Создание исходного материала для селекции гибридных штаммов Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на основе метода отбора гаплотипов с повышенной активностью лакказ

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Создание исходного материала для селекции гибридных штаммов Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на основе метода отбора гаплотипов с повышенной активностью лакказ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Копыльцов Сергей Васильевич

Саратов 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Иванов Геннадий Иванович

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент Миронов Александр Давыдович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Дьячук Таисия Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита состоится «9» июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «28» апреля 2009 г. и размещен на сайте университета www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета

Ученый секретарь диссертационного совета Карпунина Л.В.

мицелий лакказа продуктивность гибридизация

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На фоне роста стоимости зерновых культур недостаточно полно используется возможность вовлечения лигноцеллюлозных отходов в производство дополнительной белковой продукции. Одним из эффективных методов переработки растительных отходов является их биоконверсия при выращивании базидиальных грибов. Среди промышленно культивируемых грибов вешенка занимает одно из ведущих мест по производству плодовых тел в России.

Динамичное развитие грибоводства выявило потребность производства в штаммах вешенки, удовлетворяющих современным требованиям интенсивных технологий: сокращение сроков обрастания субстрата и выгонки плодовых тел, устойчивость к конкурентной микрофлоре, бесшоковость, высокая продуктивность и товарные качества плодовых тел. Несмотря на возрастающие объемы культивирования вешенки, промышленное производство в значительной степени сдерживается из-за отсутствия продуктивных отечественных сортов и штаммов (Таксономический анализ..., 2002). На сегодняшний день в государственном реестре селекционных достижений РФ зарегистрированы четыре сорта, относящиеся к вешенке устричной, и один сорт вешенки флоридской. В связи с этим важной задачей современной грибной индустрии является создание новых высокопродуктивных сортов. Выявлению различных факторов, влияющих на продуктивность плодовых тел, посвящен ряд работ (Wang, Anderson, 1972; Eger G., 1974; Larraya, 2002), однако системных исследований по их использованию при проведении гибридизации и отборе штаммов выполнено недостаточно.

Цель исследования: создание исходного материала рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm методом отбора гаплотипов по активности лакказ для селекции на продуктивность.

Задачи исследования:

1. Разработать метод отбора монокариотического и дикариотического мицелия по активности лакказ.

2. Выделить из промышленно культивируемых штаммов моноспоровые изоляты, произвести их анализ и отбор по активности лакказ.

3. Провести гибридизацию отобранного монокариотического мицелия разных штаммов и оценить активность лакказ полученных гибридов.

4. Изучить продуктивность и габитус плодовых тел коммерческих и полученных гибридных штаммов P. ostreatus в научно-хозяйственных испытаниях.

5. Исследовать местообитания «летних» штаммов рода Pleurotus (Fr.) P. Kumm. на территории Северо-Западного Кавказа, установить вариацию активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

Научная новизна. Разработан экспресс-метод определения активности лакказ мицелия вешенки.

Впервые экспериментально подтверждена целесообразность осуществления отбора дикариотических и монокариотических форм мицелия по признаку активности лакказ при проведении селекции вешенки на повышение продуктивности.

Впервые показана взаимосвязь активности лакказ и инициации плодоношения вешенки обыкновенной с рН субстрата при ее твердофазном культивировании.

Впервые проведено изучение популяции «летних» штаммов вешенки лесных биоценозов Северо-Западного Кавказа, установлена вариация активности лакказ их мицелия и степень генетического внутривидового разнообразия особей в популяции.

Практическая значимость. Разработанная методика отбора родительских форм по признаку активности лакказ была применена при проведении селекции на продуктивность и для создания гибридных штаммов (патент РФ на изобретение № 2295728).

Получен гибридный штамм ВКМ ВКМ F-3889D, позволяющий повысить продуктивность плодовых тел вешенки и исключить стадию холодового «шока» и депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г. К. Скрябина.

Исследовано генетическое разнообразие внутри природных популяций вешенки и собранные образцы могут быть использованы в селекци и при отборе штаммов для промышленного культивирования в условиях летнего сезона.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработан метод отбора гаплоидов вешенки по активности лакказ на плотных питательных средах.

2. Использование гаплотипов вешенки с повышенной активностью лакказ при проведении селекции обеспечивают увеличение продуктивности получаемых гибридов.

3. Получен гибридный штамм P. ostreatus (Fr.) Kumm. ВКМ F-3889D методом отбора гаплоидов с высокой активностью лакказ, достоверно превышающий по продуктивности родительские формы.

4. Культивирование вешенки на субстрате с повышенным значением рН увеличивает период наступления максимума активности лакказ и инициации плодоношения на десять суток.

5. Штаммы вешенки лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа обладают значительной вариацией лакказ мицелия и высоким уровнем генетического полиморфизма. Отобранный генетический материал пригоден для селекции штаммов, формирующих базидиомы в летний период при культивировании интенсивным методом.

Работа выполнена на кафедре биотехнологии, биохимии и биофизики Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный аграрный университет» в рамках научно-исследовательской темы кафедры: «Разработка и научное обоснование способов получения и использования экологически безопасных функциональных кормовых и пищевых концентратов и добавок на основе ресурсосберегающих биотехнологий» (№ гостематики 01.2.00606836).

Апробация работы. Основные результаты работы доложены: на VII и VIII Региональных научно-практических конференциях молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2005; 2006); Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции по инновационному малому предпринимательству в приоритетных направлениях науки и высоких технологий (Москва, 2006); Заключительном туре Всероссийской конференции смотра-конкурса на лучшую студенческую работу по направлению растениеводство и земледелие (Москва, 2006); конференции «Биотехнология как научно-практический приоритет развития Кировской области» (Киров, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2008).

Публикации. Результаты исследования отражены в 10 печатных работах, из них 1 патент и 2 работы опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов, предложений производству и литературы, включающей 144 источников, в том числе 40 зарубежных авторов. Работа изложена на 128 страницах и иллюстрирована 19 рисунками, 11 таблицами, содержит 3 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований

Лабораторные исследования проводили с грибами P. ostreatus штаммами Львовский, Флорида, Пенсильвания, Р77, НК35 (мицелий был предоставлен ФГУ «Краснодарский биоцентр», г. Краснодар). Для изучения генетического полиморфизма использовали штаммы P. pulmonarius ВКМ F-2006 и P. cornucopiae ВКМ F-1979, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, а также 23 штамма P. pulmonarius из природных условий обитания.

Выделение чистых культур грибов и размножение мицелия осуществляли на глюкозо-дрожжевой среде (Семенов, 1990). Музейные штаммы хранили на сусло-агаровой среде с использованием сусла 1,5-2° по Баллингу при температуре + 4°С. Сбор природных штаммов проводили в период с августа по сентябрь 2008 г. на северном макросклоне Главного Кавказского хребта.

Определение активности лакказ экстракта из субстрате при твердофазном культивировании осуществляли на спектрофотометре UNICO 2000. при длине волны 436 нм (е₄₃₆=29,3 мМ^-1см^-1) (Кадималиев, 2003), используя в качестве хромогенного субстрата 10 мМ раствор пирокатехина в 0,1 М Na-ацетатном буфере, рН 4,9 (Степанова, 2003).

Производственные испытания проводили на базе ООО «Айлант», г. Краснодара. Зерновой субстрат готовили общепринятым методом, включающим внесение 5% углекислого кальция и стерилизацию автоклавированием (Промышленное культивирование…, 1978). В качестве субстрата для полупроизводственных опытов использовали смесь подсолнечной лузги и пшеничной соломы (1:1). Подготовку проводили методом пастеризации при температуре 75-80°С в течение 8 часов в сочетании с ферментацией в субстратной машине барабанного типа СМ-1 (ООО «Техник», г. Саратов).

Препараты суммарной ДНК получали из плодовых тел общепринятым методом (Kumeda, Asao, 1996). При RAPD-анализе полиморфизма ДНК проводили амплификацию с использованием RAPD-праймера S-13 и в условиях, примененных для выявления полиморфизма у представителей рода Pleurotus (Шнырева и др., 2003). Данные RAPD-маркирования были представлены в виде бинарной матрицы. По матрице состояний была рассчитана матрица различий (Nei, 1978) с последующим построением дендрограммы сходства невзвешенным парно-групповым методом с арифметическим усреднением (UPGMA). Построение филогенетического дерева выполнено с помощью программы STATISTICA 5.5^®.

Для определения видовой принадлежности природных изолятов использовали молекулярные методы видовой идентификации, основанные на применении RFLP (restriction fragment lengh polymorphism) анализа фрагментов рибосомального оперона ITS (internal transcribed spacer). ITS участки рибосомальной ДНК были амплифицированы с использованием праймеров ITS4 и ITS5 (White at al, 1990). Рестрикцию ПЦР продукта проводили согласно Янгу (Yang и др., 2007) с использованием рестриктазы Hae III и поставляемым с ней буфером (ООО «СибЭнзим», Москва).

Оценку органолептических показателей проводили по пятибалльной шкале.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t), Колмогорова-Смирнова (л), Фишера (F) с применением корреляционного, дисперсионного, кластерного анализов (Доспехов, 1985; Рокицкий, 1973), используя компьютерные программы Microsoft Exel и STATISTICA 5.5^®.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка метода отбора гаплотипов грибов рода Pleurotus с повышенной активностью лакказ

Основой для отбора штаммов по активности лакказ является то, что в процессе биодеструкции лигноцеллюлозных субстратов ключевую роль, по мнению ряда авторов, играют именно лакказы (Королева, 1998; Степанова, 2003). Предлагаемый метод определения активности лакказ заключается в денситометрической оценке окрашенных продуктов реакции в результате взаимодействия секретируемого мицелием фермента и хромогенного субстрата. Учитывая сложную систему регуляции продуцирования грибами лигноцеллюлазных ферментов, оценку активности лакказы проводили на средах с добавлением компонентов близких по составу с используемыми при промышленном культивировании субстратами. Каждый вариант содержал б-нафтол в качестве хромогенного субстрата и отличался источником углерода.

Целесообразность использования данного метода в качестве экспресс теста согласовывается с данными ряда авторов о возможности использования агаризованных сред в качестве индикатора активности лакказ (Методы экспериментальной микологии, 1973; Srinivasan, 1995). Однако в отличие от работы С. Сринивейсона (Srinivasan, 1995), нами была исследована способность продуцирования данных ферментов непосредственно в процессе роста мицелия.

Мицелиальную культуру инокулировали на питательную среду в центр чашки Петри и инкубировали в темноте при 25°С в течение 4-х суток. За это время мицелиальная колония разрасталась в радиальном направлении. Вокруг нее образовывались окрашенные зоны в результате взаимодействия выделяемого фермента и субстрата (рис. 1).

Рис. 1. Действие лакказ на питательных средах, содержащих различные источники углерода: a - глюкоза и клетчатка (солома); б - глюкоза и целлюлоза; в - только целлюлоза; г - только клетчатка (солома)

При добавлении в питательные среды с клетчаткой глюкозы формировалось интенсивное равномерное окрашивание поверхности среды по всей площади зарастания мицелием (рис. 1 а, б). На средах, где в качестве источника углерода использовали лишь целлюлозный субстрат, окрашивание и, следовательно, продуцирование лакказ было цикличным (рис. 1 в, г). Возможно, этот процесс регуляции продуцирования лакказы обусловлен взаимной связью биосинтеза и действия ферментов, разрушающих целлюлозу и лигнин.

Дисперсионный анализ данных активности лакказ дикариотического и монокариотического мицелия позволил сделать вывод, что среди исследованной в работе выборки из 44 штаммов имеются монокарионы как достоверно превышающие по активности лакказ дикариотический штамм, так и достоверно уступающие ему по этому показателю. Непосредственно между монокарионами по величине наименьшей существенной разности так же выявлены явные различия по уровню активности продуцируемых в субстрат лакказ. Использование данного способа определения активности лакказы базидиальных грибов на твердой агаризованной среде, содержащей целлюлозу, позволяет определять активность указанного экзофермента живой мицелиальной культуры гриба в процессе роста и развития на среде с природным источником углерода.

Выявление вариабельности активности лакказ у монокариотического и дикариотического мицелия вешенки

Для общей оценки вариабельности популяции достаточно оценивать вариабельность на уровне генов или их белковых продуктов (Дьяков, 2005). То есть, для успешного ведения селекции важно выявить фенотипический полиморфизм в популяциях и отобрать носителей требуемого признака.

В исследование по оценке активности лакказы были включены 38 монокариотических изолятов штамма НК35 и 23 монокариотических изолята штамма Львовский. Значения диаметра окрашенной зоны питательной среды на 4-е сутки культивирования монокариотических изолятов штамма НК35 варьировали от 3 до 27,7 мм и от 5 до 30,0 мм для монокариотических изолятов штамма Львовский. Средний диаметр окрашенных зон питательной среды, образуемых дикариотическим мицелием штаммов НК35 и Львовский, составлял 20,7±0,2 мм и 30,0±0,3 мм, соответственно.

Сравнение монокариотических изолятов и дикариотического мицелия штамма НК35 (НСР₀₅ = 3,6 мм; Р = 0,05) по активности лакказы выявило 6 изолятов, достоверно превосходящих исходный штамм НК35: mНК₁₇, mНК₂₄, mНК₂₈, mНК₃₂, mНК₃₅ и mНК₃₆.

Определение корреляционной связи между активностью лакказы и скоростью роста у 36-ти монокариотических изолятов штамма НК35 с использованием критерия z показало сильную достоверную связь между этими признаками (r = 0,7; n = 36; t ф = 4,6 > t_st = 2,76; Р = 0,01).

Сравнение активности лакказы у монокариотического и дикариотического мицелия штамма Львовский (НСР₀₅ = 3,6 мм) не выявило изолятов, достоверно превосходящих по этому признаку исходный штамм. При этом только один изолят (mЛ₂₆) находился на уровне штамма Львовский по уровню активности фермента. Для проведения отбора среди других штаммов, используемых в работе (Флорида, Пенсильвания, Р77 и Дикого), также получали моноспоровый мицелий на плотной агаризованной среде. В результате проведенной работы из 300 выделенных моноспоровых изолятов после оценки было отобрано 14 изолятов с максимальными показателями ферментативной активности, которые использовали в программе скрещиваний.

Таким образом, проведенный по нашей методике отбор гаплотипов, позволяет выделять генотипы с максимальной активностью лакказ для последующей гибридизации.

Определенный интерес вызывает оценка изучаемых выборок монокарионов по относительному показателю изменчивости - коэффициенту вариации активности лакказ. Наименьшим он был у монокарионов штамма Флорида (18%), максимальным - штамма НК35 (39%). Оба штамма давно используются в производстве. Учитывая, что длительная селекция и отбор приводят к сужению генетической основы и вариации признаков штаммов, можно предположить, что данные штаммы, в особенности НК35, представляют собой гетерозиготы по генам, контролирующим лигноцеллюлазную активность ферментов. Совокупности монокарионов остальных штаммов имели коэффициент вариации от 25 до 30%, что характеризует их изменчивость как значительную (Доспехов, 1979). Вариабельность признака активности лакказ заслуживает особого внимания, так как это является отражением генетической неоднородности сибсовых изолятов внутри одного штамма, что создает основу для отбора и последующей гибридизации.

Проведенные исследования показывают, что наряду с имеющимися методическими приемами отбора перспективных штаммов, использование признака активности лакказ на ранних этапах селекционной работы может способствовать эффективному отбору потенциально высокопродуктивных штаммов.

Изучение динамики активности лакказ при разных значениях рН субстрата и связь этого фактора с инициацией плодоношения

При промышленном культивировании вешенки одним из основных условий является получение селективного субстрата. Для этого применяют мягкую термическую обработку, обусловливающую развитие термофильной микрофлоры, а также внесение в субстрат щелочных агентов с целью предотвращения развития конкурентной микофлоры.

Значение водородного показателя с помощью гашенной извести, либо других щелочных реагентов, доводят до рН 8,0-8,5. Однако оптимум действия грибных ферментов, обеспечивающих биодеградацию лигноцеллюлозных субстратов, находится в диапазоне рН 4,7-6,0 и его изменение может сказаться на развитии гриба.

Для выяснения периода времени от инокуляции до инициации плодоношения у выведенного нами штамма P. ostreatus ВКМ F-3889D было проведено исследование по выявлению активности лакказ в этот период. Культивирование проводили на лузге семян подсолнечника в двух вариантах. В первом случае субстрат защелачивали гидроокисью натрия. Значение рН после термической обработки составляло 8,5. Субстрат во втором варианте имел естественное значение рН 5,5. В опыте учитывали интенсивность колонизации мицелием субстрата, динамику изменения рН, активность лакказы и срок инициации плодоношения.

Мицелий, инокулированный при рН 8,5, значительно отставал в скорости колонизации субстрата. Значение рН постепенно снижалось и к 23-м суткам достигло 6,3. В варианте, где защелачивание субстрата не применялось, колонизация субстрата происходила значительно активней и значение рН не изменялось.

Между вариантами была выявлена значительная разница в динамике накопления лакказ, которая представлена на рисунке 2. Для обоих вариантов образование фермента возрастало с накоплением мицелиальной биомассы, но максимальное значение достигалось в разное время. Интерес представляет тот факт, что на следующие сутки после достижения максимума активности фермента в обоих вариантах происходила инициация плодоношения - появление примордиев.

Рис. 2. Динамика активности лакказ при разных значениях рН субстрата

Примечание: 1- исходный субстрат; 2 - субстрат с исходным рН 8,5.

При переходе от вегетативной стадии к регенеративной активность лакказ снижалась. Эти данные подтверждают имеющееся в литературе предположение, что лакказа действительно является фактором-индуктором, т.к. инициация плодоношения наступает сразу после достижения максимума лакказной активности.

Таким образом, результаты исследований показали, что культивирование мицелия вешенки на субстрате с щелочной реакцией приводит к снижению скорости колонизации мицелием субстрата, растягивает период секреции лакказы и начала стадии телеоморфы. В связи с этим, при проведении такого технологического приема с целью предотвращения развития микроскопических грибов как защелачивание субстрата рН не должен превышать 8,0.

Получение гибридных штаммов

Для повышения эффективности селекции необходимо использовать методы отбора, основанные на косвенных показателях, коррелирующих с продуктивностью. Активность лакказ, синтезируемых мицелием, была использована как косвенный показатель потенциальной продуктивности по следующим соображениям: во-первых, лакказы играют ключевую роль в биодеструкции лигнина и высвобождении целлюлозы для действия целлюлаз; во-вторых, лакказа участвует в биосинтезе внеклеточных пигментов, склеивающих клеточные стенки гиф при образовании плодовых тел и ризоморфов; в-третьих, вегетативный рост гриба непосредственно связан с активностью лакказ.

При создании гибридных форм вешенки в качестве критериев отбора исследовали активность лакказ, выделяемых в субстрат. Общая схема получения новых гибридных штаммов включала выделение исходных монокариотических родительских форм, анализ активности вышеуказанного фермента, отбор лучших изолятов и проведение межштаммовых скрещиваний между ними.

Гибридизацию проводили во всех возможных сочетаниях, кроме сибсовых скрещиваний, исключая получение инбредного мицелия. Гибридный мицелий оценивали по активности лакказ. Оценка существенности разности средних значений активности лакказ по t-критерию позволила выделить из представленной в таблице 1 совокупности гибридов те, которые достоверно превышали по этому показателю родительские дикариотические штаммы. К таким гибридам относятся Г₁, Г₂, Г₄, Г₆, и Г₁₂. Остальные гибриды имели достоверное превышение лишь над одним из родительских штаммов, либо их активность находилась в пределах случайных колебаний для принятого уровня значимости.

Таблица 1

Продуктивность гибридных и коммерческих штаммов (% от массы влажного субстрата)

Полученные гибридные штаммы оценивали по морфологическим показателям и продуктивности плодовых тел. На первом этапе все отобранные гибриды выращивали в пакетах массой по 2,5 кг.

Проведенный дисперсионный анализ позволил отобрать пять гибридных штамма Г₁, Г₂, Г₃, Г₆, Г₇, продуктивность которых достоверно превышала продуктивность составляющих их родительских промышленно культивируемых штаммов на 10,9; 12,4; 21,6; 44,2 и 17,5%, соответственно. Из указанных гибридов три (Г₁, Г₂, Г₆) превышали обе родительские дикариотические формы по активности лакказ, а два остальных (Г₃ и Г₇) - достоверно превышали одного из родителей. Это указывает на то, что проведение отбора гаплотипов на основании активности лакказ является весьма эффективным методом ведения селекционной работы на повышение продуктивности штаммов.

На втором этапе гибриды Г₁, Г₂ и Г₆ повторно оценивали на продуктивность, культивируя их на промышленных блоках. Полученные данные сравнивали с коммерческим штаммом Дон, культивируемым в хозяйстве. Продуктивность исследованных штаммов была значительно выше, чем при использовании субстратных блоков массой до 2,5 кг. Полученные результаты согласовываются с данными Д. С. Партина (Партин, 2006), которым было отмечено, что уменьшение размера субстратного блока приводит к значительному снижению продуктивности вешенки. Представленные в таблице 2 данные демонстрируют, что между гибридными штаммами хотя и есть различия по величине продуктивности, тем не менее, они не существенны. Продуктивность коммерческого штамма Дон, который использовали в качестве стандарта, была существенно ниже.

Таблица 2

Динамика плодоношения и продуктивности вешенки разных штаммов (% от массы влажного субстрата)

Дисперсионный анализ результатов опыта показал, что между вариантами выявлены существенные различия на 5%-ном уровне значимости. Сравнение полученных данных по величине наименьшей существенной разности показало, что опытные вариантами Г₁, Г₂ и Г₆ не различаются между собой, но достоверно превышают по продуктивности коммерческий штамм Дон. Таким образом, отобранные по признаку активности лакказ гибридные штаммы вешенки при культивировании на полноразмерных грибных блоках сохраняют свое преимущество по уровню продуктивности плодовых тел над коммерческими штаммами.

Проведенные органолептические исследования позволяют заключить, что, не смотря на существенное повышение в процессе селекции уровня продуктивности, гибридные штаммы не уступают коммерческим по изученным органолептическим показателям.

Формирование нового селекционного материала вешенки на основе штаммов лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа

На сегодняшний день большинство промышленно культивируемых штаммов относятся к одному биологическому виду - P. ostreatus. Среди множества положительных качеств данного вида имеются и недостатки, основным из которых является необходимость изменения температурного режима на всем этапе морфогенеза гриба. В то же время внимание многих исследователей привлекает другой биологический вид - Pleurotus pulmonarius. По своим макроморфологическим признакам и общему габитусу плодовых тел этот вид незначительно отличается от P. ostreatus, что часто приводит к ошибкам при их идентификации. При этом, температурный оптимум для роста и плодообразования находится в диапазоне от 25 до 30°С, коэффициент вариации активности лакказ монокариотического мицелия P. pulmonarius 25,9%, что делает вид перспективным для селекции и промышленного производства.

Материалом для исследований послужили плодовые тела грибов вешенки из 6 локалитетов Северо-Западного Кавказа. Обнаруженные природные штаммы вешенки представляли собой группу, гетерогенную по комплексу таксономических признаков, характеризующих габитус плодового тела.

Учитывая, что таксономические признаки, основанные на морфологии базидиом, находятся в зависимости от типа субстрата, сроков плодоношения, сопряжены с абиотическими факторами среды обитания, проводить видовое определение аборигенных штаммов при отсутствии дискретных фенотипических признаков весьма затруднительно. В связи с этим для идентификации мы использовали ПЦР - RFLP-анализ, который показал, что все 23 образца принадлежат к одному биологическому виду P. pulmonarius (рис. 3). Достоверность отнесения природных штаммов к указанному виду также была подтверждена скрещиваниями с тестерными штаммами.

Рис. 3. ПЦР - RFLP фрагменты, полученные рестрикцией ITS участка рибосомальной ДНК с использованием рестриктазы HaeIII

Примечание: линии 1, 3 - P. ostreatus ВКМ F-3889D; 2 - P. cornucopiae ВКМ F-1979; 4 - P. pulmonarius ВКМ F-2006; 5 - 19 - природные изоляты; М - маркер молекулярной массы ДНК MassRuler^тм DNA Ladder Mix.

Для повышения эффективности отбора у штаммов, приблизившихся к селекционному лимиту, необходимо привлекать для скрещивания новые штаммы, имеющие иные аддитивные гены. Одним из параметров, по которому исследователи оценивают уровень изменчивости, является доля полиморфных локусов. Все штаммы имели специфические RAPD-спектры, различающиеся числом фрагментов, их размером и степенью выраженности на электрофореграмме. Наряду с наличием общих ампликонов большую часть спектров составляют фрагменты, которые присутствуют в одних и отсутствуют в других геномах. Эти фрагменты являются полиморфными маркерами исследуемой ДНК (рис. 4). Соотношение между общим числом выявленных и полиморфных ампликонов для праймера S-13 составило 14/13.

Генетический полиморфизм в целом для выборки мы оценивали как суммарную долю RAPD-признаков, по которым наблюдается изменчивость от их общего числа. Применительно к объединенной выборке доля полиморфных локусов в общей совокупности составила 92,8 %, что создает широкую генетическую базу для отбора изолятов и использования их в селекционном процессе.

Рис. 4. ПЦР профили природных изолятов вешенки с использованием праймера S-13

Примечание: 1 - IX; 2 - X; 3 - XI; 4 - XII; 5 - XIII-1; 6 - XIII-2; 7 - XIII-3; 8 - XIV; 9 - XV

Для исключения вклада индивидуальной изменчивости в полиморфизм RAPD-спектров был проведен анализ 7-и монокариотических изолятов, полученных из базидиоспор одного природного штамма P. pulmonarius. Результаты свидетельствовали об отсутствии у близкородственных штаммов полиморфизма в RAPD-спектре с использованием праймера S-13. Следовательно, используемый праймер позволяет выявлять более значительные генетические различия на уровне биологического вида.

Дендрограмма генетического сходства по результатам RAPD-анализа выявляет 2 основных кластера, однако группировка экземпляров внутри кластера не имеет какой-либо связи с географическим положением точек их отбора, т.е. изоляты сочетались независимо от их географического положения, что указывает на пространственную внутрипопуляционную гетерогенность генетической структуры P. pulmonarius и свидетельствует о большом генетическом разнообразии этого вида в исследованных лесных биогеоценозах.

Несмотря на существенный внутривидовой генетический полиморфизм представителей вида P. pulmonarius, генетическая обособленность данных популяционных групп не является строгой. Эти данные показывают достаточно равномерное распространение особей с разными генотипами по исследованной территории.

Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что выявленные природные локалитеты P. pulmonarius представляют собой генетически и фенотипически гетерогенную популяцию с высоким уровнем полиморфизма особей. Выборка из природных изолятов может быть использована в качестве источника нового генетического материала для селекции, а также внедрения в производство штаммов, способных формировать плодовые тела в условиях летних температур.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод оценки лакказной активности мицелия вешенки на плотных питательных средах с хромогенным субстратом, позволяющий вести отбор гаплотипов вешенки с максимальными значениями.

2. Среди трехсот исследованных сибсовых монокарионов выявлена значительная вариабельность по признаку активности лакказ с коэффициентом вариации от 25 до 39%.

3. Установлено, что культивирование мицелия вешенки на субстрате с рН 8,5 замедляет динамику активности лакказ и сдвигает максимум активности на 10 суток. Начало плодоношения совпадает с моментом достижения максимальной активности лакказ при снижении значения рН до 5,5.

4. Отбор гаплотипов с высокой активностью лакказ позволил получить гибридные штаммы, достоверно превышающие по продуктивности родительские формы.

5. Методом рестрикционного анализа установлено, что штаммы, формирующие базидиомы в летний период на территории лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа, представлены одним биологическим видом P. pulmonarius.

6. Генетический полиморфизм летних штаммов P. pulmonarius лесных биогеоценозов Северо-Западного Кавказа, оцененный с использованием RAPD-признаков, составил 92,8%.

7. Исследованные природные локалитеты P. pulmonarius представляют собой генетически и фенотипически гетерогенную популяцию с высоким уровнем полиморфизма особей и значительной вариацией активности лакказ мицелия.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1. В условиях промышленного производства грибоводческим хозяйствам рекомендуется использовать штамм P. ostreatus ВКМ F-3889D, с продуктивностью плодовых тел на уровне 30-32% от массы влажного субстрата и не требующий снижения температуры воздуха для инициации плодообразования.

2. При подготовке субстрата для культивирования вешенки не рекомендуется доводить рН субстрата выше 8,0 во избежание затягивания инициации плодоношения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Копыльцов, С.В. Зависимость степени деградации соломы от лигнин- и целлюлозолитической активности ферментов гибридных штаммов вешенки / С.В. Копыльцов, Г.И. Иванов // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VII Региональной научно-практической конференции молодых ученых, Краснодар, 8-9 декабря 2005 г. - Краснодар, 2005. - С. 29-30.

2. Копыльцов, С.В. Получение высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки обыкновенной, Pleurotus ostreatus / С.В. Копыльцов // Живые системы: сб. докладов Всероссийской конференции в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению, Киров, 5-6 октября 2006 г., Киров, 2006. - С. 66-69.

3. Копыльцов, С.В. Создание высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки / С.В. Копыльцов // Биотехнология будущего: сб. статей Международной школы-конференции молодых ученых, С-Петербург, 6-9 июня 2006 г. - М., 2006. - С. 40-41.

4. Иванов, Г.И. Урожайность коммерческих штаммов вешенки, предлагаемых к промышленному культивированию / Г.И. Иванов, С.В. Копыльцов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2006. - Вып. 4. - С. 128-135.

5. Копыльцов, С.В. Получение высокопродуктивных гибридных штаммов вешенки обыкновенной, Pleurotus ostreatus / С.В. Копыльцов // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VIII Региональной научно-практической конференции молодых ученых, Краснодар, 7-8 декабря 2006. - Краснодар, 2006. - С. 202-203.

6. Иванов, Г.И. Применение показателя активности лакказы мицелия в селекции на урожайность плодовых тел вешенки обыкновенной / Г.И. Иванов, С.В. Копыльцов // Доклады МОИП: сб. статей Всероссийской конференции, Москва, 18-20 ноября 2006 г. - М., 2006 г. - С. 223.

7. Копыльцов, С.В. Изучение активности экзофермента лакказы гриба вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) на питательных средах с различными источниками углерода / С.В. Копыльцов, Г.И. Иванов // Студенчество и наука: сб. студенческих работ КубГАУ. - Краснодар, 2007. - С. 11-12.

8. Копыльцов, С.В. Изучение активности фермента лакказы среди дикариотических и монокариотических изолятов гриба Pleurotus ostreatus / С.В. Копыльцов, А.С. Звягин // Развитие АПК: сб. материалов Международной конф. «Роль молодых ученых в реализации национального проекта, Москва, 29-30 мая 2007 г. - М., 2007. - С. 46.

9. Иванов, Г.И. Выявление и использование гаплотипов гриба Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm с повышенной активностью лакказы мицелия в селекции на урожайность плодовых тел / Г.И. Иванов, С.В. Копыльцов // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2008. - Вып. 5. - С. 137-141.

10. Пат. 2295728 Российская Федерация, МПК G01N 33/573, C12Q 1/26. Способ определения активности фермента лакказы базидиальных грибов / Г.И. Иванов, С.В. Копыльцов, заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет». - № 2005117598/13 ; заявл. 07.06.2005 ; опубл. 20.03.2007, Бюл. №8. - 4 с.

Размещено на Allbest.ru