Біотехнологія клонального мікророзмноження лаванди

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Біотехнологія клонального мікророзмноження лаванди

Манушкіна Т.М., к. с.-г. н., Миколаївський державний аграрний університет

Бугаєнко Л.О., д.б.н., Кримський інженерно-педагогічний університет

Вступ

Лаванда вузьколистна (Lavandula angustifolia Mill.) є однією з основних ефіроолійних рослин, що культивуються в світі. Ефірна олія та суцвіття лаванди широко використовується в парфумерно-косметичній, фармацевтичній і харчовій промисловостях. В теперішній час вирощування лаванди та одержання ефірної олії в нашій країні зосереджене, в основному, в Криму. В умовах ринкового виробництва планується до 2015 року збільшити площі, зайняті під лавандою, до 10 тис. га, оскільки вирощування цієї культури є рентабельним. Однак розширення насаджень лаванди стримується відсутністю посадкового матеріалу. Шляхом вирішення цієї проблеми може бути розробка більш інтенсивних біотехнологічних методів розмноження замість традиційного живцювання.

В теперішній час в літературі виявлена досить обмежена кількість робіт, пов'язаних з біотехнологічними дослідженнями роду Lavandula L. Аналіз публікацій показує, що більша частина літературних даних присвячена вивченню процесів калусо- і морфогенезу [1, 2], а також накопичення вторинних метаболітів в клітинних культурах лаванди: монотерпеноїдів [3], розмаринової кислоти [4].

Перші дослідження з культури апікальних меристем лаванди розпочаті в Інституті ефіроолійних і лікарських рослин Н.І. Мещеряковою і Г.А. Сарнецьким в 1985 році [5]. Вподальшому проведені нечисленні експериментальні роботи з питання клонального мікророзмноження, присвячені, в основному, вивченню гормональної регуляції морфогенезу апікальних меристем, що показують високу видову і сортову специфічність процесів регенерації рослин лаванди в умовах in vitro [6, 7]. Виходячи з цього, метою наших досліджень було вивчити вплив внутрішніх і зовнішніх чинників на процеси морфогенезу в культурі ізольованих меристем лаванди і розробити ефективні прийоми клонального мікророзмноження нових сортів і перспективних зразків цієї цінної ефіроолійної рослини.

Об'єкти та методи дослідження

морфогенез лаванда мікророзмноження ефіроолійний

Дослідження виконано в лабораторії біотехнології Інституту ефіроолійних і лікарських рослин УААН. Об'єктом дослідження служили рослини L. angustifolia сортів Степова і Синєва та перспективних селекційних зразків 337-9 і 310-17.

Донорні рослини вирощували в умовах закритого грунту. Як експланти використовували апікальні меристеми висотою 0,2-1,0 мм, які виділяли з верхівкових та пазушних бруньок стебла однорічних рослин. При проведенні експериментальної роботи застосовували загальноприйняті методи в культурі ізольованих тканин рослин [8]. Для культивування ізольованих меристем та мікроживців використовували як базове живильне середовище Мурасиге і Скуга (МС) [9]. На кожному з етапів клонального мікророзмноження модифікували гормональний склад живильних середовищ відповідно до необхідного шляху морфогенезу, доповнюючи їх кінетином, бензиламінопурином (БАП), гібереловою кислотою (ГК), нафтилоцтовою кислотою (НОК), індолілоцтовою кислотою (ІОК), індолілмасляною кислотою (ІМК), препаратами емістим С і етамон. Експланти культивували в термостатованій культуральній кімнаті при температурі 25-26 єС, освітленості 2-3 клк, відносній вологості повітря 60-70 %.

Результати та обговорення

У процесі досліджень вивчали особливості морфогенезу ізольованих апікальних меристем лаванди в культурі in vitro, визначали вплив ендо- та екзогенних факторів і підбирали оптимальні умови для розвитку експлантів на чотирьох етапах клонального мікророзмноження: ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro; власне мікророзмноження; укорінення мікропагонів; адаптація мікророслин до умов in vivo.

Ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro. Стерилізацію експлантів проводили послідовним витримуванням фрагментів пагонів у 70 %-ному етанолі 40 секунд, 50 %-ному розчині препарату “Брадофен” 12 хвилин, і тричі промивали в автоклавованій дистильованій воді. Дослідження показали, що такий спосіб стерилізації забезпечував вихід стерильних меристем на рівні 100,0 %, приживлюваність меристем складала 96-100 %. Підбір оптимальної концентрації гормонів проводили на основі живильного середовища МС, що містило 0,7 % агару. В результаті досліджень встановлено, що ізольовані меристеми лаванди характеризуються високою регенераційною здатністю - частота регенерації пагонів складала 85-100 % на всіх варіантах живильного середовища. Оптимальним визначено живильне середовище, доповнене кінетином (1,0 мг/л) і ГК (1,0 мг/л) - МС5, на якому частота регенерації складала 100 %, розвивався основний пагін висотою 19,33-42,98 мм з 5-8 парами листків і 3,03-7,81 шт. додаткових пагонів.

Слід зазначити, що у лаванди на першому етапі клонального мікророзмноження множинне пагоноутворення відбувалося, в основному, за рахунок формування адвентивних пагонів, тоді як кількість бічних пагонів, що розвивалися з пазушних бруньок, складала лише 9,1-17,7 % від загальної кількості додаткових пагонів на один експлант. Поряд із загальними особливостями морфогенезу меристем лаванди в культурі in vitro виялено значні відмінності між досліджуваними генотипами за кількісними показниками основних біометричних параметрів мікророслин. Виявлені відмінності в рості основного та додаткових пагонів на першому етапі клонального мікророзмноження зумовлювали різні коефіцієнти розмноження: у сорту Синєва - 1:12,42, у сорту Степова - 1:10,06, у зразку 337-9 - 1:8,55, у зразку 310-17 - 1:7,18.

Проведене дослідження не виявило суттєвої різниці в регенераційній здатності апікальних меристем лаванди, виділених з верхівкових і пазушних бруньок пагону. У всіх генотипів лаванди спостерігалася висока частота регенерації - 90,0-100,0 %, і частота формування множинних пагонів - 68,8-100,0 % при культивуванні меристем, що були виділені як з верхівкових, так і з пазушних бруньок пагону.

Апікальні меристеми лаванди вводили в культуру in vitro в чотири строки, які відповідали окремим фенофазам: у квітні - у фазу весняного відростання, в третій декаді червня - першій декаді липня - у фазу бутонізації-початку цвітіння, в жовтні - у фазу осіннього відростання, в січні - в період спокою. У всі строки введення в культуру in vitro меристеми виявилися здатними регенерувати рослини з високою частотою - 90,0- 100,0 %, і утворювати адвентивні пагони з частотою 85,0-100,0 %. Поряд з цим установлено, що оптимальним строком для введення меристем є фази весняного і осіннього відростання пагонів (місяці квітень і жовтень), коли регенерували рослини з нормальними морфологічними ознаками, формувалися найвищі основні пагони і найбільша кількість додаткових пагонів.

Власне мікророзмноження. На даному етапі як експланти використовували мікроживці, які одержували при розділенні основного пагону меристемних рослин на фрагменти довжиною 4-8 мм з однією парою листків та відокремленні додаткових пагонів довжиною 4-8 мм з однією парою розгорнутих листків. Найбільш оптимальний розвиток мікропагонів відбувався на живильному середовищі МС5. Для одержання максимальної кількості мериклонів при подальшому субкультивуванні поєднували мікроживцювання основних пагонів та відділення додаткових пагонів. Генотипічні особливості сортів та зразків обумовлювали різну інтенсивність ростових процесів і, як наслідок, різні коефіцієнти розмноження: у сорту Синєва - 1:11,12, у сорту Степова - 10,42, у зразку 337-9 - 1:11,83, у зразку 310-17 - 1:6,72.

Вивчення особливостей розвитку меристемних рослин лаванди протягом десяти пасажів показало, що вони характеризуються високою регенераційною здатністю протягом всього терміну культивування in vitro. Частота регенерації у сортів Синєва, Степова і зразка 337-9 залишалася стабільно високою до 10-го пасажу і складала 80,0-100,0 %. Найнижчою регенераційною здатністю відрізнявся зразок 310-17, у якого, починаючи з 5-го пасажу, частота регенерації пагонів знижувалася до 72,5-47,5 %. При цьому у досліджуваних генотипів не спостерігалося різких коливань коефіцієнта розмноження в різних пасажах, і цей показник зберігався на стабільному рівні у сорту Синєва і зразку 337-9 до 8-го пасажу (1:7,77-12,45 і 1:7,60-11,85 відповідно), у сорту Степова до 7-го пасажу (1:6,19-11,81), у зразку 310-17 - до 6-го пасажу (1:6,14-8,37). Таким чином, при клональному мікророзмноженні лаванди доцільно проводити 6-8 пасажів залежно від генотипу.

Укорінення мікропагонів в умовах in vitro. Найбільш ефективним для індукції коренеутворення у мікропагонів лаванди визначено живильне середовище ЅМС, доповнене ІМК та ІОК в концентрації по 0,5 мг/л - МС18, на якому частота укорінення становила 100,0 % у сортів Синєва, Степова і у зразку 337-9, та 85,0 % у зразку 310-17. В наших дослідженнях випробовували також ефективність рістрегулюючих препаратів емістиму С та етамону для стимулювання коренеутворення у мікропагонів лаванди в умовах in vitro. Показано, що при включенні до складу живильних середовищ емістиму С в розведенні 10-6 та етамону в концентрації 0,001 % частота укорінення мікропагонів складала 90,0-100,0 %.

Адаптація мікророслин до умов in vivo. Для адаптації відбирали мікророслини лаванди з добре розвиненою кореневою системою і висаджували в горщечки об'ємом 200 мл зі стерильним субстратом різного складу. Горщечки з рослинами розміщували під плівковим укриттям і культивували при температурі 18-20 єС і постійному зволоженні. Найвища приживлюваність мікророслин всіх генотипів - 95,0-100,0 % була забезпечена на субстраті торф: перліт: грунт: пісок у співвідношенні 2:1:1:1. Визначено, що для адаптації меристемних рослин лаванди до умов in vivo достатньо періоду 14 днів, за які формується 2-3 пари листків. Після періоду адаптації плівкове укриття знімали і рослини культивували в звичайних умовах ще 46 днів. Меристемні рослини лаванди мали типові для сортів та зразків морфологічні ознаки: форму куща, листків, суцвіття, забарвлення квіток. У жодному випадку у мериклонів не було відмічено морфологічних відхилень від норми.

В результаті досліджень вивчено особливості морфогенезу ізольованих меристем лаванди (рис. 1) та розроблено всі етапи технології клонального мікророзмноження цієї культури.

А б в г

Рис. 1. Морфогенез ізольованих меристем лаванди на чотирьох етапах клонального мікророзмноження: а - ізолювання експланту, введення і ініціація його розвитку в умовах in vitro; б - власне мікророзмноження; в - укорінення мікропагонів; г - адаптація мікророслин до умов in vivo

За розробленою біотехнологією в середньому за рік можна провести шість пасажів. Кількість мікроживців з однієї ізольованої меристеми за цей період значно відрізнялася у досліджуваних генотипів і складала: у сорту Синєва - 23,1 млн. шт., у сорту Степова - 6,0 млн. шт., у зразку 337-9 - 9,3 млн. шт., у зразку 310-17 - 1,1 млн. шт. При одержанні саджанців за рік можна провести етап введення, чотири пасажі на етапі власне мікророзмноження, етапи укорінення мікропагонів і адаптації до умов in vivo. Сумарний вихід саджанців з однієї меристеми за рік складав: у сорту Синєва - 208 тис. шт., у сорту Степова - 119 тис. шт., у зразку 337-9 - 149 тис. шт., у зразку 310-17 - 23 тис. шт.

Висновки

1. Вивчено особливості морфогенезу в культурі ізольованих апікальних меристем L. angustifolia сортів Синєва, Степова та перспективних селекційних зразків 337-9 і 310-17.

2. На основі результатів досліджень розроблено біотехнологію клонального мікророзмноження лаванди.

Список літератури

1. Quazi M.H. In vitro multiplication of Lavandula spp. / M.H. Quazi // Ann Bot. - 1980. - V.45, №3. - P. 361-362.

2. Calvo M.C. In vitro morphogenesis from explants of Lavandula latifolia and Lavandula stoechas seedlings / M.C. Calvo, J. Segura // Scientia Hort. - 1988. - № 36. - P. 131-137.

3. Lappin G.J. Biotransformation of monoterpenoids by suspension cultures of Lavandula angustifolia / G.J. Lappin, J.D. Stride, J. Tampion // Phytochemistry. - 1987. - V. 26, №4. - P. 995-997.

4. Pavlov A.I. Nutrient medium optimization for rosmarinic acid production by Lavandula vera MM cell suspension / A.I. Pavlov, M.P. Ilieva, I.N. Panchev // Biotechnol. Progr. - 2000. - 16, №4. - P. 668-670.

5. Мещерякова Н.И. Перспективы использования метода меристематических верхушек in vitro в селекции эфиромасличных растений / Н.И. Мещерякова, Г.А. Сарнецкий // Основные направления научных исследований по интенсификации эфиромасличного производства: Тез. докл. и сообщений Всесоюзного научно-технического совещания. - 1985. - С. 39.

6. Alimgazinova B.Sh. New technologies in plant breeding / Alimgazinova B.Sh. // Нетрадиционное растениеводство, экология и здоровье: Труды VIII Междунар. симп. - Симферополь, 1999. - C. 269-270.

7. Егорова Н.А. Микроразмножение лаванды in vitro / Н.А. Егорова // Вісник Харківського національного аграрного університету. Сер. Біологія. - 2002. - №9 (1). - С. 65-71.

8. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии культурных растений / Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е.. - К.: Наук. думка, 1980. - 488 с.

9. Murachige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murachige, F. Skoog // Physiol. plant. - 1962. - 15, N13. - P. 473-497.Размещено на Allbest.ru