі з 10 мМ AlCl3, характеризувалися нижчою локомоторною активністю, порівняно з контрольними мухами. Водночас, спостерігалось підвищення рухової активності до контрольних значень у мух, які були вирощені на середовищі з AlCl₃ та АКГ. Отримані результати підтверджують ідею про захисну роль АКГ.

У подальшому планується дослідити детальніше біохімічні механізми захисної дії харчового АКГ у плодової мушки D. melanogaster за впливу ксенобіотиків, зокрема участь антиоксидантної системи, ферментів детоксикації ксенобіотиків та функціонування мітохондрій.

Література

токсичний личинка біхромат калій

1. Lushchak V, Bahniukova T, Luzhna L. Pokaznyky oksydatyvnoho stresu. 2. Peroksydy lipidiv. Ukr biokhim zhurn. 2006; 6: 113-20. [Ukrainian]

2. Rovenko BM. Obmezhennia vmistu vuhlevodiv u diieti lychynok sprychyniuie oksydatyvnyi stres u doroslykh komakh Drosophila melanogaster. Ukr. biokhim. zhurn. 2013; 8 5(5): 61-72. [Ukrainian]

3. Abnoos Н, Fereidoni M, Mahdavi-shahri N, Haddad F, Jalal R. Developmental study of mercury effects on the fruit fly (Drosophila melanogaster). Interdiscip Toxicology. 2013; 6: 34-40. doi: 10.2478/intox-2013-0007.

4. Amrani S, Rizki M, Creus A, Marcos R. Genotoxic Activity of Different Chromium Compounds in Larval Cells of Drosophila melanogaster, as Measured in the Wing Spot Test. Environmental and Molecular Mutagenesis. 1999; 34: 47-51. DOI: 10.1002/(SICI)1098-2280(1999)34:1<47::AID-EM7>3.0.CO;2-B.

5. Atamaniuk T, Kubrak O, Storey K, Lushchak V. Oxidative stress as a mechanism for toxicity of 2,4 dichlorophenoxya- cetic acid (2,4-D): studies with goldfish gills. Ecotoxicology. 2013; 22: 1498-508. DOI: 10.1007/s10646-013-1136-z.

6. Bayliak M, Shmihel H, Lylyk M, Storey KB, Lushchak VI. Alpha-ketoglutarate reduces ethanol toxicity in Drosophila melanogaster by enhancing alcohol dehydrogenase activity and antioxidant capacity. Alcohol. 2016; 55: 23-33. DOI: 10.1016/j.alcohol.2016.07.009.

7. Bayliak M, Shmihel H, Lylyk M, Vytvytska OM, Storey JM, Storey KB, Lushchak VI. Alpha-ketoglutarate attenuates toxic effects of sodium nitrop1russide and hydrogen peroxide in Drosophila melanogaster. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2015; 40: 650-9. DOI: 10.1016/j.etap.2015.08.016.

8. Harrison AP, Pierzynowski SG. Biological effects of 2-oxoglutarate with particular emphasis on the regulation of protein, mineral and lipid absorption/metabolism, muscle performance, kidney function, bone formation and cancerogene- sis, all viewed from a healthy ageing perspective state of the art-review article. J Phisiol Pharmacol. 2008; 59: 91-106.

9. Ihara S, Yoshikawa K, Touhara K. Chemosensory signals and their receptos in the olfactory neural system. Neuroscience. 2009; 254: 45-60. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2013.08.063.

10. Jacob J. A study on food preference in Drosophila. The Scientia Review. 2009. е 234.

11. Gospodaryov DV, Yurkevych IS, Jafari M, Lushchak VI, Lushchak OV. Lifespan extension and delay of age-related functional decline caused by Rhodiola rosea depends on dietary macronutrient balance. Longev. Healthspan. 2013; 2 (1): 1-14. http://dx.doi.org/10.1186/2046-2395-2-12. doi: 10.1186/2046-2395-2-5.

12. Grotewiel MS, Martin I, Bhandari P, Cook-Wiens E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Ageing Res Rev. 2005; 4 (3): 372-97. DOI: 10.1016/j.arr.2005.04.001.

13. Kijak E, Rosato E, Knapczyk K, Pyza E. Drosophila melanogaster as a model system of aluminum toxicity and aging. Insect Sci. 2014; 21 (2): 189-202. DOI: 10.1111/1744-7917.12017.

14. Lushchak OV, Kubrak OI, Nykorak MZ, Storey KB, Lushchak VI. The effect of potassium dichromate on free radical processes in goldfish: Possible protective role of glutathione. Aquatic Toxicology. 2008; 87: 108-14. DOI: 10.1016/ j.aquatox.2008.01.007.

15. Perkhulyn NV, Rovenko BM, Zvarych TV, Lushchak OV, Storey JM, Storey KB, Lushchak VI. Sodium chromate demonstrates some insulin-mimetic properties in the fruit fly Drosophila melanogaster. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2015; 167: 74-80. DOI: 10.1016/j.cbpc.2014.08.007.

16. Scorupa D, Dervisefendic A, Zwiener J, Pletcher SD. Dietary composition specifies consumption, obesity, and lifespan in Drosophila melanogaster. Aging Cell. 2008; 7: 478-90. DOI: 10.1111/j.1474-9726.2008.00400.x.

Размещено на Allbest.ru