Изучение роли лектинов Paenibacillus polymyxa в регуляции метаболизма животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЛЕКТИНОВ PAENIBACILLUS POLYMYXA В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЖИВОТНЫХ

03.00.07 - микробиология

Неверова Наталья Николаевна

Саратов - 2008

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Лектины представляют собой углеводсвязывающие белки неиммунной природы. Специфически связываясь с углеводными рецепторами, они способны участвовать во многих внутриклеточных метаболических процессах растений, животных, микроорганизмов. Среди лектинов различного происхождения в этом плане менее изученными являются лектины бактерий. К настоящему времени имеется довольно широкий набор бактерий, синтезирующих лектины разнообразной углеводной специфичности (Никитина и др., 1989; Карпунина, 1989, 2002; Коваленко, 1990; Лахтин, 1992;). Благодаря высокой биологической активности они могут обладать иммуномодулирующими свойствами (Никитина и др., 2002; Тихомирова и др., 2003), изменять адгезивную функцию фагоцитирующих клеток, цитокиновую активность (Абросимова и др., 2002; Горельникова, 2006). Работ по влиянию лектинов непатогенных бактерий на метаболизм животного организма, судя по имеющимся публикациям, не так много. В последнее время установлено, что одним из наиболее эффективных способов повышения резистентности организма при патологиях, в том числе и к различным видам стрессов, является применение разнообразных биологически активных веществ, в том числе и лектинов бактерий (Мосейнюк, 1982; Коваленко, 1997; Мухачева, 2001). Изучение влияния лектинов бактериального происхождения на внутриклеточные процессы организма животных, как в норме, так и при некоторых нарушениях являются интересной и актуальной задачей, поскольку это открывает новые возможности коррекции нарушенного метаболизма.

Цель работы состояла в изучении роли лектинов ЛI и ЛII Paenibacillus polymyxa 1460 в регуляции некоторых метаболических процессов в организме экспериментальных животных в норме и при стрессовых воздействиях различной природы.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние лектинов ЛI и ЛII P.polymyxa 1460 на активность глутатион-S-трансферазы экспериментальных животных (крыс) in vivo в норме и в условиях холодового, иммобилизационного и этанолового стрессов.

2. Определить специфичное взаимодействие лектина ЛII P.polymyxa 1460 с глутатион-S-трансферазой эритроцитов крови iv vitro.

3. Определить влияние лектинов ЛI и ЛII на активность аланин-аминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) крыс в условиях холодового и этанолового стресса.

4. Исследовать влияние лектинов ЛI и ЛII на содержание мочевины и холестерина в организме крыс в норме, а также при холодовом и этаноловом стрессах.

5. Изучить действие лектинов бацилл ЛI и ЛII на содержание церулоплазмина в крови крыс при стрессах.

6. Исследовать влияние лектина бацилл ЛII на микрофлору кишечника крыс в норме и в стрессовых условиях.

Научная новизна

Впервые выявлена регуляторная роль лектина ЛII, выделенного с поверхности почвенных азотфиксирующих P.polymyxa 1460, в условиях патологических нарушений организма, вызванных холодовым и этаноловым стрессами в отношении фермента глутатион-S-трансферазы и церулоплазмина in vivo. Обнаружена способность лектина ЛII специфически связываться с рецепторами глутатион-S-трансферазы in vitro.

Показано, что лектин ЛII нормализует активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, нарушение в активности которых было вызвано холодовым и этаноловым стрессом. Обнаружено влияние лектина бацилл ЛII на азотистый обмен веществ в организме животных. Показано, что ЛII способствует нормализации мочевины в сыворотке крови при этаноловом стрессе.

Установлено, что лектин ЛII способен оказывать влияние на микрофлору кишечника, регулируя количество молочнокислых бактерий в условиях иммобилизационного, холодового и этанолового стрессов.

Практическая значимость работы

Способность лектина бацилл регулировать активность некоторых ферментов, а также коррекция важных показателей разнообразных обменных процессов при патологических состояниях организма на фоне различных видов стресса открывает перспективы их возможного использования в практике медицинских и биологических исследований. По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Изучение влияния лектина бацилл на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс при стрессе» (в соавторстве с Т.П. Кикаловой, Л.В. Карпуниной и М.Д. Сметаниной, 2008) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии, биохимии, физиологии человека и животных, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом ветеринарного факультета Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 42 от 3 апреля 2008 г.). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и написании дипломных работ в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лектин ЛII P.polymyxa 1460 способен регулировать активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс в условиях стресса: понижая активность фермента при этаноловом и повышая при холодовом стрессе in vivo. Лектин ЛЙ не изменяет активность фермента в организме крыс при данных видах стресса.

2. Лектин ЛII специфически взаимодействует с глутатион-S-трансферазой эритроцитов крови животных in vitro.

3. Введение лектина бацилл ЛII в организм крыс влияет на аминотрансферазную активность сыворотки крови, регулируя активность АСТ при холодовом стрессе и активность АЛТ при этаноловом стрессе.

4. Лектин ЛII оказывает влияние на уровень мочевины и холестерина в организме интактных и подвергшихся холодовому и этаноловому стрессам животных; приводит к норме содержание мочевины в организме экспериментальных животных при этаноловом стрессе.

5. Лектин бацилл ЛЙЙ способствует нормализации содержания церулоплазмина in vivo при стрессовых воздействиях (холодового, этанолового).

6. Лектин бацилл ЛЙЙ нормализует содержание молочнокислых бактерий в организме экспериментальных животных, подвергнутых иммобилизационному, холодовому и этаноловому стрессу, приводя количество бактерий к норме, а в случае холодового стресса - к увеличению.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы, переименованной впоследствии (20.09.2006) в кафедру микробиологии, вирусологии и иммунологии факультета ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически активных веществ (лектинов) в регуляции метаболизма растений и животных» и при частичной поддержке грантом CRDF (CR-006-x1).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы (Саратов, 2005; 2006; 2007); региональных конференциях молодых ученых «Вавиловские чтения - 2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); десятой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2006); третьей межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, ИБФРМ РАН, 2006), III Международной школе-конференции «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

лектины бацилла микрофлора стресс

2. Собственные исследования и их обсуждение

2.1 Материалы и методы

Объектом исследования явились лектины ЛЙ и ЛЙЙ, выделенные с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Paenibacillus polymyxa 1460 по методу (Карпунина и др., 1993). Количественное содержание белка определяли по методу M. Brаdford (1976).

Лектины бацилл вводили интраперитонеально самцам беспородных белых крыс со средней массой тела 210 г в дозе 2 мкг/животное. По характеру воздействия животные были поделены на 9 групп, по 10 крыс в каждой. 1 группа - контрольные животные; 2 группа - животные, которые получали раствор лектина ЛI; 3 группа - животные, которым вводили раствор лектина ЛII; 4 и 5 группы - животные, которых подвергали воздействию холодового стресса в течение 10 и 60 минут соответственно; 6 группа - животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу в течение 10 минут; 7 группа - животные, которые получали раствор лектина ЛII за сутки перед холодовым стрессом (10 минут); 8 группа - животные, подвергавшиеся иммобилизационному стрессу в течение 10 минут через сутки после введения ЛII; 9 группа - животные, подвергавшиеся влиянию этанолового стресса в течение 10 и 60 минут. Кровь из организма крыс отбирали через 24 часа после введения лектина и сразу после стресса.

Определение активности глутатион-S-трансферазы (GST) проводили по методу (Habig, Jakoby, 1981).

Определение активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови, проводили по методу С. Райтманда-Френкеля (1957), применяя набор реагентов фирмы «Lachema».

Содержание мочевины и холестерина в сыворотке крови определяли с помощью набора реактивов фирмы “Агат” (г. Москва).

Содержание церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови определяли по методу (Ravin, 1961).

Количество молочнокислых микроорганизмов в кишечнике крыс определяли методом серийных разведений (Костенко, 2001).

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с применением t - критерия Стьюдента (Зайцев, 1991).

2.2 Изучение влияния бактериальных лектинов ЛI и ЛII P. polymyxa 1460 на активность глутатион-S-трансферазы при различных видах стресса

Изучали влияние лектинов P. polymyxa 1460 ЛI и ЛII на активность GST, являющегося дезинтоксикационным ферментом, и осуществляющим метаболическую защиту организма от экзогенных и эндогенных токсических метаболитов, как контрольных крыс, так и подвергавшихся различным видам стресса (иммобилизационный, холодовой, этаноловый).

Было обнаружено, что лектин ЛI не вызывал изменений в активности глутатион-S-трансферазы эритроцитов крыс по сравнению с контролем. Активность GST составляла 19,9 мкмоль/мин·л. При введении же лектина ЛII в организм крыс активность GST эритроцитов крыс понижалась на 24 % относительно интактных животных. В связи с этим для дальнейшей работы был выбран лектин ЛII.

Действие иммобилизационного стресса на экспериментальных животных в течение 10 минут не вызывало существенных изменений в активности GST (табл.1). В связи с этим мы попытались найти модель стресса, при которой активность GST эритроцитов крови самцов крыс изменялась бы уже при 10 минутном воздействии стрессора. При моделировании холодового стресса, крысы находились на льду в течение 10 и 60 минут. Было показано, что активность GST при этом воздействии значительно снижалась относительно контроля. Холодовой стресс в течение 10 минут вызывал понижение активности фермента относительно интактных животных на

19 % и составил 16,1 мкмоль/мин•л; при действии в течение 60 минут происходило еще более существенное снижение активности GST - на 33 % (табл. 1).

Таблица 1 Влияние иммобилизационного, холодового и этанолового стресса на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс

Характер воздействия	Активность фермента
	мкмоль/мин·л	%
	М±m	М±m
контроль	19,9 ± 0,6	100,0 ± 3,2
иммобилизационный стресс	10 мин	19,5 ± 0,8	98,4 ± 3,9
холодовой стресс	10 мин	16,1 ± 0,9?	80,9 ± 5,3?
	60 мин	13,4 ± 0,6?Д	67,4 ± 4,7? Д
этаноловый стресс	12,5 %	10 мин	21,7 ± 1,0^	109,4 ± 4,6^
		60 мин	18,6 ± 0,4	93,7 ± 4,0
	25 %	10 мин	22,7 ± 0,9*	114,4 ± 1,9*
		60 мин	20,1 ± 0,4Д_	101,4 ± 0,9 Д_

Примечание: * - P < 0,05 относительно контрольной группы; Д - P < 0,05 относительно холодового стресса (10 мин); ^ - P < 0,05 относительно этанола 12,5 % (60 мин); _ - P < 0,05 относительно этанола 25 % (10 мин).

Для дальнейших исследований было выбрано десятиминутное холодовое воздействие, поскольку, как видно из полученных данных, даже кратковременного холодового стресса достаточно для изменения активности фермента, и оно оказывает меньший вред животным. В качестве следующего стрессорного фактора была взята алкогольная интоксикация. При кратковременном воздействии 12,5 % этанола активность глутатион-S-трансферазы имела незначительное увеличение и составила 21,7 мкмоль/мин•л, а при концентрации 25 % - 22,7 мкмоль/мин•л, то есть повысилась примерно на 14 % относительно контроля (табл. 1). При часовом воздействии спирта (12,5 %, 25 %) активность фермента практически не изменялась.

Введение лектина ЛII, а затем стрессирование крыс оказало разное влияние его на активность GST (табл. 2). Так, при иммобилизационном стрессе обнаружено понижение активности фермента на 15 % по сравнению с активностью фермента, определяемой при иммобилизации крыс. То есть, отмечен тот же эффект, что и при воздействии только лектина ЛII. При холодовом и этаноловом стрессах, не было замечено существенных изменений в активности фермента по сравнению с показателями у интактных животных.

Таблица 2 Влияние лектина ЛЙЙ на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс в условиях различных видов стресса

Характер воздействия	Активность фермента
	мкмоль/мин·л	%
	М±m	М±m
контроль	19,9 ± 0,6	100,0 ± 3,2
лектин ЛЙЙ	15,0 ± 0,4*	75,8 ± 2,6*
ЛЙЙ +иммобилизационный стресс 10 мин	16,9 ± 0,7*^	92,6 ± 8,1 Д
ЛЙЙ + холодовой стресс 10 мин	18,4± 1,5Д	84,9 ± 4,5*^
ЛЙЙ + этаноловый стресс (25 %) 10 мин	20,4 ± 0,9 Д_	102,7 ± 4,6 Д^_

Примечание: * - P < 0,05 относительно контрольной группы; Д - P < 0,05 относительно лектина; ^ - P < 0,05 относительно иммобилизационного стресса (10 мин); _ - P < 0,05 относительно спирта 25 % (10 мин).

Таким образом, результаты эксперимента свидетельствовали о том, что лектин ЛЙЙ при введении в организм крыс перед действием стрессовых факторов нормализует активность GST только в условиях холодового и этанолового стрессов. У крыс, подвергавшихся иммобилизационному стрессу, ферментативная активность под влиянием лектина ЛЙЙ не изменялась.

2.3 Изучение специфичного взаимодействия лектина ЛЙЙ P.polymyxa 1460 с глутатион-S-трансферазой при различных видах стресса in vitro

Для доказательства специфического взаимодействия лектина ЛII с GST проводили эксперимент с лектином, блокированным специфичными к нему углеводами. Для этого к лектину ЛII добавляли: глюкуроновую кислоту (19 мМ), фруктозо-1,6-дифосфат (30 мМ), галактозамин (15 мМ) и глюкозамин (80 мМ), в соотношении 1:1 и инкубировали 30 минут при 37 °С. Затем 0,1 мл данного лектина соединяли с 2 мл крови крыс, инкубировали 60 минут при 37 °С и определяли активность фермента.

При исследовании крови крыс, которым предварительно вводили неблокированный специфичными углеводами ЛII, обнаружили достоверное снижение активности GST с 19,1 до 16,1 мкмоль/мин·л (табл.3). У животных, которые получали лектин ЛII, заблокированный специфическими углеводами активность фермента была сопоставима с контрольными значениями и составляла 21,5 мкмоль/мин·л. Полученные данные позволяли говорить о специфическом взаимодействии ЛII с поверхностными рецепторами GST. Исследуя действие самих углеводов (глюкуроновая кислота, фруктозо-1,6-дифосфат, галактозамин, глюкозамин) на активность фермента в крови животных, мы не обнаружили достоверных изменений в активности GST, которая составила 20,3 мкмоль/мин·л, что было сопоставимо с контрольным значением (табл. 3).

Таблица 3 Влияние лектина ЛII P. polymyxa 1460 на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс in vitro

Характер воздействия	Активность фермента, мкмоль/мин·л, М±m
контроль	19,1 ± 1,2
ЛII	16,1±0,4*
ЛII + специфические углеводы	21,5 ± 1,2?
специфические углеводы	20,3 ± 2,0

Примечание: * - P < 0,05 относительно контрольной группы; ^Д - Р < 0,05 относительно лектина ЛII.

Таким образом, возможно, что лектин ЛII P. polymyxa 1460, специфически связываясь с рецепторами этого фермента, способен регулировать активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс, что и было показано в предыдущем разделе.

2.4 Влияние лектинов бацилл на активность аминотрансфераз в сыворотке крови при стрессе

Показано, что у животных, которые получали ЛI P.polymyxa 1460 происходило повышение аланинаминотрансферазной активности на 57 % по сравнению с контрольной группой. Уровень аспартатаминотрансферазной активности практически не отличался от исходных значений и составил 3,63 мкмоль/мин·л (в контроле 3,34 мкмоль/ мин·л). Снижение коэффициента Де Ритиса, которое наблюдали в данном случае, свидетельствовало о нарушении соотношения ферментов АСТ и АЛТ (табл. 4). В то время как лектин ЛII снижал активности как АСТ, так и АЛТ в сыворотке крови крыс. Повышение коэффициента Де Ритиса в данном случае, свидетельствовало о нормализации соотношения АСТ и АЛТ (табл. 4). Снижение активности аминотрансфераз под влиянием лектина ЛЙЙ возможно происходит вследствие затрудненного выхода ферментов из клеток в кровяное русло. Причиной этого может являться либо упрочнение структуры мембран клеток под влиянием бактериального лектина ЛII (за счет взаимодействия со специфичными к лектину углеводами мембраны), либо ингибирование синтеза данных внутриклеточных ферментов лектином бацилл.

Действие холодового стресса в течение 10 минут на организм крыс оказывало существенное влияние на активность АСТ. Было замечено понижение активности АСТ примерно на 40 % относительно интактных животных, и отсутствие каких-либо изменений в активности АЛТ. Уменьшение коэффициента Де Ритиса говорило о преобладании АЛТ в сыворотке крови крыс. Воздействие холодом на крыс в течение 60 минут практически не приводило к изменению активности АСТ и АЛТ.

При изучении влияния этанола (25 %) на активность аминотрансфераз в крови крыс было показано, что и 10-минутное и 60-минутное воздействие вызывало увеличение активности АЛТ и незначительно изменяло активность АСТ. Коэффициент Де Ритиса понижался с 1,93 до 0,88, что свидетельствовало о нарушении соотношения активности аминотрансфераз. Повышение АЛТ возможно, объясняется тем, что молекулы этилового спирта пропитывают липидный слой мембраны, разжижая ее, в результате чего ферментные белки из клетки поступают в кровь. Через 60 минут после введения этанола наблюдали снижение активности АЛТ относительно группы крыс, получавших только этанол через 10 минут, но окончательный нормализации не происходило (табл. 4). Возможно, это связано с тем, что через час после введения этанола происходит его нейтрализация защитными силами организма, и активность данного фермента приближается к значениям нормы.

Таблица 4 Влияние лектинов ЛI и ЛII Paenibacillus polymyxa на активность ферментов АЛТ и АСТ при холодовом и этаноловом стрессах

Характер воздействия	Активность ферментов	Коэффициент Де Ритиса
	АСТ М ± m	АЛТ М ± m
	мкмоль/мин·л	%	мкмоль/мин·л	%
контроль	3,34 ± 0,32	100,01 ± 9,58	1,73 ± 0,17	100,01 ± 10,19	1,93 ± 0,19
лектин ЛI	3,63 ± 0,31	108,63 ± 8,34	2,72 ± 0,32*	157,03±11,78*	1,33 ± 0,11*
лектин ЛII	2,12 ± 0,28*	63,64 ±13,24*	0,82 ± 0,12*	47,31 ± 14,83*	2,58 ± 0,28?
холодовой стресс	10 мин	1,97 ± 0,19*	58,91 ± 9,64*	1,56 ± 0,08	84,23 ± 8,85	1,26 ± 0,13*
	60 мин	4,11 ± 0,20Д	122,99±5,99Д	2,22 ± 0,41	128,27 ± 23,46	1,85 ± 0,21Д
этаноловый стресс (25%)	10 мин	3,66 ± 0,19	103,54 ± 5,22	4,72 ± 0,31*	272,83 ± 7,52*	0,88 ± 0,07*
	60 мин	3,54 ± 0,51	95,88 ± 14,62	3,61 ± 0,33* Д	208,71±9,22*?	0,98 ± 0,08* Д
лектин ЛII+холодовой стресс 10 мин	2,74 ± 0,11	82,04 ± 3,39	1,62 ± 0,16	93,5 ± 9,13	1,81 ± 0,11Д
лектин ЛII+этаноловый стресс (25 %) 10 мин	3,26 ± 0,19	98,03 ± 4,30	1,96 ± 0,24	120,05 ± 8,16	1,51±0,12Д *

Примечание: * - р < 0,05 относительно значений контрольной группы; Д - p < 0,05 относительно значений группы лектин ЛII; * - p < 0,05 относительно значений группы этанол 25 % - 10 мин.

В условиях предварительного введения лектина ЛII в организм крыс перед холодовым стрессом, существенных изменений активности АСТ и АЛТ по отношению к контрольным животным не наблюдали. Предварительное введение лектина ЛII перед этаноловым стрессом способствовало нормализации активности как АЛТ, так и АСТ. В данном случае бактериальный лектин способствовал нормализации этого показателя в сыворотке крови крыс, что также подтверждается значениями коэффициента Де Ритиса (табл. 4).

Исходя из приведенных данных, можно говорить о том, что лектин бацилл ЛII способен регулировать активность аминотрансфераз при некоторых стрессовых воздействиях (этаноловом стрессе).

2.5 Влияние лектинов бацилл на содержание мочевины и холестерина в сыворотке крови при различных видах стресса

При исследовании влияния лектинов бацилл на содержание мочевины былопоказано, что после введения лектина ЛЙ крысам концентрация мочевины практически не изменялась и составляла 3,7 ммоль/л; незначительное изменение было замечено в отношении ЛII (3,4 ммоль/л).

В группе животных, которые были подвержены холодовому стрессу, в течение 10 минут, содержание мочевины не изменялось относительно контрольных животных (табл. 5). При действии холодового стресса в течение 60 минут уровень мочевины снижался по сравнению с контрольными значениями на 61,7 % и составил 1,440 ммоль/л. Возможно, это объясняется снижением обменных процессов, при длительном действии холода и, концентрация мочевины в крови уменьшается. Изучение влияния этанолового стресса показало, что при 10-минутном действии этанола (12,5 %) на организм крыс концентрация мочевины повышалась на 60 %, а при 60-минутном действии показатель азотистого обмена увеличивался на 138 % от исходного уровня (табл.5).

Таблица 5 Влияние холодового и этанолового стресса на содержание мочевины в сыворотке крови крыс

Характер воздействия	Мочевина
	ммоль/л, М±m	%, М±m
контроль	3,8 ± 0,2	100,0 ± 5,0
холодовой стресс	10 мин	3,5 ± 0,3	94,4 ± 9,1
	60 мин	1,4 ± 0,3*°	38,3 ± 20,1*°
этаноловый стресс	12,5 %	10 мин	6,0 ± 0,6*	160,1 ± 10,3*
		60 мин	8,9 ± 0,8*Є	238,0 ± 9,2*Є
	25 %	10 мин	5,3 ± 0,2*	140,0 ± 4,9*
		60 мин	4,0 ± 0,4?	107,7 ± 10,8?

Примечание: * - Р < 0,05 относительно значений контрольной группы; ° - Р < 0,05 относительно значений группы холодовой стресс 10 мин; Є - Р < 0,05 относительно значений группы: этанол 12,5 % 10 мин; ? - Р < 0,05 относительно значений группы: этанол 12,5 % 60 мин.

Концентрация мочевины при 10-минутном воздействии этанола в концентрации 25 % была выше контрольных значений на 40 %. При 60-минутной экспозиции концентрация данного параметра снижалась практически до исходного контрольного уровня и составила 4,0 ммоль/л. Возможно, такие изменения связаны с тем, что при действии алкоголя на организм тормозится синтез белков, происходят изменения в структуре и функциях мембран рибосом - нарушается активность ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз, участвующих в реакциях активирования аминокислот-первичного звена синтеза белков (Мосейнюк и др., 1982). В результате этого в крови происходит увеличение концентрация аммиака и, соответственно, мочевины При введении лектина ЛII P. polymyxa 1460 в организм крыс до их 10-минутного холодового стрессирования наблюдали понижение уровня мочевины. Количество мочевины составило 59 % от исходного контрольного уровня; 55,4 % относительно холодового стресса и 52,2 % относительно группы крыс, которым вводили только лектин ЛII. То есть, лектин не способствовал нормализации мочевины в организме крыс. В то время как введение ЛII в организм крыс при этаноловом стрессе вызывало понижение уровня мочевины практически до контрольных значений (табл. 6).

Таблица 6 Влияние лектина ЛЙЙ на содержание мочевины в сыворотке крови крыс в условиях холодового и этанолового стресса

Характер воздействия	Мочевина
	ммоль/л, М±m	%, М±m
контроль	3,8 ± 0,2	100,0 ± 5,0
лектин ЛЙЙ	3,4 ± 0,3	91,2 ± 10,2
холодовой стресс 10 мин	3,5 ± 0,3	94,4 ± 9,1
этаноловый стресс (25 %) 10 мин	5,3 ± 0,2*	140,0 ± 4,9*
лектин ЛЙЙ + холодовой стресс 10 мин	2,4 ± 0,1*°^	59,0 ± 11,2*°^
лектинЛЙЙ + этаноловый стресс (25 %) 10 мин	3,2 ± 0,3?	88,7 ± 10,5?

Примечание: * - Р < 0,05 относительно значений контрольной группы; ^ - Р < 0,05 относительно значений группы лектин ЛII; ° - Р < 0,05 относительно значений группы холодовой стресс 10 мин; ? - Р < 0,05 относительно значений группы: этанол 25 % 10 мин.

Введение лектинов бацилл в организм крыс не однозначно сказывалось и на содержании холестерина в сыворотке крови крыс. Так, лектин ЛI не вызывал никаких изменений в содержании холестерина, а введение лектина ЛII, приводило к повышению данного показателя в крови на 38 % по сравнению с контрольной группой. Вполне возможно предположить, что лектин ЛII, стимулирует дополнительный синтез и выход холестерина из депо в кровь, где он используется в качестве строительного материала для укрепления структуры мембран клеток. Пребывание крыс на холоде в течение 10 минут приводило к увеличению содержания холестерина. При 60-минутном холодовом стрессе уровень холестерина не изменялся по сравнению с контрольными показателями. Очевидно, это связано с тем, что охлаждение неадаптированных к холоду животных ведет к мобилизации депонированных жиров, а мышечная ткань обеспечивается субстратом окисления для нормального функционирования нервной системы (Эмирбеков, 1985) (табл.7).

Таблица 7 Влияние холодового и этанолового стресса на содержание холестерина в сыворотке крови крыс

Характер воздействия	Холестерин
	Ммоль/л, М±m	%, М±m
контроль	1,0 ± 0,2	100,0 ± 13,0
холодовой стресс	10 мин	1,3 ± 0,1*	133,0 ± 6,0*
холодовой стресс	60 мин	1,2 ± 0,1	121,4 ± 7,7
этаноловый стресс	12,5%	10 мин	1,1 ± 0,1	106,7 ± 7,3
		60 мин	2,4 ± 0,2*Є	232,4 ± 10,5*Є
	25 %	10 мин	1,2 ± 0,2	121,3 ± 20,6
		60 мин	1,1 ± 0,1?	116,0 ± 12,1?

Примечание: * - Р < 0,05 относительно значений контрольной группы; ° - Р < 0,05 относительно значений группы холодовой стресс 10 мин; Є - Р < 0,05 относительно значений группы: этанол 12,5 % 10 мин; ? - Р < 0,05 относительно значений группы: этанол 12,5 % 60 мин.

При изучении действия этанолового стресса на организм крыс было показано, что при однократном введении 12,5% этанола в течение первых 10 минут не происходило достоверных изменений уровня холестерина (1,1 ммоль/л по сравнению с контрольными значениями 1,0 ммоль/л). При действии этанола этой же концентрации в течение 60 минут отмечено увеличение концентрации холестерина, что составляло 132,4 % от исходного уровня (табл. 7). Это хорошо согласуется с литературными данными, согласно которым организм, сопротивляясь алкогольной интоксикации, укрепляет мембрану нейрона с помощью увеличения содержания в ней холестерина (Baroni, Marucci, 1994; Kurose, Higushi, Miura, 1997). Следовательно, повышение уровня холестерина в крови при этаноловом стрессе - это результат выхода его из депо для укрепления мембран клеток. При увеличении концентрации этилового спирта до 25 % не наблюдалось достоверных изменений уровня холестерина, как при 10-минутной экспозиции, так и при 60-минутном действии на организм крыс. Данный факт, возможно, объясняется тем, что с увеличением концентрации этанола до 25 % увеличивается и скорость использования холестерина, находящегося в крови, для укрепления структуры мембран клеток. При введении лектина ЛII в организм крыс перед их 10-минутным холодовым стрессированием не отмечено достоверных отличий в содержании холестерина по сравнению с контрольной группой, но по сравнению с группой крыс, которой вводили лектин ЛII и без последующего стресса, содержание холестерина уменьшилось на 33 % (табл. 8).

Таблица 8 Влияние лектина ЛЙЙ на содержание холестерина в сыворотке крови крыс в условиях холодового и этанолового стресса

Характер воздействия	Холестерин
	ммоль/л, М±m	%, М±m
контроль	1,0 ± 0,1	100,0 ± 13,0
лектин ЛЙЙ	1,4 ± 0,1*	138,0 ± 6,1*
холодовой стресс 10 мин	1,3 ± 0,1*	121,4 ± 7,7
этаноловый стресс (25 %) 10 мин	1,2 ± 0,2	121,3 ± 20,6
лектин ЛЙЙ + холодовой стресс 10 мин	1,0 ± 0,1^	105,0 ± 7,9^
лектин ЛЙЙ + этаноловый стресс (25 %) 10 мин	0,9 ± 0,1^	88,6 ± 16,0^

Примечание: * - Р < 0,05 относительно значений контрольной группы; ^ - Р < 0,05 относительно значений группы лектин ЛII.

В группе животных, которым вводили лектин, а затем этанол 25 % (10 мин), происходило снижение концентрации холестерина на 49,4 % по сравнению с группой, которым вводили только лектин ЛII.

Таким образом, из приведенных данных видно, что лектин бацилл ЛII способен регулировать азотистый и липидный обмены веществ, приводя такие показатели как мочевина и холестерин к норме, после воздействия некоторых стрессовых факторов на крыс, таких как холодовой и этаноловый.

2.6 Влияние лектинов ЛI и ЛII на содержание церулоплазмина в сыворотке крови животных при различных видах стресса

Дальнейшие исследования были связаны с изучением воздействия лектинов бацилл ЛI и ЛII на содержание церулоплазмина (ЦП), являющегося сывороточным гликопротеином, имеющим в своем составе углеводородные компоненты, представленные олигосахаридными цепями, содержащими глюкозамин, галактозу, мальтозу, сиаловые кислоты (Емельянов и др., 2004). Было показано, что при интраперитонеальном введении ЛI содержание ЦП составляло 514,0 мг/л, что практически не отличалось от контрольных значений. При введении ЛII в организм крыс отмечено достоверное понижение содержания ЦП до 469,8 мг/л (табл. 9).

Таблица 9 Влияние иммобилизационного и холодового стресса на содержание церулоплазмина в сыворотке крови крыс

Характер воздействия	Содержание церулоплазмина
	мг/л, М ± m	%, М ± m
контроль	595,9 50,2	100,0 8,4
иммобилизационный стресс 10 мин	405,4 33,1*	68,1 5,5*
холодовой стресс	10 мин	416,2 33,0*	69,8 5,5*
	60 мин	516,2 26,5	86,8 4,4

Примечание * - Р 0,05 относительно контрольной группы; - Р 0,05 относительно иммобилизационного стресса.

При действии стрессорных факторов данный показатель изменялся. Так, в группе животных, которые были подвержены иммобилизационному стрессу продолжительностью 10 минут, происходило понижение концентрации ЦП на 32 % (табл. 9). При холодовом стрессе было также обнаружено уменьшение концентрации

ЦП в сыворотке крови крыс. Причем, если при 60-минутном воздействии наблюдалась лишь тенденция к уменьшению ЦП, то при 10-минутном стрессе показатель достоверно уменьшался (табл. 9). Уменьшение количества ЦП при холодовом стрессе может быть связано с его функционированием как антиоксиданта, поскольку он входит, как один из основных элементов, в адаптационно-защитную систему организма (Емельянов и др., 2004). При охлаждении животного организма активируются процессы теплопродукции за счет интенсификации обмена веществ. Вследствие этого усиливается перекисное окисление липидов (Прайрс, 1979). Можно предположить, что при этом активируются и системы антиоксидантной защиты. Как уже было отмечено выше, степень снижения содержания ЦП в сыворотке крови при охлаждении зависит от длительности стресса. Вероятно, при более сильном воздействии синтез церулоплазмина отстает от его потребления.

При изучении этанолового стресса было показано, что через 10 мин после однократного введения в желудок крыс 1 мл 12,5 % этанола концентрация ЦП практически не изменилась. Более длительное воздействие спирта той же концентрации также не вызывало достоверных изменений по изучаемому показателю (табл. 10).

Таблица 10 Изменение содержания церулоплазмина в сыворотке крови крыс под влиянием этанола

Характер воздействия	Содержание церулоплазмина
	мг/л, М ± m	%, М ± m
контроль	595,9 50,2	100,0 8,4
этаноловый стресс 12,5 %	10 мин	535,0 58,8	89,9 13,5
	60 мин	536,4 56,9	90,0 10,6
этаноловый стресс 25 %	10 мин	383,2 11,3	64,3 2,9*
	60 мин	294,0 26,7	49,3 9,0*

Примечания * - Р 0,05 относительно контрольной группы;

- Р 0,05 относительно этанолового стресса (10 мин).

Увеличение концентрации этилового спирта до 25 % приводило к достоверным изменениям содержания ЦП. При 10-минутном воздействии было выявлено снижение концентрации ЦП в крови крыс в 1,5 раза по сравнению с контролем. Через 60 мин после введения этанола содержание ЦП понижалось еще значительнее - до 294,0 мг/л, что было вдвое меньше нормы (табл. 10). Данный факт можно объяснить тем, что, сопротивляясь алкогольной интоксикации, организм укрепляет мембраны клеток за счет ЦП, который способен ингибировать липидную пероксидазу и тем самым обеспечивает сохранность мембран клеток. Уменьшение содержания ЦП в сыворотке крови при нагрузке организма этанолом может быть связано с затратами этого белка на антиокислительные процессы.

При иммобилизации животных, которым предварительно вводили лектин ЛЙЙ, происходило достоверное уменьшение содержания ЦП, которое составляло 474,7 мг/л. Предварительное введение лектина ЛII, а затем действие холодового стресса не вызывало изменений в содержании ЦП в сыворотке крови крыс. В группе животных, которые получали предварительно лектин, а через сутки 1 мл 25 % этанола, также не происходило значительного изменения концентрации ЦП в сыворотке крови (табл. 11).

Таблица 11 Влияние лектина ЛII на содержание церулоплазмина в сыворотке крови крыс при стрессе

Характер воздействия	Содержание церулоплазмина
	мг/л, М ± m	%, М ± m
контроль	595,9 ± 50,2	100,0 ± 8,4
лектин ЛII	469,8 58,7*	78,9 12,5*
лектин ЛII иммобилизационный стресс 10 мин	474,7 ± 33,7*	66,8 ± 7,2
лектин ЛII холодовой стресс 10 мин	580,6 ± 31,2	91,0 ± 12,4
лектин ЛII + этаноловый стресс (25 %) 10 мин	520,1 ± 43,7	83,3 ± 9,3

Примечание: * - P < 0,05 относительно контрольной группы.

Таким образом, показано, что иммобилизационный, холодовой и этаноловый стресс вызывают существенное снижение содержания сывороточного ЦП, а эти же воздействия на фоне предварительного введения лектина ЛII не оказывают на организм столь сильного влияния. Это позволяет нам говорить о том, что лектин ЛII способен регулировать содержание ЦП при действии холодового и этанолового стрессов.

2.7 Влияние лектина ЛЙЙ на содержание молочнокислых бактерий кишечника крыс при различных видах стресса

Снижение количества молочнокислых бактерий или даже их полное исчезновение ведет к нарушению минерального обмена, процессов кишечного всасывания, белкового и жирового обмена, к формированию хронических расстройств пищеварения (Доронин, Шендеров, 2002). В отношении лектинов, применяемых в качестве возможных регуляторов молочнокислой микрофлоры, каких либо сведений в литературе мы не встретили. В связи с этим интересно было изучить влияние бактериальных лектинов, в частности лектина ЛЙЙ P. polymyxa 1460, на содержание молочнокислых микроорганизмов в организме крыс при различных видах стресса.

В процессе исследований было показано, что при введении лектина ЛЙЙ в организм животных количество молочнокислых микроорганизмов уменьшалось и составляло 1,6·10⁵ КОЕ/г относительно контрольных значений (табл. 12).

Таблица 12 Влияние лектина P.polymyxa 1460 ЛЙЙ и действие различных видов стресса на молочнокислую микрофлору толстого кишечника крыс

Характер воздействия	Количество клеток ·105КОЕ/г, M±m
контроль	7,2 ± 0,4
ЛЙЙ	1,6 ± 0,1*
иммобилизационный стресс 10 мин	0,7± 0,1*
холодовой стресс 10 мин	1,4 ± 0,1*
этаноловый стресс 10 мин	5,0 ± 0,2*
ЛЙЙ + иммобилизационный стресс 10 мин	8,0 ± 0,1?
ЛЙЙ + холодовой стресс 10 мин	14,2 ± 0,2*?
ЛЙЙ + этаноловый стресс 10 мин	8,0 ± 0,1?

Примечание: * - P< 0,05 относительно контрольной группы; ^Д - Р< 0,05 относительно лектина ЛII.

Различные виды стресса (иммобилизационный, холодовой, этаноловый) влияют на количество молочнокислых бактерий - происходит их уменьшение в разной степени. Так, у крыс, подвергавшихся иммобилизационному стрессу, количество молочнокислых бактерий составило 0,7·10⁵ КОЕ/г. При воздействии холода на животных в течение 10 минут происходило уменьшение количества молочнокислых бактерий до 1,4·10⁵ КОЕ/г относительно контрольных значений. Действие на организм этанолового спирта в концентрации 25 % также сопровождалось уменьшением количества молочнокислых микроорганизмов, их количество составляло 5,0·10⁵ КОЕ/г. Такой эффект, возможно, объясняется тем, что стрессовое воздействие на организм, в зависимости от своей природы, вызывает целый каскад изменений в ферментативной системе организма, обменных процессах, защитных функций организма, что в свою очередь опосредованно влияет и на микрофлору кишечника животных.

Предварительное введение лектина бацилл ЛЙЙ в организм крыс, а затем их стрессирование (иммобилизационный, этаноловый стресс) приводило к нормализации количества молочнокислых бактерий. Так, при действии иммобилизационного и этанолового стресса лектин способствовал увеличению количество бактерий до 8,0·10⁵ КОЕ/г, что было сопоставимо с контрольными значениями - 7,2·10⁵ КОЕ/г. При действии холодового стресса на фоне предварительного введения лектина ЛЙЙ, наблюдали достоверное увеличение количества молочнокислых микроорганизмов, превышающее контрольные значения в 2,1 раза (табл. 12).

На основании полученных результатов можно говорить о том, что лектин ЛЙЙ P.polymyxa 1460 выступает в роли регулятора микрофлоры кишечника крыс в условиях негативного воздействия, в данном случае иммобилизационого и этанолового, приводя количество молочнокислых бактерий к норме, а в случае холодового стресса даже к превышению контрольных значений.

Выводы

1. Установлено, что предварительное введение лектина ЛII P. polymyxa 1460 в организм крыс вызывает у них нормализацию активности глутатион-S-трансферазы при холодовом и этаноловом стрессе. Введение лектина ЛI не вызывает изменений в активности фермента.

2. Обнаружена способность лектина ЛII специфически связываться с рецепторами глутатион-S-трансферазы in vitro.

3. Установлено, что лектин ЛII при действии in vivo изменяет активность аминотрансфераз в сыворотке крови крыс, нормализуя активности АСТ при холодовом стрессе и АЛТ при этаноловом стрессе.

4. Показано, что лектин ЛII оказывает влияние на азотистый обмен крыс, нормализуя содержание мочевины при этаноловом стрессе, но не оказывает влияния на уровень холестерина, нарушение которого связано с действием холодового стресса.

5. Обнаружено, что предварительное введение лектина ЛЙЙ в организм крыс нормализует содержание церулоплазмина, нарушение которого вызвано влиянием таких стрессовых факторов как холод и этанол.

6. Впервые показано влияние лектина ЛЙЙ P. polymyxa 1460 на молочнокислую микрофлору кишечника крыс; введение лектина перед иммобилизационным и этаноловым стрессированием животных способствует нормализации, а при холодовом - увеличению количества молочнокислых бактерий в кишечнике животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Изучение активности глутатион-S-трансферазы в крови у крыс при стрессе на фоне введения лектина Paenibacillus polymyxa 1460 // Вавиловские чтения - 2005: Материалы конференции посвященной 118-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 23 - 25 ноября 2005. - Саратов, 2005. - С. 76-78.

2. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Влияние лектина ЛЙЙ на активность глутатион-S-трансферазы в крови крыс при стрессе // Биология - наука 21 века: Тез. 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра, Пущино, 17 - 21 апреля 2006. - Пущино, 2006. - С. 156.

3. Неверова Н.Н., Афонькина Е.А., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Изменение активности церулоплазмина в крови крыс при стрессе на фоне введения лектина Paenibacillus polymyxa // Биология - наука 21 века: Тез. 10 Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра, Пущино, 17 - 21 апреля 2006. - Пущино, 2006. - С. 155.

4. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Афонькина Е.А., Сметанина М.Д., Шорина Л.Н., Карпунина Л.В. Изменение активности глутатион-S-трансферазы и церулоплазмина в крови крыс при стрессе на фоне введения лектина Paenibacillus polymyxa // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Тез. третьей межрегиональной конференции молодых ученых, Саратов, 10 - 12 октября 2006. - С.33.

5. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Влияние лектинов Paenibacillus polymyxa на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови самцов крыс в условиях этанолового стресса // Современные наукоемкие технологии. - 2007. - № 5. - С. 73.

6. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Влияние лектина Paenibacillus polymyxa 1460 на молочнокислую микрофлору кишечника крыс под действием стрессовых факторов // Вавиловские чтения - 2007: Материалы конференции, посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26 - 30 ноября 2007. - Саратов, 2007. - С. 329.

7. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Роль лектинов бацилл в регуляции активности глутатион-S-трансферазы в условиях этанолового стресса // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 29 января - 2 февраля, 2007, секция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и животноводства». - Саратов, 2007. - С. 58-59.

8. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Изменение молочнокислой микрофлоры кишечника под действием лектина бацилл в условиях стресса // Вестник Саратовского госагроуниверситета им Н.И. Вавилова. - 2007. - № 5. - С.20 - 22.

9. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Лектин Paenibacillus polymyxa как регулятор молочнокислой микрофлоры кишечника // Актуальные аспекты современной микробиологии: Тез. третьей международной школы - конференции, Москва, 22-23 ноября 2007. - Москва, 2007. - С. 84.

10. Кикалова Т.П., Неверова Н.Н., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Роль лектина бацилл в регуляции активности глутатион-S-трансферазы // Актуальные аспекты микробиологии: Тез. третьей международной школы - конференции, Москва, 22-23 ноября 2007. - Москва, 2007. - С.48 - 49.

11. Кикалова Т.П., Неверова Н.Н., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Определение активности глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови самцов крыс в условиях кратковременного и продолжительного холодового стресса на фоне введения лектинов бацилл // Современные наукоемкие технологии. - 2008. - № 1. - С. 93.

12. Неверова Н.Н., Кикалова Т.П., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Влияние лектина Paenibacillus polymyxa на активность глутатион-S-трансферазы в крови крыс при стрессе // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2008. - № 80. - С. 117 - 120.

Размещено на Allbest.ru

...