Совершенствование производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ХОЛЕРНОЙ БИВАЛЕНТНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ

Ульянов А.Ю.

Саратов - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент

Никифоров Алексей Константинович кандидат технических наук, доцент Комиссаров Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович доктор медицинских наук, профессор Елисеев Юрий Юрьевич

Ведущая организация:ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Защита состоится 15 декабря 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «___» ноября 2011 г. и размещен на сайте Минобрнауки РФ.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Карпунина Л.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последнее десятилетие характеризуется продолжающимися крупными эпидемиями и вспышками холеры, в основном, в странах Африки и Азии. Между тем, крупная вспышка холеры, возникшая на Гаити в 2010 г., говорит о том, что данная инфекция не имеет континентальных границ. Неблагополучная эпидемиологическая обстановка в мире усугубляется межконтинентальными, меж- и внутригосударственными заносами инфекции (Онищенко и др., 2011). В странах СНГ, в том числе в России, эпидемиологическая ситуация оценивается как неустойчивая и нестабильная. Это обусловлено регистрацией заносных случаев и ежегодной изоляцией холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп из объектов окружающей среды (Ломов и др., 2006).

Эпидемиологическая обстановка по холере в России на данный момент обусловлена завозами инфекции из-за рубежа, что связано с миграцией населения, установлением регулярных туристических, экономических связей с зарубежными странами, неблагополучными по этой инфекции (Москвитина, 2008; Онищенко и др., 2007; 2011).

Наиболее эффективными средствами профилактики холеры являются медицинские иммунобиологические препараты (Кутырев и др., 2006). В 2001 году в России вакцинация против холеры была включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям.

Отечественная холерная бивалентная химическая вакцина, разработанная в РосНИПЧИ «Микроб» и содержащая основные протективные антигены Vibrio cholerae О1 классического биовара: холероген-анатоксин, а также О1 антиген сероваров Инаба и Огава не уступает по эффективности зарубежным холерным вакцинам (Кутырев и др., 2006; Щуковская и др., 2009).

Одним из основных этапов получения вакцин является процесс культивирования микроорганизмов. В производстве российской холерной вакцины используются морально устаревшие ферментеры вместимостью 0,5 м3, практически исчерпавшие свой технологический ресурс.

Развитие микробиологической биотехнологии на современном этапе невозможно без совершенствования ферментационной аппаратуры. В промышленности, отмечается существенное отставание технологического уровня производственных мощностей (Распоряжение Правительства РФ…, 2010), в том числе аппаратурного обеспечения ферментационных процессов. Таким образом, проведение исследований по разработке и конструированию экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона в производстве вакцины холерной бивалентной химической таблетированной является актуальной научно-практической и прикладной задачей.

К недостаткам существующей технологии производства отечественной холерной химической вакцины можно отнести также многоступенчатые и затратные этапы выделения нативных антигенов.

В 90-х годах была показана принципиальная возможность концентрирования и очистки О-антигена (О-АГ) холерного вибриона с использованием ультрафильтрации на полых волокнах (Громова и др., 1999), что позволило разработать масштабируемую технологию концентрирования одного из компонентов холерной химической таблетированной вакцины - О-АГ холерного вибриона штамма М41 серовара Огава с использованием ультрафильтрационных модулей на полых волокнах (Дятлов и др., 2001; Нижегородцев, 2003).

Выделение второго компонента вакцины - О-АГ и холерогена-анатоксина (ХА) холерного вибриона штамма 569В серовара Инаба осуществляется осаждением сульфатом аммония непосредственно из безмикробного детоксицированного центрифугата, что приводит к значительному расходу осадителя.

Одним из перспективных направлений, применяемых в технологиях производства химических вакцин, является концентрирование нативных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией. Использование мембранных модулей с разными номинальными отсечками по молекулярной массе (НОММ) позволяет концентрировать антигены с различной молекулярной массой, практически без потерь целевого продукта. Таким образом, актуальность научных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации является очевидной.

В этой связи разработка и конструирование экспериментального образца ферментера пригодного для глубинного управляемого, стандартизированного культивирования производственных штаммов холерного вибриона и создание экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба является важным и перспективным направлением научных исследований.

Цель работы: усовершенствовать производство вакцины холерной бивалентной химической таблетированной за счет внедрения в производственный процесс сконструированного биореактора и обоснования возможности использования разработанного процесса концентрирования протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба.

Задачи исследования:

1. Сконструировать биореактор и провести его апробацию в технологическом процессе производства вакцины.

2. Исследовать процесс глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов в разработанном биореакторе.

3. Разработать экспериментальную технологию концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации и обосновать предложения по ее внедрению в производство бивалентной химической таблетированной холерной вакцины.

4. Изучить свойства препаратов протективных антигенов холерного вибриона полученных с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии.

5. Дать сравнительную характеристику свойств экспериментальных серий и коммерческого препарата таблетированной холерной вакцины.

Научная новизна заключается в том, что в ней предложена оригинальная конструкция биореактора, защищенная патентом на полезную модель № 86184 «Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов».

Впервые обоснована и разработана экспериментальная технология концентрирования протективных антигенов холерного вибриона тангенциальной ультрафильтрацией; установлено, что наиболее целесообразно проведение технологического процесса концентрирования О-АГ и ХА V. cholerae 569В серовара Инаба с использованием ультрафильтрационных мембран с НОММ, равной 50 кДа.

Научно обоснована и проведена оптимизация технологического процесса концентрирования. Показано, что для интенсификации процесса мембранного концентрирования необходимо его проведение при следующих параметрах: температура - (37±2)0С, давления на входе и выходе фильтрационной установки - (2,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно.

Определён состав лиофилизированных протективных антигенов V. cholerae 569В серовара Инаба по основным белковым и полисахаридным компонентам, даны сравнительные характеристики нового и традиционного препаратов. В результате сравнительного анализа иммунохимических, физико- и биохимических свойств протективных антигенов полученных по регламентной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показана их идентичность. Выявлено, что готовая форма вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученная по разработанной технологии по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют нормируемым требованиям и не отличается от коммерческого препарата, полученного по регламентной технологии.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработанный биореактор был успешно апробирован в технологическом процессе производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. На биореакторе проведено восемь выращиваний производственных штаммов холерного вибриона. Полуфабрикаты полученных протективных антигенов соответствовали требованиям нормативной документации.

С учетом конструкционных особенностей аппарата и технологии культивирования штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона разработаны инструкция по эксплуатации ферментера и стандартные операционные процедуры.

На основании проведенных исследований по разработке экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов тангенциальной ультрафильтрацией обоснованы предложения по её внедрению в производство холерной вакцины.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Концентрирование протективных антигенов холерного вибриона методом тангенциальной фильтрации», одобренные Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 2 от 18 марта 2011 г.) и утверждённые директором института 11 июня 2011 г. Получен патент РФ на полезную модель № 86184. Разработанный биореактор в соответствии с актом утвержденным директором института 28 марта 2008 г. введен в эксплуатацию.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработан и создан биореактор с высоким уровнем биологической защиты.

2. Культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативных О-антигена и холерогена, при сохранении их физиологических и морфологических свойств.

3. Предложена оптимальная технология концентрирования тангенциальной ультрафильтрацией протективных антигенов Vibrio cholerae 569В серовара Инаба.

4. Экспериментальные серии вакцины, полученные с использованием разработанных биореактора и технологии концентрирования протективных антигенов холерного вибриона, по показателям качества соответствуют требованиям нормативной документации на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

Работа выполнена в ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках научно-исследовательской темы № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на: 15 международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХI века», (Пущино, 2010); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010», (Саратов, 2010); Совещании проблемной комиссии 46.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей в себя объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, списка используемых литературных источников, включающего 206 источников, и приложений. Работа изложена на 140 страницах и иллюстрирована 20 рисунками, 14 таблицами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

В работе использованы 2 штамма V. cholerae М-41 серовара Огава и 569В серовара Инаба, являющиеся продуцентами холерной химической вакцины. Штаммы V. cholerae 3122-Р серовара Oгава и V. cholerae 879-М серовара Инаба использовались для контроля иммуногенности препаратов.

Определение ионов аммония и сульфат-ионов, концентрации белка, остаточного формальдегида, рН, мутности (оптической плотности), потери в массе при высушивании проводили в соответствии с методиками, изложенными в «Методических указаниях…» (МУК 4.1/4.2.588-96, 1998).

Содержание белка в растворах определяли биуретовым методом на фотоэлектрическом концентрационном колориметре КФК-2МП. Измерение мутности (оптической плотности) осуществляли на фотоэлектроколориметре КФК-2 УХЛ-4,2 в кювете № 10 при рабочей длине волны л ? 590 нм.

Выращивание V. cholerae штамм М-41 серовара Огава и V. cholerae штамм 569 В серовара Инаба с целью получения протективных антигенов проводили на разработанном биореакторе и реакторе-ферментере марки Р170, установленных на аппаратурно-технологической линии производства холерной химической вакцины.

Для концентрирования протективных антигенов холерного вибриона применяли установки для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-009 с площадью фильтрации равной 0,1 м2.

Выделение протективных антигенов после этапа осаждения сульфатом аммония осуществляли на сверхцентрифугах СГО-100 и Beckman при 15000 и 10000 g соответственно.

Хроматографическое фракционирование осуществляли на системе для хроматографии Biologic LP (Bio-Rad, США) с использованием колонки длиной 30 см с внутренним диаметром 5,0 см.

Электрофоретический контроль выделенных фракций осуществляли по U.K. Laemli (1970) на системе для электрофореза «Mini protean II» фирмы «Bio-Rad» (США).

Для изучения специфической активности препаратов in vitro использовали метод дот-иммуноанализа с применением конъюгата диагностикума эритроцитарного холерного антительного с коллоидным золотом с использованием нитроцеллюлозных мембран «Millipore» (США) с размером пор 0,45 мкм.

Определение ферментов проводили путём использования специальных твёрдых агаровых сред по разработанным методам (Уралева и др., 1984; Джапаридзе и др. 1986; Кузьмиченко и др., 2002).

Содержание углеводов определяли по реакции с фенолом и серной кислотой (Захарова и др., 1982). Количество нуклеиновых кислот измеряли по методу, описанному А.С. Спириным (1958). Высокоэффективную жидкостную хромотографию проводили на колонке размером 7,5x300 мм, заполненной Spherogel ТК 3000 SW.

Определение содержания О-АГ, холерогена-анатоксина (ХА) определяли с О1 сывороткой и антихолерогенной сывороткой (АХС) в реакции иммунной диффузии (РИД). Определение содержания О-АГ проводили в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумом эритроцитарным холерным антительным в полистироловых пластинах микротитратора Такачи.

Определение концентрации холерных вибрионов осуществляли по отраслевому стандартному образцу мутности на 5 или 10 ед. Определение иммуногенности проводили в тесте активной защиты на белых беспородных мышах. Специфическую безвредность (остаточную токсичность) проверяли в полуфабрикате специфической фракции Инаба на кроликах сосунках. Специфическую безопасность вакцины определяли на кроликах породы шиншилла. Антигенную активность по анатоксиносвязыванию (ЕС) определяли в готовой продукции и полуфабрикате Инаба, на кроликах породы шиншилла. Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьёв, 1962).

Результаты исследований и их обсуждение

Конструирование и характеристики ферментера на базе реактора РЗРЯ-6/0,63

Анализ данных литературы и нормативной документации позволили обосновать требования к разрабатываемому биореактору, основными из которых являются:

общий объем - не менее 0,5, но не более 1,0 м3;

отсутствие нижнего слива и наличие сифона (трубы передавливания), погруженной на расстояние 2-5 мм от днища биореактора;

система аэрации должна обеспечивать подачу в культуральную жидкость стерильной газовой среды и не травмировать клетки. Должна включать в себя: барботер обеспечивающий подачу газовой смеси, стерилизуемый паром фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм на подаче сжатого воздуха в фильтродержателе, из нержавеющей стали с комплектом необходимой арматуры и труб для процесса стерилизации;

система обеззараживания воздуха, выходящего из биореактора, должна иметь конденсор из нержавеющей стали и стерилизуемый паром фильтр с порогом отсечения 0,2 мкм на выходе воздуха в фильтродержателе из нержавеющей стали с комплектом необходимой арматуры и труб для процесса стерилизации;

диапазон оборотов мешалки - 50ч800 об/мин с возможностью ручной корректировки;

оборудование должно обеспечивать технологическую возможность on-line измерения оптической плотности культуральной среды и контроль рН. При использовании данных систем не должно создаваться угрозы контаминации культуральной среды;

передача крутящего момента на вал мешалки через магнитную муфту, расположенную на верхней крышке биореактора.

Для конструирования биореактора был выбран химический реактор РЗРЯ-6/0,63, исходя из того, что он удовлетворял ряду обоснованных нами критериев.

Для реализации требований биологической безопасности и обоснованных нами критериев были сконструированы и изготовлены следующие системы: аэрации, обеспечивающая подачу стерильного воздуха в культуральную среду; обеззараживания воздуха, выходящего из биореактора; подачи корригирующих растворов; пеногашения; контроля физико-химических параметров процесса культивирования; перемешивания; автоматического управления температурой, необходимой для культивирования холерных вибрионов.

Ферментационная установка на базе реактора РЗРЯ-6-0,63 вместимостью 0,63 м3, представленная на рисунке 1, содержит корпус с термостатирующей рубашкой 1, снабженный крышкой 2. На крышке смонтированы технологические патрубки для подсоединения культурального сосуда к материальным трубопроводам и системам; кран разрыва 3, выполненный по типу сильфонного вентиля к которому подключены сифонная трубка 4 и барботер 5; датчики давления и температуры; частотно регулируемый электродвигатель 6, передающий крутящий момент на вал перемешивающего устройства через цилиндрическую магнитную муфту 7, снабженную разделительной мембраной 8. На валу перемешивающего устройства закреплены крыльчатка пеногашения 9 и турбинная мешалка 10. Вал подвижно установлен на подшипниках скольжения в верхней и нижней опорах корпуса. Турбинная мешалка выполнена в виде цилиндра с лопатками с перфорированной сеткой по периферии, с целью повышения массообменных процессов и аэрации среды.

В корпусе установлены сифонная трубка, соосно расположенные барботер, группы отбойников, при этом барботер и сифонная трубка в пределах культурального сосуда в верхних их частях подключены к крану. Процесс культивирования обеспечивают следующие, подключенные посредством трубопроводов через запорно-регулирующую арматуру сильфонного типа к штуцерам культурального сосуда системы: система подачи воздуха 11 содержащая стерилизуемые паром фильтры из нержавеющей стали предварительной и стерильной очистки (порог отсечения примесей 0,2 мкм) воздуха 12, расходомер 13; система очистки отработанного воздуха 14 содержащая конденсатосборник из нержавеющей стали 15, группу теплообменников 16, каскад стерилизуемых паром фильтров тонкой очистки из нержавеющей стали 17 (порог отсечения примесей 0,2 мкм), вакуумный насос 18; система подачи корригирующих растворов 19, включающая емкости 20 для содержания корригирующих растворов, оборудованные дыхательными фильтрами 21, перистальтические насосы 22; система контроля физико-химических параметров среды и культивирования 23 содержит, измерительную кювету 24, с размещенными в ней датчиками рН, рО2, кювету оптической плотности 25 и воздухоотделитель, насос с магнитным приводом 26; патрубок с сильфонным вентилем и гибким шлангом на конце, предназначенный для приема-выдачи среды, взятия проб, наполнения-опорожнения корпуса во время мойки; термостатирующую систему 27 включающую емкость с термонагревательными элементами 28, датчиками контроля уровня и температуры 29 и циркуляционный насос 30.

Оригинальными техническими решениями и устройствами, повышающими биологическую безопасность и выгодно отличающими разработанный нами биореактор явились:

использование в конструкции биореактора верхнего осевого магнитного привода перемешивающего устройства с герметичной мембраной и применение частотно-регулируемого электропривода, который позволяет регулировать скорость вращения мешалки;

исполнение турбинной мешалки выполненной в виде цилиндра с лопатками с перфорированной сеткой по периферии, что приводит к интенсификации массообменных процессов;

предложенная нами конструкция кюветы системы контроля физико-химических параметров процесса культивирования;

Рис. 1. Схема сконструированного ферментера (пояснения в тексте)

внедрение в конструкцию биореактора крана, к которому во внутренней полости реактора подключены сифонная трубка и барботер, что предоставляет возможность стерилизовать питательную среду, находящуюся в реакторе, внутреннюю полость реактора, соединительные штуцера и патрубки, присоединительные элементы и линии на месте, а не пропусканием через него предварительно подготовленного и очищенного острого пара.

Таким образом, разработанный биореактор, включающий культуральный сосуд с термостатирующей рубашкой и крышкой, оснащенный технологическими патрубками, снабженный перемешивающим устройством с магнитным приводом, барботером, сифонной трубкой, отличающийся тем, что магнитный привод перемешивающего устройства с турбинной мешалкой расположен на крышке реактора и оснащен разделительной мембраной, барботер и сифонная трубка в пределах культурального сосуда выше уровня заполнения жидкости подключены к крану, выполненному таким образом, что в открытом положении барботер и сифонная трубка сообщаются с полостью реактора; к технологическим патрубкам через запорно-регулирующие вентили подключены термостатирующая система, система подачи воздуха, система очистки отработанного воздуха, система подачи корригирующих растворов, система контроля физико-химических параметров среды культивирования, содержащая насос с магнитным приводом, воздухоотделитель и кювету с датчиками контроля роста микроорганизмов.

На следующем этапе работы определили, что условия культивирования микроорганизмов в новом реакторе идентичны таковым в используемых в данное время аппаратах. Проведенные исследования по определению коэффициента массопередачи газ-жидкость на существующем и разработанном ферментационном оборудовании показали, что в сконструированном биореакторе возможно достижение значений коэффициента соответствующих производственным режимам перемешивания и аэрирования, что позволяет осуществить масштабный переход условий выращивания холерного вибриона.

Дальнейшей задачей стало исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов холерной вакцины на сконструированном биореакторе.

Было показано, что кинетика роста биомассы холерных вибрионов V. сholerae М 41 Огава и 569В Инаба и динамика накопления протективных антигенов, представленные на рисунке 2 и в таблицах 1 и 2, практически не отличаются от аналогичных показателей в существующих производственных реакторах, при этом полученные полупродукты соответствуют нормируемым требованиям. биореактор концентрирование тангенциальный антиген



Рис. 2. Кинетика роста биомассы холерных вибриона штаммов V. сholerae М-41 Огава (а) и 569В Инаба (б)

Таблица 1 - Кинетика накопления О-антигена холерного вибриона штамма V. сholerae М-41 Огава

Продолжительность выращивания, ч	Содержание О-антигена в РИД с О1 сывороткой, обратный титр	Нормируемое значение
	Производственный реактор	Сконструированный реактор
5	0	1	“-”
6	1	2	“-”
7	2	4	“-”
8	6	8	“-”
9	10	12	“-”
10	10	12	8

Примечание. “-” - требования отсутствуют.

Таблица 2 - Кинетика накопления О-антигена и холерогена холерного вибриона штамма V. сholerae 569В Инаба

Продолжительность выращивания, ч	Содержание О-антигена в РИД с О1 сывороткой, обратный титр	Содержание токсина в РИД с АХС
	Производственный реактор	Сконструированный реактор	Нормируемое значение	Производственный реактор	Сконструированный реактор	Нормируемое значение
5	1	1	“-”	1	1	“-”
6	2	2	“-”	2	2	“-”
7	6	6	“-”	3	3	“-”
8	10	10	“-”	4	4	“-”
9	10	10	8	4	4	4

Примечание. “-” - требования отсутствуют.

Изучение физиологических потребностей в источниках углерода производственных штаммов холерных вибрионов, представленных на рисунках 3 и 4, показало на практически полное совпадение временных профилей рH среды культивирования и количества глюкозы на производственном и сконструированном биореакторах при выращивании холерных вибрионов V. сholerae 569В Инаба и М 41 Огава.

Рис. 3. Временные профили рH среды культивирования и количества глюкозы на производственном (а) и сконструированном (б) биореакторах при выращивании холерного вибриона штамма V. сholerae 569В Инаба

Рис. 4. Временные профили рH среды культивирования и количества глюкозы на производственном (а) и сконструированном (б) биореакторах при выращивании холерного вибриона штамма V. сholerae М 41 Огава

Морфологические свойства производственных штаммов холерных вибрионов на всех этапах культивирования на новом и старом ферментационном оборудовании также не отличались.

Таким образом, экспериментально доказана возможность культивирования производственных штаммов холерных вибрионов с целью получения кондиционных нативных протективных антигенов на разработанном биореакторе.

Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В серовара Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации

На первоначальном этапе исследований оценивали возможность использования мембран с номинальной отсечкой по молекулярной массе 20 кДа для концентрирования протективных антигенов при следующих технологических параметрах: давления на входе и выходе фильтрационной установки - (1,5±0,1) и (0,5±0,1) кгс/см2 соответственно; температура проведения процесса - (8±2)0С; кратность концентрирования ? в 10 раз. Результаты сравнительного анализа исходного центрифугата, концентрата и фильтрата показали, что целевые продукты сохранялись в концентрате и отсутствовали в фильтрате. Титры О-АГ и ХА при этом возросли в 16 раз. Для проведения сравнительной оценки качества препаратов ХА и О-АГ, полученных по регламентной и экспериментальной технологии были получены сухие образцы и исследованы их свойства. Значения показателей сухих препаратов О-АГ и ХА приготовленных по экспериментальной технологии соответствовали нормируемым и значимо не отличались друг от друга, а «выход» (по соотношению вес сухого полуфабриката на объем безмикробного центрифугата) превышал значения показателей препаратов О-АГ и ХА полученных по регламентной технологии. При этом количество сульфата аммония, затраченного на осаждение по разработанному способу уменьшилось в 10 раз (табл. 3).

Таблица 3 - Сравнительный анализ показателей качества препарата холерогена-анатоксина и О-антигена, полученных по регламентной технологии и с использованием предварительного концентрирования мембранным способом (n=3)

Наименование показателя	Значение показателя качества препарата ХА и О-АГ
	полученного по регламентному способу	полученного по экспериментальной технологии
Объем безмикробного центрифугата, дм3	10,0	10,0
Специфическая активность ХА, единиц связывания анатоксина	6000	6000
Содержание О-АГ, обратный показатель титра в реакции непрямой агглютинации с О1 сывороткой	256	256
Количество продукта, г	2,5	3,0

С целью увеличения производительности процесса концентрирования исследовали возможность использования мембран со следующими НОММ - 30, 50 и 100 кДа. Проведенные исследования показали, что использование мембранного модуля с НОММ 100 кДа для концентрирования нецелесообразно, так как значительная часть ХА проходит в фильтрат. При использовании других мембранных модулей для концентрирования безмикробных центрифугатов содержание О-АГ и ХА в концентрате увеличивается в 16 раз, при этом О-АГ и ХА в фильтрате не обнаруживается. Наибольшая средняя удельная скорость фильтрации была определена при использовании мембранного модуля с НОММ 50 кДа, что делает их применение более предпочтительным.

Следующим этапом исследований была оптимизация технологического процесса концентрирования протективных антигенов по следующим критериям: установление оптимальной степень концентрирования; обоснование оптимальных параметров процесса концентрирования по давлению и температуре.

Было установлено, что при концентрировании ХА и О-АГ из безмикробного центрифугата в 15 и 20 раз происходили их потери, что отсутствовало при степени концентрирования в 10 раз.

По результатам проведенных исследований выявлено, что оптимальными параметрами давления проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембран с различными НОММ являются: давления на входе и выходе фильтрационной установки, равные 2,5±0,1 и 0,5±0,1 кгс/см2 соответственно, при которых наблюдалась максимальная средняя удельная скорость фильтрации (табл. 4).

Таблица 4 - Результаты исследований по обоснованию оптимальных параметров давления проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембранных модулей с номинальными отсечками по молекулярной массе 20, 30 и 50 кДа (n=3)

Значения давления, кгс/см2	Содержание О-АГ в РИД с О1 сывороткой, обратный титр	Содержание ХА в РИД с АХС, обратный титр	Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час
на входе в установку	на выходе установки
		“20”	“30”	“50”	“20”	“30”	“50”	“20”	“30”	“50”
1,5±0,1	0	64	64	64	32	32	32	16	20	31
2,0±0,1	0	64	64	64	32	32	32	17	21	33
2,5±0,1	0	64	64	64	32	32	32	19	28	35
3,0±0,1	0	64	64	64	32	32	32	18	26	32
1,5±0,1	0,5±0,1	64	64	64	32	32	32	21	34	39
2,0±0,1	0,5±0,1	64	64	64	32	32	32	23	37	43
2,5±0,1	0,5±0,1	64	64	64	32	32	32	29	40	48
3,0±0,1	0,5±0,1	64	64	64	32	32	32	26	38	44
1,5±0,1	1,0±0,1	64	64	64	32	32	32	17	22	33
2,0±0,1	1,0±0,1	64	64	64	32	32	32	19	25	36
2,5±0,1	1,0±0,1	64	64	64	32	32	32	23	29	40
3,0±0,1	1,0±0,1	64	64	64	32	32	32	21	27	37

Примечание. “20”, “30” и “50” ? мембранные модули с НОММ 20, 30 и 50 кДа соответственно.

Изучение температурных режимов проведения процесса концентрирования ХА и О-АГ - (8±2), (20±2) и (37±2)0С показало на увеличение средней удельной скорости фильтрации при температуре (37±2)0С, в среднем, в 1,5 и 1,3 раза в сравнении с температурами (8±2) и (20±2)0С соответственно. При этом активность протективных антигенов при использовании различных температурных режимов проведения процесса не отличалась друг от друга (табл. 5).

Активность лиофилизированных препаратов ХА и О-АГ, полученных в данном эксперименте, соответствовала нормируемым значениям и значимо не отличалась от активности препаратов, полученных по регламентной технологии (табл. 6).

Таблица 5 - Результаты исследований по применению температурных режимов проведения процесса концентрирования протективных антигенов при использовании мембранных модулей с номинальными отсечками по молекулярной массе 20, 30 и 50 кДа (n=3)

Наименование показателя	Значение показателя, полученного при различных температурах фильтрации, 0С
	8±2	20±2	37±2
	“20”	“30”	“50"	“20”	“30”	“50"	“20”	“30”	“50"
Содержание О-АГ в РИД с О1 сывороткой, обратный титр	64	64	64	64	64	64	64	64	64
Содержание ХА в РИД с АХС, обратный титр	32	32	32	32	32	32	32	32	32
Средняя удельная скорость фильтрации, дм3/м2/час	29	40	48	34	46	56	43	59	72

Примечание. “20”, “30” и “50" ? мембранные модули с НОММ 20, 30 и 50 кДа соответственно.

Таблица 6 - Сравнительные показатели сухих препаратов О-антигена и холерогена-анатоксина полученных экспериментально и по регламентной технологии (n=3)

Наименование показателя	Значение показателя, полученного по…	Нормируемое значение показателя
	регламентной технологии	экспериментальной технологии при различных температурах фильтрации, 0С
		8±2	20±2	37±2
Активность препарата:
по ЕС	6000	5500	6000	6500	?2000
в РНГА с О1 сывороткой, обратный титр	256	300	264	256	?100

Далее была проведена оценка возможности внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования ХА и О-АГ в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной. Реализованные эксперименты показали что увеличение площади мембран в 2 раза приводит к повышению средней удельной скорость фильтрации также практически в 2 раза. Основываясь на полученных данных, произвели расчет необходимой площади фильтрации для концентрирования 500 дм3 безмикробного центрифугата (количество продукта полученного за один цикл выращивания штамма продуцента О-АГ и ХА холерного вибриона на двух производственных ферментерах) в 10 раз за 6 ч. Для концентрирования указанного объема необходима установка с площадью фильтрации 3,2 м2.

Сравнительное изучение препаратов протективных антигенов холерного вибриона и таблетированной холерной вакцины, полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии

Большое внимание было уделено сравнительной оценке сухих фракций ХА и О-АГ, полученных по традиционной и предложенной технологиям. С этой целью было проведено сравнительное изучение наличия ферментов в сублимационно высушенных препаратах. Проведенные исследования показали, что такие ферменты как протеаза, фосфолипаза, липаза (твиназа) отсутствуют в препаратах полученных как традиционным так и разработанным способами. В обоих образцах была обнаружена лизофосфолипаза в одинаковых концентрациях. Изучение химического состава фракций, полученных двумя различными способами показало, что общее количество белка, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот основных химических компонентов в препаратах было идентичным. Анализ полученных препаратов с помощью хроматографического и электрофоретического разделения также выявил тождественность их состава. Изучение активности ХА и О-АГ с помощью дот-иммуноанализа не выявило существенных различий в образцах, полученных по традиционной и разработанной технологиям.

Таблица 7 - Результаты исследования нормируемых физико-химических и иммунобиологических свойств серий вакцины

Наименование показателя	Требования нормативной документации	Значение показателя по сериям
		контроль	экспериментальная
Описание	Таблетка - серовато-желтая компактная масса, покрытая светлой блестящей кислотоустойчивой оболочкой	соответствует
Ионы аммония и сульфат-ионы	Не допускается наличия ионов аммония и сульфат-ионов	отсутствуют
Средняя масса таблетки	от 0,285 г до 0,315 г	0,3	0,29
Формалин	не более 0,2%	0,012	0,014
рН растворенного препарата	от 6,7 до 7,4	6,7	6,9
Распадаемость	Оболочка таблетки вакцины должна быть устойчива к действию децимолярного раствора соляной кислоты в течение 3 ч и распадаться в децимолярном растворе натрия гидроксида в течение 1 ч при температуре (37+1)0С	устойчива - 3 ч 25 мин; распадается в течение 57 мин	устойчива - 3 ч 35 мин; распадается в течение 55 мин
Потеря в массе при высушивании	Не более 5%	4,6	4,15
Микробиологическая чистота	Допускается не более 1000 колоний непатогенных микроорганизмов на одну таблетку. Вакцина не должна содержать патогенных и условно патогенных микроорганизмов	не содержит патогенных и условно патогенных микроорганизмов; непатогенных - 44 колонии	не содержит патогенных и условно патогенных микроорганизмов; непатогенных - 34 колонии
Токсичность	Вакцина должна быть нетоксичной	нетоксичны
Специфическая безопасность	Вакцина должна быть специфически безопасной	специфически безопасны
Специфическая активность:
антигенная активность по анатоксино-связыванию;	Должна содержать (100 000+20 000) единиц связывания анатоксина (ЕС),	100000	120000
содержание О-антигена;	не менее 2000 ус. ед. О-антигена штаммов V. cholerae О1	10240	10480
иммуногенность	ЕД50 должна быть не более 1/20000 части таблетки	1/125000 (сер. Огава) 1/68000 (сер. Инаба)	1/142000 (сер. Огава) 1/100000 (сер. Инаба)

На заключительном этапе работы были определены физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной, полученной на сконструированном ферментационном оборудовании и с использованием разработанной экспериментальной технологии концентрирования. Одновременно с экспериментальными сериями вакцины исследованиям, в качестве контроля, были подвергнута производственная серия № 86, полученная по регламентной технологии. Полученные данные, представленные в таблице 7, показали, что экспериментальная серия удовлетворяет требованиям нормативных документов, а ее качество не уступает вакцине, приготовленной по существующей технологии.

ВЫВОДЫ

1. На базе химического реактора сконструирован, изготовлен и установлен на участке культивирования аппаратурно-технологической линии приготовления холерной вакцины экспериментально-производственный биореактор, обеспечивающий высокий уровень биологической защиты.

2. Установлено, что культивирование производственных штаммов холерных вибрионов на разработанном биореакторе обеспечивает получение кондиционных нативных протективных антигенов, при этом изучение физиологических и морфологических свойств производственных штаммов холерных вибрионов в ходе их глубинного культивирования на производственных и разработанном биореакторах показало их идентичность.

3. Экспериментально обоснована возможность концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба с использованием метода тангенциальной ультрафильтрации, при этом определены оптимальные параметры технологического процесса.

4. Показана возможность внедрения метода тангенциальной ультрафильтрации для концентрирования протективных антигенов штамма V. cholerae 569В серовара Инаба в промышленную технологию производства вакцины холерной бивалентной химической таблетированной.

5. Установлено, что полученные по новой технологии концентрирования протективные антигены штамма V. cholerae 569В серовара Инаба соответствуют требованиям действующего регламента производства на холерную вакцину.

6. Изучение иммунохимических, физических и биохимических свойств протективных антигенов полученных по традиционной технологии и с помощью разработанного ферментационного оборудования и по экспериментальной технологии показало их идентичность.

7. Физико-химические и иммунобиологические свойства вакцины холерной химической бивалентной таблетированной, полученной по новой технологии, соответствуют требованиям нормативной документации и не уступают по качеству препарату, производимому традиционным способом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент № 86184 Российская Федерация, МПК C12M1/02;C12R1/01. Ферментационная установка для культивирования микроорганизмов / А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, А.Ю. Ульянов, В.В. Строганов, С.А. Еремин; Заявл. 04.05.09 г.; опубл. 27.08.09 г., Бюл. № 24.

2. Ульянов А.Ю. Исследование массообменных характеристик ферментера с целью оценки возможности использования его в технологии производства холерной бивалентной химической вакцины / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков, В.В. Строганов // Вавиловские чтения-2010: Материалы Международ. науч.-практ. конф. / Сарат. госагроуниверситет им. Н.И. Вавилова - Саратов, 2010. ? Т.2. - С. 179-180.

3. Ульянов А.Ю. Экспериментальная оценка возможности использования разработанного промышленного биоректора в производстве холерной вакцины / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, Д.А. Щербаков // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. / ГИСК им. Л.А. Тарасевича - М., 2010. - С. 113.

4. Ульянов А.Ю. Разработка биореактора и оценка возможности его использования в производстве холерной вакцины / А.Ю. Ульянов, С.А. Еремин, Ю.Г. Васин, А.К. Никифоров, Д.А. Щербаков, А.В. Комиссаров // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2011. - № 1. - С. 39-44.

5. Комиссаров А.В. Разработка экспериментальной технологии концентрирования протективных антигенов штамма Vibrio cholerae 569В Инаба методом тангенциальной ультрафильтрации / А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, А.Ю. Ульянов, Ю.А. Алешина, А.К. Никифоров, Ю.Г. Васин, О.Д. Клокова, Н.И. Белякова // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 3(109). - С. 75-77.

6. Ульянов А.Ю. Изучение биокинетических особенностей культивирования Vibrio cholerae М41 Огава в сконструированном биореакторе / А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, Н.И. Белякова, О.А. Волох // Биология - наука ХХI века: Материалы 15 международной школы-конференции молодых ученых / Пущинский научный центр Российской академии наук - Пущино, 2011. - С. 316.

7. Алешина Ю.А. Сравнительное изучение качества препаратов холерной бивалентной химической вакцины, полученных по традиционной и экспериментальной технологиям / Ю.А. Алешина, А.Ю. Ульянов, А.К. Никифоров, А.В. Комиссаров, С.А. Еремин, О.В. Громова, Н.И. Белякова, О.Д. Клокова // Холера и патогенные для человека вибрионы: Материалы совещания и проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Ростов-на-Дону, 2011. ? Вып. 24. ? С. 143-144.

Размещено на Allbest.ru

...