Размещено на http://www.allbest.ru/

ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ЦЫПЛЯТ К КОЛИБАКТЕРИОЗУ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ И БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Малинин Михаил Леонидович

Саратов 2009

Работа выполнена в государственном научном учреждении Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор ветеринарных наук Ласкавый Владислав Николаевич,

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич,

кандидат биологических наук, доцент Мельников Геннадий Васильевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится «14» мая 2009 г. в 11⁰⁰ ч. на заседании диссертационного совета Д 220.061.04. при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан « » 2009 г. и размещен на сайте www.sgau.ru.

Отзыв на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета Карпунина Л.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Колибактериоз наносит значительный экономический ущерб птицеводству (Бессарабов, 2008; Akashi, 1993). Колибактериоз встречается у многих видов сельскохозяйственных животных. Заболевание может протекать в острой, подострой и хронической форме, и часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. У птиц, в отличие от млекопитающих, колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию и протекает как конечная стадия развития других инфекционных заболеваний (Голубева, 1985).

Вирулентность штаммов E. coli для птиц значительно варьирует при параллельном заражении возбудителями других болезней, такими как вирус инфекционного бурсита, микоплазмы; необходимая для развития колибактериоза заражающая доза в этом случае снижается в 1000 и более раз. Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы E. coli, принадлежащие к серовариантам О1, О2, О35, О78, О111. В то же время, более 58% эпизоотических штаммов не типируется коммерческими коли-сыворотками отечественного производства (Виноходов, 2003). Большинство современных вакцин против колибактериоза, выпускаемых медико-биологической промышленностью, являются инактивированными. Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивированных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов E. coli О2 и О78 (Arp, 1989; Виноходов, 2003; Орехов, 2008). Есть сообщения о применении живых вакцин на основе штамма E. coli Б-5 для профилактики колибактериоза телят и поросят (Ласкавый и др., 2005, 2007). Вышеизложенное определяет актуальность исследования биологических характеристик штаммов E. coli, как вызывающих колибактериоз у цыплят производственно значимых кроссов, так и способных формировать протективный иммунитет.

В возникновении, развитии и исходе заболевания колибактериозом резистентность организма играет важнейшую роль (Гуткин, 1984). В этой связи изучение реактивности организма птиц приобретает актуальность для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования к нему эффективного иммунитета. Для адекватной оценки физиологического состояния организма интактных и зараженных цыплят необходима разработка методических подходов к определению наиболее информативных биохимических показателей крови, отражающих метаболические изменения в организме.

Цель работы состояла в сравнительном анализе свойств вирулентных штаммов E. coli №388 (О2), E. coli №389 (О78), E. coli №1 и оценке механизмов формирования устойчивости к ним в организме цыплят при введении бактерий штамма E. coli Б-5.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ морфологических, культуральных, биохимических и серологических свойств вирулентных штаммов E. coli № 388 (О2), E. coli №389 (О78), E. coli №1, их антигенного сходства и способности продуцировать токсины.

2. Определить наиболее оптимальный возраст цыплят для проведения иммунизации против колибактериоза с учетом особенностей метаболических процессов в организме цыплят.

3. Проанализировать бактерицидную активность и токсиннейтрализующую способность сыворотки крови цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных штаммом E. coli Б-5.

4. Оценить способность сыворотки крови цыплят, иммунизированных штаммом E. coli Б-5, образовывать in vitro иммунокомплексы с антигенами различных вирулентных культур эшерихий.

5. Изучить метаболические изменения в организме иммунизированных цыплят при заражении различными вирулентными культурами E. coli и отобрать наиболее информативные показатели, характеризующие устойчивость цыплят к колибактериозу.

Научная новизна. Выявлено, что различия изученных вирулентных для птиц штаммов E. coli связаны не только с их липополисахаридом и мембранными белками, но и со способностью продуцировать токсины. Впервые показано влияние иммунизации цыплят бактериями штамма E. coli Б-5 на способность их сыворотки крови нейтрализовывать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп E. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с антигенами этих штаммов. Проведено комплексное исследование метаболических и иммунологических процессов в организме цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» при формировании устойчивости к колибактериозу. Обоснован оптимальный возраст цыплят кросса «Родонит-2» для проведения иммунизации против колибактериоза по широкому спектру биохимических, гематологических и иммунологических показателей. Проведен сравнительный анализ метаболических изменений по показателям белкового, углеводного и липидного обменов в организме цыплят, иммунизированных и инфицированных вирулентными штаммами E. coli. Показано снижение значений индекса ферментемии у интактных цыплят и его дозозависимое увеличение у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов.

Практическая значимость работы. Полученные данные обосновывают возможность использования бактерий авирулентного штамма E. coli Б-5 для иммунизации цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» с целью создания эффективного антитоксического иммунитета против колибактериоза. Доказано положительное влияние иммунизации на основные производственные показатели у птиц (среднесуточные привесы). Отобран комплекс наиболее информативных микробиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о формировании иммунитета против колибактериоза цыплят, который может быть рекомендован к использованию в промышленном птицеводстве.

Материалы диссертации используются в научно-практической работе ГНУ Саратовская НИВС Россельхозакадемии и при чтении лекций на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Основные положения, выносимые на защиту

1. При введении бактерий штамма E. coli Б-5 у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» формируется эффективный антитоксический иммунитет к изученным вирулентным штаммам E. coli №388 (О2), E. coli №388 (О78), E. coli №1. Иммунизация цыплят наиболее эффективна в возрасте 22 дня.

2. Устойчивость организма цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных бактериями штамма E.coli Б-5, связана со способностью сыворотки крови нейтрализовывать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп E. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с различными антигенами этих штаммов.

3. Определение индекса ферментемии, отражающего взаимосвязь ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, креатинкиназы, лактатдегидрогеназы и отношение активности катаболических процессов центральной зоны к анаболическим процессам периферической зоны метаболизма, позволяет судить о метаболических изменениях в организме иммунизированных и инфицированных E. coli цыплят. цыплята иммунизация колибактериоз метаболический

Работа выполнена в ГНУ Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Россельхозакадемии в период с 2003 по 2008 годы в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение основных закономерностей взаимодействия организма животных и микроорганизмов, обеспечивающие между ними стойкое биологическое равновесие» программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ: «Разработка молекулярно-биологических основ совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Российской конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); VII Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»» (Новочеркасск, 2008); Четвертой Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 156 страницах, иллюстрированы 35 таблицами и 11 рисунками. Список литературных источников содержит 238 наименований, в том числе 138 зарубежных.

Собственные исследования И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Материалы и методы

В экспериментах было использовано 300 цыплят, в том числе цыплят-бройлеров кросса ROSS-308 - 100 голов и цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» - 200 голов.

Исследовали штаммы E. coli Б-5 (из музея культур Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН), E. coli №388 (О2) и E. coli № 389 (О78) (получены из Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной медицины), а также полевой изолят E. coli №1, выделенный из костного мозга павшего цыпленка с признаками колибактериоза.

Микробиологические исследования включали изучение основных морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических характеристик с использованием общепринятых методов (Колычев, Госманов, 2006), антигенного сходства штаммов методами обратной радиальной иммунодиффузии (Фримель, 1987) и твердофазного иммунодота с антителами, меченными коллоидным золотом (Дыкман, 2008), изучение токсинообразования.

Цыплятам кросса «Родонит-2» в возрасте 14 и 22 дня вводили однократно перорально бактерии штамма E. coli Б-5 в дозе 1 млн. м.к. (группа А - в 14 дней), а также 0,5; 1; 2 и 1000 млн. м.к. (соответственно группы 1, 2, 3 и 4 - в 22 дня). Интактные и иммунизированные цыплята были подвергнуты экспериментальному заражению вирулентными для птиц штаммами E. coli №1, E. coli №388 (О2) и E. coli № 389 (О78).

Кровь у цыплят брали пунктированием подкрыловой вены. Сыворотку крови получали по общепринятой методике. Иммунологические исследования включали определение параметров фагоцитоза (Рудик, Тихомирова, 2006), бактерицидной активности сыворотки крови, образования иммунокомплексов in vitro (Hashkova, 1978), наличия в крови специфических антител, нейтрализующих ТСМ указанных выше штаммов E. coli.

Биохимические исследования сывороток крови цыплят проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 P. Концентрацию общего белка, альбуминов, глобулинов, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, общего холестерина и его фракций, триглицеридов, индекс атерогенности, активность ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), г-глутамилтрансферазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ), б-амилазы, липазы, а также содержание кальция и железа определяли по общепринятым методикам (Камышников, 2000). Выбор биохимических параметров определялся необходимостью отражения метаболических изменений по основным видам обмена.

Липополисахарид (ЛПС) выделяли методом водно-фенольной экстракции (Westphal, 1965). Наличие токсинсодержащего материала (ТСМ) в культуральных жидкостях определяли на перитонеальных клетках мыши (ПКМ) с помощью НСТ-теста (Маянский, 1979)

Гематологические исследования проводили на фотометре КФК-3 и микроскопе БИМАМ Р-14. Концентрацию гемоглобина определяли унифицированным гемиглобинцианидным методом, количество эритроцитов и лейкоцитов - методом подсчета клеток в определенном количестве квадратов счетной сетки Горяева (Козинец, 1997). Анализ лейкоформулы проводили по общепринятой методике (Ромейс, 1954). Количество тромбоцитов определяли в мазке периферической крови (Фонио, 1959).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Ашмарин и др., 1962; Лакин, 1990). Расчётные величины определяли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Statgraph (Version 2.6; Cоulter), Microsoft Еxcel 2003 (for Windows XP).

Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов E. coli №1, E. coli №388 (О2), E. coli №389 (О78) и их токсинпродуцирующей способности

На первом этапе работы были изучены основные характеристики исследуемых штаммов Е. coli. Бактерии вирулентных штаммов Е. coli №388 (О2), Е. coli №389 (О78), Е. coli №1 и авирулентного для птиц штамма Е. coli Б-5 соответствовали свойствам типового вида и представляли собой грациликутные палочки. При росте на МПБ культуры образовывали равномерное помутнение среды с образованием незначительного, легко разбивающегося при встряхивании осадка. На среде Эндо культуры Е. coli давали колонии малиново-красного цвета, с металлическим блеском, на среде Левина - колонии темно-фиолетового цвета.

Все культуры Е. coli сбраживали лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу, арабинозу, не сбраживали инозит, не усваивали цитрат натрия, не разжижали желатину, выделяли индол, не восстанавливали серу до сероводорода, восстанавливали нитраты в нитриты, не обладали фенилаланиндезаминазной и цитохромоксидазной активностью.

Для изучения формирования у иммунизированных клетками штамма E. coli Б-5 цыплят кросс-иммунитета к поверхностным антигенам изученных в работе вирулентных штаммов использовали тест обратной радиальной иммунодиффузии. Результаты теста показали, что для штамма E. coli №1 квадрат радиуса зоны преципитации находился в линейной зависимости как от дозы иммунизации, так и от кратности разведения сывороток крови. Это свидетельствует о том, что антитела к штамму E. coli Б-5 образовывали иммунокомплексы in vitro не только с антигенами этого штамма, но и штамма E. coli №1. В то же время для штаммов E. coli №388 (О2) и №389 (О78) не было обнаружено зависимости размера зоны преципитации ни от дозы предшествующей иммунизации цыплят, ни от кратности разведения сыворотки крови.

Использовали также метод твердофазного иммунодота с антителами, меченными коллоидным золотом. На мембране PVDF адсорбировались антигены - ЛПС и внешняя мембрана указанных штаммов (исходная концентрация 2 и 4 мг/мл соответственно) - в титре от 1/1 до 1/512. Положительным контролем служили ЛПС и внешняя мембрана клеток штамма E. coli Б-5, отрицательным контролем - ЛПС и внешняя мембрана бактерий Pseudomonas aeruginosa (Rawadi, 1996). Установлено, что сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма E. coli Б-5, не содержали антител к ЛПС штаммов E. coli №1, №388 (О2) и №389 (О78), но имели антитела к ЛПС штамма E. coli Б-5. Это указывает на то, что бактерицидные свойства сыворотки крови иммунизированных цыплят не были связаны с выработкой специфичных антител к ЛПС вирулентных штаммов. В иммунодоте с внешней мембраной штаммов E. coli Б-5 и E. coli №1 было показано образование комплексов антиген-антитело. При этом для штамма E. coli Б-5 титр сыворотки крови составил 1/512, а для штамма E. coli №1 - 1/32. С внешней мембраной штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78) комплексы антиген-антитело не образовывались. Это свидетельствовало о том, что во внешней мембране клеток штамма E. coli №1, в отличие от штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78), есть структуры, взаимодействующие с антителами сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма E. coli Б-5.

Была проведена серия экспериментов по получению токсинсодержащего материала (ТСМ) из культуральных жидкостей штаммов E. coli №1, E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78). Токсичность проб определяли по изменению дыхания ПКМ (Mosmann, 1983). Результаты свидетельствовали о том, что ТСМ, угнетающие дыхание перитонеальных клеток мыши, присутствуют в культуральных жидкостях всех исследованных штаммов E. coli (рис. 1).

Рис. 1 Разность «токсин-контроль» (мкг формазана на 10⁶ ПКМ) для взвеси ПКМ с ТСМ вирулентных штаммов и сывороткой крови цыплят, иммунизированных E. coli Б-5 в дозе 1 млрд. м.к.

Определяли наличие в сыворотке крови цыплят специфических антител, нейтрализующих токсины указанных штаммов (рис. 1). Сыворотка крови иммунизированных цыплят кросса «Родонит-2» содержала антитела, в полной мере нейтрализующие термолабильный токсин штамма E. coli Б-5 и на 60% - ТСМ штамма E. coli №1. ТСМ штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78) нейтрализовывались сывороткой крови иммунизированных цыплят на 22% и 24% соответственно. Мы предположили, что токсиннейтрализующая активность сыворотки крови зависит от термолабильности ТСМ. Поэтому ТСМ всех исследуемых штаммов были проанализированы на наличие термолабильного токсина, аналогичного токсину штамма E. coli Б-5, по изменению способности тромбоцитов к агрегации. Средний радиус агрегатов в обогащенной тромбоцитами плазме крови при добавлении нативной культуральной жидкости штамма E. coli №1 увеличивался на 40% по сравнению с действием прогретой культуральной жидкости, что свидетельствовало о термолабильности токсина. В то же время, радиус частиц в обогащенной тромбоцитами плазме крови при добавлении нативной культуральной жидкости штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78) достоверно не изменялся по сравнению с действием культуральной жидкости, прогретой при 56°С. Это указывало на отсутствие в культуральной жидкости данных штаммов термолабильного токсина.

Метаболические особенности цыплят разных кроссов

Показано отсутствие достоверных возрастных изменений у интактных цыплят кросса «Родонит-2» в возрасте 14-64 дней для большинства изученных биохимических показателей (табл. 1).

Полученные данные указывали на стабильность обмена веществ цыплят этого кросса.

Для более точной оценки состояния метаболизма в целом нами предложено определение индекса ферментемии, увязывающего активность ферментов АСТ, АЛТ, КК и ЛДГ. АСТ и КК отражают активность катаболических процессов, т.е. статус, главным образом, центральной зоны метаболизма, связанной с реакциями цикла Кребса, а АЛТ и ЛДГ - активность периферической зоны метаболизма, включающей реакции гликолиза, цикла аланина, цикла Кори и др. Индекс ферментемии (ИФ) представляет собой безразмерную величину и определяется по формуле:

ИФ = [АСТ]/[АЛТ] + [АСТ]/[ЛДГ] + [КК]/[ЛДГ]

Чем выше значение ИФ, тем выше относительная активность катаболических процессов центральной зоны метаболизма. Изменение индекса ферментемии может быть более достоверным свидетельством системных нарушений обмена веществ, чем дрейф активности отдельных индикаторных ферментов.

Определение этого индекса позволило выявить глубокие метаболические различия у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» и цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308»: у первых индекс ферментемии сохранял стабильность в течение первых двух месяцев жизни, у вторых достоверно снижался с возрастом.

Таблица 1

Биохимические показатели сыворотки крови интактных цыплят кросса «Родонит-2» в зависимости от возраста

Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями E. coli Б-5

Изучение гемограммы трехнедельных цыплят кросса «Родонит-2» выявило наибольшее содержание фагоцитов - гетерофилов и моноцитов (рис. 2), что позволило предположить наибольшую фагоцитарную активность крови в этом возрасте. Это послужило основанием для последующего сравнительного изучения динамики формирования клеточного и гуморального иммунитета против колибактериоза при введении цыплятам в возрасте 14 или 22 дней бактерий штамма E. coli Б-5. Анализ полученных данных показал, что динамика индекса бактерицидности и фагоцитарного индекса у контрольных цыплят и у цыплят, иммунизированных в различном возрасте, практически совпадала.

Индекс бактерицидности через 3-4 недели после иммунизации незначительно возрастал, а фагоцитарный индекс снижался в контрольной и опытных группах на 33-36%. Это подтверждало вывод о возрастном характере изменений фагоцитарного индекса и индекса бактерицидности крови цыплят кросса «Родонит-2». Отмечено, что фагоцитарный индекс был тем выше, чем больше было в крови содержание гетерофилов и меньше - моноцитов.

Рис. 2 Соотношение количества гетерофилов (Г) и моноцитов (М) в крови цыплят разного возраста, иммунизированных против колибактериоза

В отношении бактерий штамма E. coli №1 бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных в возрасте 14 дней цыплят была выше, чем в отношении клеток штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78), но ниже, чем против клеток штамма E. coli Б-5, для которого титр бактерицидных антител оказался равен 1/8.

При дозе иммунизации 0,5 млн. м.к. титр бактерицидных антител достоверно не изменялся (рис. 3).

Рис. 3 Динамика титров бактерицидных антител к штамму E. coli Б-5 в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза в возрасте 22 дня

С увеличением дозы иммунизации возрастали и значения титров бактерицидных антител: в 4 раза при иммунизации дозой 1 млн. м.к. (группа 2), в 6 раз - дозой 2 млн. м.к. (группа 3), в 18 раз - дозой 1 млрд. м.к. (группа 4). У цыплят экспериментальных групп титры бактерицидных антител через 4 недели после иммунизации возвращались к исходным значениям. Таким образом, динамика параметров фагоцитоза и дозозависимого роста титров бактерицидных антител сыворотки крови свидетельствовала о более эффективной иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями штамма E. coli Б-5 в возрасте 22 дня, чем в 14 дней.

Результаты исследований позволили также установить зависимость титра бактерицидных антител от дозы иммунизации: показан рост значений титра антител к клеткам всех вирулентных штаммов, использованных в работе (табл. 2).

Таблица 2

Доля погибших микробных клеток разных штаммов E. coli после инкубации с сывороткой крови, полученной через 3 недели после иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» в возрасте 22 дня против колибактериоза

При этом наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечена к клеткам штамма E. coli №1, наименьшая - к клеткам штамма E. coli №389 (О78). Значения титров бактерицидных антител к вирулентным штаммам кишечной палочки в крови иммунизированных цыплят оказались ниже, чем к штамму E. coli Б-5, в отношении которого отмечался дозозависимый эффект (рис. 4). Титр бактерицидных антител менялся от 1/16 при дозе 0,5 млн. м.к. до 1/112 при дозе 1 млрд. м.к.

Далее исследовали эффективность и длительность гуморального иммунитета против колибактериоза у иммунизированных цыплят кросса «Родонит-2». Было проведено их экспериментальное заражение в возрасте 6 недель вирулентными штаммами E. coli №1, E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78). Через две недели после заражения в сыворотке крови цыплят определяли величину титров бактерицидных антител ко всем использованным штаммам.

Установлено, что у цыплят, иммунизированных в дозе 1 млрд. м.к. и затем зараженных смесью вирулентных штаммов, титр бактерицидных антител к штамму E. coli Б-5 составил 1/4, к штамму E. coli №1 - 1/25, к штамму E. coli №388 (О2) - 1/4, к штамму E. coli №389 (О78) - менее 1/4. Иммуногенность штаммов E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78) слабо зависела от предварительной иммунизации бактериями штамма E. coli Б-5.

Рис. 4 Зависимость значений титра бактерицидных антител в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2» от дозы иммунизации бактериями штамма E. coli Б-5

Для проверки предположения о том, что иммунизация цыплят штаммом E. coli Б-5 создает не столько антибактериальную, сколько антитоксическую защиту, было предпринято определение в сыворотке крови иммунизированных и зараженных через 3 недели смесью вирулентных штаммов E. coli цыплят, концентрации и титра образующихся in vitro иммунокомплексов (ИК) к токсинам и к липопротеинам указанных штаммов. Результаты представлены в таблице 3. В сыворотке крови цыплят 1-й группы образование ИК с ТСМ штамма E. coli Б-5 отмечено при кратности разведения сыворотки крови 1/4; с ТСМ штаммов E. coli №1 и E. coli №388 (О2) - 1/16, а с ТСМ штамма E. coli №389 (О78) - 1/64. У иммунизированных цыплят групп 2, 3, 4 максимальная кратность разведения сыворотки крови, при которой образовывались ИК in vitro с ТСМ всех изученных штаммов, составляла 1/64 (табл. 3).

Параллельно в этих же сыворотках крови были определены титры бактерицидных антител к E. coli. Установлено, что у цыплят 1 группы титр бактерицидных антител к E. coli Б-5 превышал титры к вирулентным штаммам E. coli в 2 раза; у цыплят 2 группы - в 3,5 раза, 3 группы - в 5 раз, а у 4 группы - в 14 раз. Полученные результаты указывают на низкие значения титров бактерицидных антител к вирулентным штаммам E. coli в отличие от высоких значений титров сыворотки, при которых образовывались ИК.

Таблица 3

Концентрация ИК к ТСМ штаммов E. coli в сыворотке крови цыплят, иммунизированных клетками штамма E. coli Б-5 в возрасте 22 дня, мг/мл

Примечание: в скобках указан титр иммунокомплексов - максимальная кратность разведения сыворотки крови, при которой концентрация иммунокомплексов in vitro составляет не менее 0,01 мг/мл.

Это подтверждало наше предположение о формировании в организме иммунизированных против колибактериоза цыплят преимущественно антитоксической защиты.

Биохимические показатели крови у зараженных и иммунизированных против колибактериоза цыплят

При экспериментальном заражении цыплят смесью штаммов E. coli №1, E. coli №388 (О2), E. coli №389 (О78) активность АСТ повышалась (p<0,05), что указывало на более интенсивное поступление субстратов в цикл трикарбоновых кислот и активизацию катаболического звена обмена веществ. Активность АЛТ достоверно не изменялась в результате заражения. В то же время концентрация глюкозы повышалась (p<0,05) и в сыворотке крови цыплят, зараженных смесью штаммов, была наибольшей, а активность щелочной фосфатазы и липазы - наименьшей (p<0,05) по сравнению с другими группами инфицированных цыплят. Активность ЛДГ у инфицированных цыплят повышалась в 5 раз (p<0,01), что указывает на понижение рН за счет увеличения образования лактата и возможность возникновения анаэробного токсикоза.

Изучение динамики биохимических параметров у иммунизированных цыплят после заражения вирулентными штаммами E. coli показало, что активность КК и АСТ в сыворотке крови цыплят 1 группы (доза иммунизации 0,5 млн. м.к.) была наибольшей и превышала 130 и 15 мккат/л, соответственно. Это указывало на то, что в организме данных цыплят была наиболее активна центральная зона метаболизма.

У этих же цыплят была отмечена ферментемия по АЛТ, достигавшая 1,7 мккат/л, что отражало высокую активность глюкозоаланинового шунта. Активность ЛДГ также была наибольшей в этой группе, превышая 100 мккат/л. Очень высокие значения АСТ и ЛДГ и довольно высокая активность АЛТ свидетельствуют о сдвиге равновесия в обратимой реакции окисления лактата до пирувата вправо. Это понижает рН крови, что в свою очередь сдвигает вправо равновесие в реакции: креатин + АТФ > креатинфосфат + АДФ. Таким образом, в организме цыплят этой группы энергетическое обеспечение внутриклеточных процессов происходит за счет, прежде всего, аэробных процессов катаболизма. У цыплят 2 группы были отмечены сходные тенденции, но выражены они были слабее, чем у цыплят 1 группы.

Сыворотки крови цыплят 4 группы характеризовались высокими значениями коэффициента де Ритиса, а также сравнительно низкой концентрацией общего белка, низкой активностью ГГТ, высокой активностью КК. Гиперферментемия по АСТ в сочетании с гипоферментемией по АЛТ указывает на торможение периферических путей обмена с одновременной стимуляцией центральной зоны метаболизма; интенсивность белкового обмена при этом может быть понижена. Высокая активность КК сопряжена с интенсификацией катаболизма углеводов, а через него - с поддержанием энергетического статуса организма. У цыплят 4 группы можно предполагать глубокие метаболические изменения: повышенный коэффициент де Ритиса на фоне высокой активности КК и низкой концентрации общего белка свидетельствует о выраженном торможении белкового обмена. В организме цыплят 3 группы отмечались похожие тенденции, но выражены они были слабее, чем у цыплят 4 группы.

Через 2 недели после заражения не иммунизированных цыплят смесью вирулентных штаммов E. coli индекс ферментемии уменьшался по сравнению с интактными цыплятами в 4,9 раза; у цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней - в 1,5 раза (рис. 5). При иммунизации цыплят в возрасте 22 дня значения ИФ изменялись дозозависимо: при введении доз 1 млн. и 1 млрд. м.к. достоверных отличий по сравнению с контролем не выявлено, при дозе 2 млн. м.к. ИФ возрастал в 1,4 раза (p<0,05), а при дозе 0,5 млн. м.к. - в 1,8 раза (p<0,01).

Рис. 5 Значения индекса ферментемии в сыворотке крови иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2», спустя 2 недели после заражения их вирулентными штаммами E. coli

У не иммунизированных цыплят метаболические изменения, наблюдавшиеся при экспериментальном заражении вирулентными штаммами E. coli, свидетельствовали о смещении метаболизма в сторону преобладания анаболического звена.

У цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней, изменения метаболизма были направлены в ту же сторону, но менее выражены. У цыплят, иммунизированных в 22 дня, значения ИФ свидетельствовали либо об отсутствии достоверных метаболических изменений (группы 2 и 4), либо о смещении метаболизма в сторону преобладания катаболических реакций (группы 1 и 3).

Таким образом, предложенное нами определение индекса ферментемии дает возможность не только судить о метаболических изменениях в организме цыплят в результате инфицирования E. coli, но и оценивать метаболический статус с точки зрения восприимчивости к инфекции.

Анализ изменений биохимических показателей сыворотки крови цыплят кросса «Родонит-2» при инфицировании их вирулентными штаммами кишечной палочки позволил из большого числа определенных параметров выделить наиболее информативные показатели: активность креатинкиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, аланинамино-трансферазы, аспартатаминотрансферазы, концентрация общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций. Выбор этих показателей был подтвержден результатами представленных ранее биохимических исследований; их определение позволяет получить более объективное представление о состоянии обмена веществ и энергетического статуса организма цыплят.

Для уточнения влияния иммунизации на основные производственные показатели проводили сравнительный анализ динамики среднесуточных привесов у цыплят, зараженных вирулентными штаммами E. coli после предварительной иммунизации клетками E. coli Б-5 и без таковой. У цыплят, зараженных вирулентными штаммами, отмечены отвесы (отрицательные привесы), а у цыплят, зараженных после предварительной иммунизации, - положительные среднесуточные привесы, причем в группе 1 они были выше, чем у интактных цыплят того же возраста.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что при однотипности культурально-морфологических и биохимических свойств изученных вирулентных для птиц штаммов E. coli, выявленные различия связаны не только с их липополисахаридом и мембранными белками, но и с ТСМ. Установлено, что при введении бактерий E. coli Б-5 резистентность цыплят к колибактериозу была связана, преимущественно, с образованием антител к ТСМ вирулентных штаммов. Определение предложенного нами индекса ферментемии позволяет судить о метаболических изменениях в организме инфицированных цыплят и оценивать метаболический статус организма с точки зрения восприимчивости к колибактериозу.

Выводы

1. Показано, что вирулентные для птиц штаммы E.coli №388 (О2) и E.coli №389 (О78) являются продуцентами термостабильного токсина, а штамм E.coli №1 - термолабильного токсина, сходного по свойствам с термолабильным токсином штамма E.coli Б-5.

2. Отмечено отсутствие достоверных изменений концентрации общего белка и глюкозы, а также активности ключевых ферментов крови интактных цыплят кросса «Родонит-2» в возрастной период с 14 до 64 дней. У цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308» наблюдались значительные возрастные колебания важнейших биохимических показателей.

3. Установлен возрастной характер изменений фагоцитарного индекса крови интактных цыплят кросса «Родонит-2», значения которого коррелировали с содержанием гетерофилов в крови; величина индекса бактерицидности в большей степени была связана с числом моноцитов.

4. Изменения фагоцитарного индекса и индекса бактерицидности у иммунизированных цыплят не зависели от возраста иммунизации. Наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечена в отношении E. coli №1, наименьшая - E. coli №389 (О78).

5. Сыворотка крови иммунизированных цыплят содержала антитела, нейтрализующие термолабильный токсин штамма E. coli Б-5 на 100% и ТСМ штамма E. coli №1 на 60%, а также антитела к ЛПС штамма E. coli Б-5, но не имела антител к ЛПС штаммов E. coli №1, E. coli №388 (О2) и E. coli №389 (О78). ИК образовывались in vitro только с ТСМ исследованных вирулентных штаммов E. coli.

6. Показано снижение значений индекса ферментемии у интактных цыплят в 4,9 раза (Р<0,01) E. coli и его дозозависимое увеличение (Р<0,05) у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов. Наибольшее клинико-диагностическое значение принадлежало таким тестам, как: определение ТСМ в культуральной жидкости, определение термолабильности ТСМ, активности креатинкиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, концентрации общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малинин, М.Л. Изменения лейкоцитарной формулы цыплят при инфицировании эшерихиями / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, В.Н. Ласкавый // Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях: сб. материалов юбил. конф. Краснодар, 2006. С. 182 - 184.

2. Малинин, М.Л. Биохимические показатели крови интактных и инфицированных цыплят / М.Л. Малинин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Междунар. научно-практ. конф. Щелково, 2007. С. 255 - 259.

3. Малинин, М.Л. Биохимические показатели сыворотки крови цыплят, инфицированных эшерихиями / М.Л. Малинин // Материалы IV Междунар. конф., посвящ. 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера. СПб, 2008. С. 130.

4. Малинин, М.Л. Биохимические и гематологические показатели у цыплят кросса «Родонит-2» в норме и при инфицировании эшерихиями / М.Л. Малинин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2008. №3. С. 34 - 38.

5. Малинин, М.Л. Использование стандартного метода определения общего белка при исследовании сыворотки крови животных / М.Л. Малинин // Успехи современного естествознания. 2008. №3. С. 105 - 106.

6. Малинин, М.Л. Триглицеридовый индекс как дополнительный показатель при оценке липидного профиля сыворотки крови животных / М.Л. Малинин // Успехи современного естествознания. 2008. №3. С. 106 - 107.

7. Малинин, М.Л. Биохимические и патологоанатомические показатели при эшерихиозе у цыплят кросса «Родонит-2» / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, И.В. Бородавкин // Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. Новочеркасск, 2008. С. 102 - 107.

8. Малинин, М.Л. Использование агрегометра для определения бактериальных токсинов / М.Л. Малинин, Т.Н. Тарасенко Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. Новочеркасск, 2008. C. 167 - 170.

9. Малинин, М.Л. Особенности формирования иммунитета к колибактериозу цыплят при введении бактерий штамма E. coli Б-5 / М.Л. Малинин, В.Н. Ласкавый, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. 2009. №2. С. 24 - 28.

10. Малинин, М.Л. Характеристика свойств различных вирулентных для птиц штаммов E. coli и их способности продуцировать токсины / М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова, К.П. Габалов // Успехи современного естествознания. 2009. №3. С. 48 - 49.

Размещено на Allbest.ru