Биологическая активность лектина paenibacillus polymyxa in vitro и в организме животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Биологическая активность лектина paenibacillus polymyxa in vitro и в организме животных

03.00.07 - микробиология

кандидата биологических наук

Кикалова Татьяна Петровна

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат биологических наук Соболева Елена Федоровна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет МСХА им. К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится «26» ноября 2009 года в … часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова»

Автореферат диссертации разослан «___» ________ 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

лектин животное кишечный токсический

Общая характеристика работы

Актуальность темы Лектины представляют собой углеводсвязывающие белки, способные участвовать во многих внутриклеточных метаболических процессах растений, животных, микроорганизмов. Ни один биологический процесс в клетке не может обойтись без механизмов «персональной идентификации» молекул. Центральные, ключевые процессы, такие как репликация, транскрипция, трансляция, тоже целиком основаны на взаимном узнавании молекул и молекулярных комплексов. Несмотря на эту всепроникающую и всеобъемлющую значимость процессов молекулярного «узнавания», многие его аспекты по-прежнему остаются неясными, гипотетическими. Это относится и к работе огромного класса белковых молекул, способных обратимо и избирательно связывать разнообразные углеводы (Шакирова, Безрукова, 2007), которые называют лектинами.

Наименее изученными среди лектинов различного происхождения являются лектины бактерий. К настоящему времени известно достаточно микроорганизмов, способных синтезировать лектины разнообразной углеводной специфичности (Uhlenbruck, 1987; Лахтин, 1986; Карпунина, Никитина, Трихачева, 1989; Никитина, Итальянская, Карпунина, 1989; Коваленко, 1990; Карпунина, 2002; Sharon, 2007 и др.). Среди бактериальных лектинов наиболее хорошо исследована биологическая активность лектинов патогенных бактерий (Jacewiez et al., 1986; Adam et al., 1997; Тихомирова и др., 2003). Несмотря на имеющиеся публикации в отношении лектинов непатогенных бактерий (Никитина и др., 2002; Абросимова, Новоселова, Мухачева, 2002; Мухачева, 2004; Неверова и др., 2006; Горельникова, 2006; Неверова и др., 2007), их биологическая активность и роль в живых организмах не является до конца изученной.

Для возможности практического применения лектинов непатогенных бактерий в качестве диагностических или лечебных препаратов в медико-биологических исследованиях и ветеринарии, необходимы более глубокие знания об их биологической активности и влиянии на живой организм. Поэтому исследования в этой области являются актуальными и имеют научное и практическое значение.

Цель работы состояла в изучении биологической активности лектина ЛЙЙ Paenibacillus polymyxa 1460 in vitro и в организме животных: его влияния на некоторые показатели метаболизма и кишечную микрофлору животных в норме и в условиях стресса; оценке токсических, бактерицидных, фунгицидных и ранозаживляющих свойств.

Задачи исследования:

1. Исследовать токсичность лектина ЛII P.polymyxa 1460 на биотест-объектах Colpoda steinii.

2. Оценить влияние лектина ЛII P.polymyxa 1460 на морфо-функциональное состояние органов лабораторных белых мышей.

3. Определить воздействие лектина ЛII P.polymyxa 1460 in vivo на активность глутатион-S-трансферазы, аланин- и аспартатаминотрансферазы, на концентрацию церулоплазмина в эритроцитах и сыворотке крови крыс в норме и в условиях принудительного неизбегаемого плавания.

4. Изучить воздействие лектина ЛII P.polymyxa 1460 in vivo на некоторые показатели азотистого, липидного (концентрацию мочевины и холестерина) и углеводного (концентрацию глюкозы) обменов у крыс в норме и в условиях принудительного неизбегаемого плавания.

5. Выявить влияние лектина ЛII P.polymyxa 1460 на микрофлору толстого кишечника крыс в норме и при различных видах стресса (иммобилизационный, холодовой и этаноловый).

6. Исследовать бактерицидные, фунгицидные и ранозаживляющие свойства лектина ЛII P.polymyxa 1460.

Научная новизна

Получены новые данные, характеризующие биологическую активность лектина ЛII P.polymyxa 1460 in vitro и in vivo. Изучено его влияние на метаболические процессы и кишечную микрофлору в организме животных в норме и в условиях стресса. Впервые показано, что предварительное введение лектина в организм экспериментальных животных в условиях принудительного плавания как стресс-фактора, увеличивает их выносливость в два раза. Установлено, что лектин ЛII в условиях патологических нарушений в организме, вызванных стрессированием плаванием, нормализует активность глутатион-S-трансферазы и аланинаминотрансферазы, снижает активность аспартатаминотрансферазы и содержание мочевины в сыворотке крови крыс. Выявлено, что лектин ЛII P.polymyxa 1460 способен стимулировать рост некоторых молочнокислых бактерий и подавлять рост энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике при холодовом, этаноловом и иммобилизационном стрессах.

Впервые проведена оценка токсических, бактерицидных, фунгицидных и ранозаживляющих свойств лектина ЛII P.polymyxa 1460. На биотест-объектах C.steinii и лабораторных белых мышах показано отсутствие его токсичности в концентрациях от 410^-4 до 4 мкг/мл. В условиях in vitro показаны бактерицидные свойства лектина ЛII в тех же концентрациях в отношении Escherichia coli 01, Staphylococcus aureus 209-P, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27533 и фунгицидные в отношении Candida albicans 130. Установлена способность лектина бацилл и экзополисахаридных гелей с его добавлением влиять на заживление ранений резаного типа у крыс.

Практическая значимость

Выявленные свойства лектина ЛII активизировать некоторые процессы метаболизма, способствуя тем самым устойчивости животных к стрессовым воздействиям, проявлять бактерицидные, фунгицидные, ранозаживляющие и тканепротекторные свойства, открывают перспективы возможного применения данного биологически активного вещества в медико-биологических исследованиях и ветеринарной практике.

По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Изучение влияния лектина бацилл на активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов крови крыс при стрессе» (в соавторстве с Н.Н. Неверовой, Л.В. Карпуниной и М.Д. Сметаниной, 2008) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников, специализирующихся в области микробиологии, биохимии, физиологии человека и животных, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом ветеринарного факультета Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 42 от 3 апреля 2008 г.). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и написании дипломных работ в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского и в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Лектин ЛII P.polymyxa 1460 не является токсичным, не изменяет активность, характер передвижения инфузорий и их внешний вид в концентрациях 410^-4, 410^-3, 410^-2, 410^-1 мкг/мл, а в концентрации 4 мкг/мл увеличивает двигательную активность C.steinii, не влияя на другие показатели.

2. Введение лектина бацилл ЛII в дозе 0,2 мкг/животное не оказывает негативного влияния на морфо-функциональное состояние органов лабораторных белых мышей, активирует функции гепатоцитов и тканей головного мозга, стимулирует сперматогенез у самцов по результатам гистологических исследований.

3. Лектин ЛII P.polymyxa 1460 регулирует метаболические процессы в организме экспериментальных животных, нормализуя активность глутатион-S-трансферазы и аланинаминотрансферазы, понижая активность аспартатаминотрансферазы и содержание мочевины в сыворотке крови в условиях патологических нарушений в организме, вызванных стрессированием плаванием.

4. Лектин ЛII P.polymyxa 1460 стимулирует рост некоторых молочнокислых бактерий и подавляет рост энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике в условиях холодового, этанолового и иммобилизационного стрессов.

5. Лектин ЛII в различных концентрациях, в том числе и в чрезвычайно низких (410^-4 мкг/мл), способен проявлять in vitro бактерицидные и фунгицидные свойства в отношении E.coli 01, S.aureus 209-P, P.aeruginosa АТСС 27533 и C.albicans 130.

6. Лектин ЛII в составе некоторых экзополисахаридных гелей в концентрации 4 мкг/мл способствует более быстрому заживлению ранений резаного типа у экспериментальных животных.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение биологически активных веществ (лектинов) в регуляции метаболизма растений и животных» и при частичной поддержке грантом CRDF (CR-006-x1).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: III Международной школе-конференции «Актуальные аспекты микробиологии» (Москва, 2007); региональных конференциях молодых ученых «Вавиловские чтения -2007, 2008» (Саратов, 2007; 2008); всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Саратов, 2009); VI межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, ИБФРМ РАН, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 143 страницах, содержит 18 таблиц и 6 рисунков. Список использованных литературных источников включает 329 наименований, в том числе 211 зарубежных.

Собственные исследования и их обсуждение

Материалы и методы. Объектом исследований явился лектин ЛII различной концентрации (от 410^-4 до 4 мкг/мл), выделенный с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Paenibacillus polymyxa 1460, полученных из Чешской коллекции микроорганизмов (СММ).

Для выделения лектина ЛЙЙ с поверхности P.polymyxa 1460, клетки выращивали в течение 72 часов при температуре 28єС на синтетической среде Мооrе (Moore, Becking, 1963). Биомассу клеток P.polymyxa 1460 осаждали центрифугированием (6000g, 10 мин), многократно пропускали через иглу шприца диаметром 0,1 мм в 1% растворе NaCl. Неочищенный агглютинин получали путем осаждения белка 2,5 объемами ацетона, диализировали против дистиллированной воды в течение 15-20 часов и очищали методом гель-фильтрации на колонке размером 251,5 см, используя в качестве носителя Toyopearl HW-55. Белок с колонки элюировали 0,05 н глицин-HCl буфером (pH 3,0). Выход белковых фракций регистрировали на приборе Uvicord SII (LKB) при 280 нм, спектрофотометре СФ-26, спектрофлюориметре «Флюорат-02 Панорама» в диапазоне длин волн 265-280 нм (Карпунина, 1993; 2002). Количественное содержание белка определяли по методу М.А. Bradford (1976). Гемагглютинирующую активность лектина ЛII определяли реакцией гемагглютинации с самопроизвольным осаждением эритроцитов на стандартных планшетах для иммунологических реакций с использованием 2% суспензии трипсинизированных кроличьих эритроцитов (Lis, Sharon, 1972). Углеводную специфичность определяли по ингибированию реакции гемагглютинации (Луцик, Панасюк, Луцик, 1981).

В работе использовали инфузории C.steinii, полученные из музея культур кафедры биологии, экологии, физиологии и фармакологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова; бактерии E.coli 01, S.aureus 209-P, P.aeruginosa АТСС 27533, полученные из коллекции бактериальных культур кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СГАУ им. Н.И. Вавилова и грибы C.albicans 130, полученные из музея культур Государственного научного учреждения «Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция» Россельхознадзора (г. Саратов).

Для выращивания микроорганизмов использовали: капустную среду, синтетической среде Мооrе (Moore, Becking, 1963), мясо-пептонный агар, гидролизованное молоко, среду Эндо и желточно-солевой агар (Лабинская, 1978).

Определение токсичности проводили по стандартной экспресс-методике определения общей токсичности с использованием простейших в качестве биотест-объектов (Виноходов, 1995; Виноходов, Пожаров, 2006).

В работе использовали самцов белых нелинейных мышей со средней массой тела 21 г, а также самок и самцов беспородных белых крыс со средней массой 210 г. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 18.03.1986 г.). Всех животных содержали в стандартных условиях вивария.

Гистологический анализ органов мышей с окраской срезов гематоксилин-эозином проводили по методике (Меркулов, 1969).

Определение активности глутатион-S-трансферазы (GST) в эритроцитах крови крыс проводили по методу (Habig, Jakoby, 1981); активности аспартат- (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови по методу (Reitman, Frankel, 1957), применяя набор реагентов фирмы «Lachema»; содержание церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови по методу (Ravin, 1961), а содержание мочевины и холестерина в сыворотке крови с помощью набора реактивов фирмы «Агат» (Москва). Концентрацию глюкозы в сыворотке крови определяли с использованием набора реагентов «Глюкоза-ФКД» (Москва).

Количество микроорганизмов в толстом кишечнике крыс определяли методом серийных разведений (Костенко, Радионова, Скородумов, 2001). Идентификацию бактерий проводили по определителю бактерий Берджи (Определитель бактерий…, 1997).

Бактерицидные и фунгицидные свойства лектина ЛII P.polymyxa 1460 и экзополисахаридных (ЭПС) гелей изучали методом диффузии в агар (Лабинская, 1978).

При получении гелей использовали ЭПС бактерий: лаксаран 1596 Выражаем глубокую благодарность аспирантам Е.В. Полукарову, Г.Е. Рысмухамбетовой и к.б.н. Е.Н. Бухаровой за любезно предоставленные препараты полисахаридов., лаксаран 1936, лаксаран Z, полимиксан 88А и ЭПС Xanthomonas campestris B-610, а также коммерческие полисахариды: ксантан и карбокси-метил-окси-этил-целлюлозу (КМОЭЦ) .

В качестве стрессирующих процедур применяли принудительное неизбегаемое плавание («forced swimming») с грузом (5% от массы тела) до утомления в воде при температуре 25°С, регистрируя время плавания по методу (Porsolt et al., 1978) в модификации Е.В. Щетинина с соавт. (1989); холодовой стресс, который моделировали путем помещения крыс на лед на 60 минут; иммобилизационный стресс (фиксировали животных на спине с использованием мягкой лигатуры) в течение 60 минут; этаноловый стресс с помощью зонда вводили 25 % раствор этилового спирта в желудок экспериментальных животных (Анищенко, 1991).

При исследовании ранозаживляющих свойств лектина и экзополисахаридных гелей in vivo, самок белых беспородных крыс контрольной и опытных групп в первые сутки эксперимента фиксировали на специальных планшетах и под эфирным наркозом в межлопаточной области наносили с помощью скальпеля параллельные резаные линейные раны спины длиной до 1 см (Брайловская, 2009). На одно из параллельных ранений наносили экзополисахаридный гель (50 мкл), а на параллельное ранение - такой же объем ЭПС геля идентичного состава с добавлением лектина ЛII (4 мкг/мл). Наблюдение проводили в течение семи суток.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с применением t - критерия Стьюдента (Зайцев, 1991).

Оценка токсичности лектина бацилл на биотест-объекте C.steinii

Анализ токсичности лектина бацилл ЛII проводили, используя в качестве индикаторного организма инфузории - C.steinii. Наблюдение осуществляли сразу и по истечении 5 и 15 минут после добавления лектина ЛII различной концентрации (410^-4, 410^-3, 410^-2, 410^-1 и 4 мкг/мл) в опытные пробы. При микроскопировании опытных проб с добавлением лектина в концентрации от 410^-4 до 410^-1 мкг/мл, количество, активность и характер передвижения инфузорий, их внешний вид не изменялись относительно контрольных показателей. Однако, после добавления в опытные пробы лектина в концентрации 4 мкг/мл, наблюдали увеличение двигательной активности инфузорий без изменения их морфологических характеристик. Возможно, увеличение активности инфузорий связано с усилением каких-либо метаболических процессов в организме простейших. По истечении 15 минут активность передвижения инфузорий снижалась и была сопоставима с активностью передвижения инфузорий в контрольной группе.

Все вышеизложенное позволяет говорить об отсутствии признаков токсичности бактериального лектина ЛII во всех взятых в опыт концентрациях.

Влияние лектина ЛII P.polymyxa 1460 на морфо-функциональное состояние органов мышей

Для подтверждения данных о нетоксичности лектина ЛII P.polymyxa 1460 представлялось интересным изучить его влияние на морфо-функциональное состояние внутренних органов мышей.

Лектин вводили белым беспородным мышам интраперитонеально в дозе по 0,2 мкг/животное в течение 5 суток. На 6 сутки животных выводили из эксперимента передозировкой эфира и производили вскрытие и забор органов для гистоанализа.

При сравнении гистопрепаратов органов животных интактной и контрольной групп с гистопрепаратами органов опытной группы мышей, каких-либо морфологических изменений выявлено не было.

При исследовании гистопрепаратов селезенки, почек, щитовидной железы, желудка и желудочно-кишечного такта, легких, сердца и скелетных мышц мышей опытной группы, каких-либо отклонений от нормы (от показателей интактной и контрольной группы мышей) выявлено не было.

При изучении гистопрепаратов печени, долек семенников и тканей головного мозга животных опытной группы были обнаружены некоторые изменения, свидетельствующие об активизации работы этих органов. Так при исследовании срезов печени животных опытной группы выявлено, что балочная структура долек печени была менее четко выражена, чем у животных контрольной группы. Гепатоциты были слегка увеличены в объеме, границы их слабо заметны. Никаких резко выраженных дистрофических изменений обнаружено не было. Набухание гепатоцитов свидетельствовало об активизации функций печени животных опытной группы. Возможно, это было связано с синтезом клетками печени ферментов в ответ на введение лектина ЛII в организм мышей.

При анализе гистопрепаратов долек семенников животных опытной группы, в извитых семенных канальцах была отмечена активизация сперматогенеза, наблюдалось усиленное размножение сперматогенных клеток внутренней части стенок извитых канальцев. Во многих семенных канальцах оформляющиеся сперматозоиды полностью заполняли их просветы. При этом в семенных канальцах животных опытной группы формирующиеся спермии обнаруживались в бьльшем количестве, чем у контрольных животных. Таким образом, можно говорить о стимулирующем действии препарата лектина ЛII на сперматогенез у самцов мышей.

На гистопрепаратах тканей головного мозга наблюдали четкую структуру всех клеточных элементов, особенно клеток мозжечка. Также на гистопрепарате мозжечка животных опытной группы четче, чем в контрольной группе можно было выявить клетки Пуркинье и зернистый слой мозжечка. В глии мозга мышей опытной группы выявлена пролиферация ее клеток, что указывает на активизацию функций тканей головного мозга под действием лектина ЛII.

Таким образом, в результате проведенных исследований было доказано, что лектин бацилл ЛII не оказывал негативного влияния на морфо-функциональное состояние внутренних органов мышей, активизируя работу некоторых из них. Нами было сделано предположение, что это может быть также следствием воздействия данного лектина на какие-либо биохимические процессы в организме животных, что и явилось предпосылкой для проведения дальнейших исследований в этой области.

Изучение влияния лектина бацилл ЛII на некоторые биохимические параметры крови крыс при стрессировании плаванием

Ранее в работах Н.Н. Неверовой (2008) было показано, что предварительное введение лектина ЛII P.polymyxa 1460 крысам вызывало нормализацию активности фермента глутатион-S-трансферазы в крови животных при холодовом и этаноловом стрессах; оказывало влияние на азотистый обмен, нормализуя содержание мочевины при этаноловом стрессе и содержание церулоплазмина в сыворотке крови, нарушение которого было вызвано влиянием таких стрессовых факторов как холод и этанол, но не оказывало влияния на уровень холестерина, нарушение которого связано с действием холодового стресса. Исходя из всего сказанного, представляло интерес продолжить изучение влияния данного лектина на некоторые биохимические параметры крови животных в условиях другого классического вида стресса ? принудительного плавания.

В результате проведенных исследований было обнаружено, что время плавания крыс с предварительно введенным лектином бацилл в дозе 2 мкг/животное оказалось в два раза больше, чем время плавания контрольных животных, и составило 83 мин (табл. 1).

Таблица 1 ? Влияние лектина ЛЙЙ на время плавания крыс

Характер воздействия	Время плавания, мин
	(М ± m)
Плавание	45,01 ± 1,38
Лектин ЛII + плавание	83,35 ± 1,18*

Примечание: * ? р < 0,05 относительно значений группы животных после плавания.

Мы предположили, что увеличение времени плавания могло быть связано с активацией лектином ЛII каких-либо процессов метаболизма в организме опытных животных. Поэтому следующим этапом исследований явилось определение активности некоторых ферментов (GST, АЛТ, АСТ), а также содержания ЦП, холестерина, мочевины и глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных.

Было показано, что введение экспериментальным животным лектина ЛII само по себе снижало активность GST на 25% (табл. 2). Снижение активности глутатион-S-трансферазы при введении лектина ЛII крысам свидетельствовало о нетоксичности лектина, поскольку GST является в первую очередь детоксикационным ферментом. Можно предположить, что бактериальный лектин ЛII, попав в организм животного, специфически связывался с углеводными рецепторами на поверхности клеток, изменяя тем самым их проницаемость. А так как GST является внутриклеточным ферментом, его выход из клетки затруднялся, что приводило к снижению активности данного фермента в крови животных.

При этом стрессирование плаванием также достоверно снижало активность данного фермента в эритроцитах крови крыс на 58% - до 9,19 мкмоль/мин·л относительно показателей интактных животных, активность фермента в крови которых составила 19,90 мкмоль/мин·л (табл. 2).

Таблица 2 ? Влияние лектина ЛЙЙ на активность некоторых ферментов и содержание церулоплазмина в норме и при стрессе

Характер воздействия	Активность, мкмоль/мин·л	Коэф-т Де Ритиса	ЦП, мг/л
	GST,	АЛТ	АСТ
	(М ± m)
Интактные животные	19,90±0,63	1,73±0,02	1,99±0,02	1,15±0,01	595,905,02
Лектин ЛII	15,12±0,42*	0,82±0,02*	2,12±0,09	2,58±0,11*	469,8 5,87*
Плавание	9,19±1,70*є	2,39±0,13*	3,34±0,03*	1,38±0,01*	739,87±1,28*
Лектин ЛII + плавание	18,79±0,41Д	1,57±0,09Дє	1,23±0,06*Дє	0,78±0,04*Дє	727,71±5,23*є

Примечание:

* ? р < 0,05 относительно значений животных интактной группы;

^Д ? р < 0,05 относительно значений группы животных после плавания;

є ? р < 0,05 относительно значений животных с инъекцией лектина ЛII.

Можно предположить, что через 83 минуты принудительного плавания, большая часть детоксикационного фермента GST была потрачена организмом на борьбу против свободных радикалов, образующихся при стрессах и участвующих в перекисном окислении липидов и деструкции мембран клеток, и его концентрация в крови животных значительно снижалась.

При предварительном введении бактериального лектина ЛII в организм животных ферментативная активность GST повышалась относительно показателей животных в группе плавания на 48% (до 18,79 мкмоль/мин·л) и приближалась к норме, т.е. к значениям активности фермента животных интактной группы (19,90 мкмоль/мин·л).

Таким образом, приведенные экспериментальные данные, позволяют говорить о том, что лектин бацилл ЛЙЙ, вводимый в организм крыс перед действием данного стрессового фактора, оказывает нормализующее воздействие на активность GST в крови животных.

В ходе дальнейших экспериментов было показано, что введение крысам лектина ЛII без воздействия стрессора, вызывало понижение активности АЛТ в сыворотке крови животных на 50%. Возможно, в данном случае лектин ЛII также стабилизировал структуру мембран, изменяя ее проницаемость для фермента АЛТ, либо происходило ингибирование синтеза данного внутриклеточного фермента под действием лектина ЛII. При этом активность этого фермента повышалась на 40% при воздействии стрессового фактора в виде принудительного плавания и составляла 2,39 мкмоль/мин·л против 1,73 мкмоль/мин·л у интактных животных (табл. 2). Повышение активности АЛТ в сыворотке крови крыс при стрессе можно объяснить повреждением структуры мембран клеток под действием сильного стрессора на организм и выходом внутриклеточных ферментов в кровь.

Уровень активности АСТ в сыворотке крови животных с инъекцией лектина достоверно не повышался относительно контрольных значений. При стрессировании животных плаванием активность АСТ повышалась относительно исходных значений на 70% и составляла 3,34 мкмоль/мин·л против 1,99 мкмоль/мин·л у животных интактной группы. Наши данные согласуются с литературными источниками, из которых известно, что при различных стрессорных и патологических состояниях в организме животных изменяется способность клеток вырабатывать аминотрансферазы (Jung et al., 1985).

При введении крысам лектина ЛII до стрессирования, активность АЛТ в сыворотке крови животных снижалась на 40% относительно активности данного фермента у животных после плавания и была сопоставима со значениями активности в контрольной группе. Также наблюдалось снижение активности АСТ более чем в 2,5 раза относительно активности у животных, стрессированных плаванием без предварительного введения лектина.

Таким образом, можно говорить о нормализующем действии лектина ЛII на активность АЛТ и о снижении активности АСТ под влиянием лектина ЛII при стрессе.

Далее нами было рассмотрено влияние лектина ЛII и стресса на содержание церулоплазмина. Показано, что введение лектина ЛII в организм животных приводило к снижению концентрации данного фермента в сыворотке крови крыс на 20%, то есть был отмечен тот же эффект действия лектина ЛII как и в случае ранее исследованных внутриклеточных ферментов. Стрессирование плаванием вызывало увеличение содержания ЦП на 24%, концентрация фермента составила 739,87 мг/л против 595,90 мг/л у контрольных животных. Предварительное введение лектина ЛII не приводило к снижению содержания ЦП в сыворотке крови крыс при стрессе. Повышенная концентрация церулоплазмина в крови при стрессе может рассматриваться в данном случае как компенсаторная реакция организма, направленная на стабилизацию клеточных мембран или ферментативное окисление биогенных аминов и других медиаторов, образующихся при стрессе (Курочкин, Воробьева, 2006).

В ходе дальнейших экспериментов было обнаружено, что введение лектина в организм животных не повлияло на концентрацию мочевины, холестерина и глюкозы в сыворотке крови крыс (табл. 3).

При изучении некоторых показателей азотистого и липидного обменов при стрессе, было обнаружено, что содержание мочевины в сыворотке крови животных достоверно увеличивалось в 2,5 (до 8,74 ммоль/л против 3,76 ммоль/л в контроле), а содержание холестерина - в 6 раз относительно контрольных значений (до 6,54 ммоль/л против 1,03 ммоль/л в контроле). Полученные нами данные подтверждаются литературными источниками, согласно которым уровень мочевины и холестерина повышается после сильных физических нагрузок и при стрессе (Ленкова, 1973).

Таблица 3 ? Влияние лектина ЛЙЙ на концентрацию мочевины, холестерина и глюкозы в сыворотке крови крыс в норме и при стрессе

Характер воздействия	Концентрация, ммоль/л
	Мочевина	Холестерин	Глюкоза
	(М ± m)
Интактные животные	3,76±0,19	1,03±0,13	7,18±0,65
Лектин ЛII	3,46 ± 0,31	1,42 ± 0,12	9,64±1,08
Плавание	8,74±0,21*	6,54±0,37*	18,22±1,55*
Лектин ЛII + плавание	7,65±0,30*Дє	6,35±0,31*є	18,24±2,15*є

Примечание:

* ? р < 0,05 относительно значений животных интактной группы;

^Д ? р < 0,05 относительно значений группы животных после плавания;

є ? р < 0,05 относительно значений животных с инъекцией лектина ЛII.

Предварительное введение лектина ЛII вызывало снижение уровня мочевины на 12% у животных после плавания относительно животных контрольной группы, в то время как содержание холестерина в сыворотке крови крыс оставалось повышенным.

Повышенная концентрация холестерина в сыворотке крови крыс может быть следствием увеличения активности синтеза общего холестерина печенью и повышенного расходования его на уплотнение клеточных мембран, проницаемость которых нарушается под действием продуктов перекисного окисления липидов во время стресса. Высокое содержание холестерина в крови также может быть связано с тем, что при стрессе возрастают потребности организма в глюкокортикоидах, которые являются важными, необходимыми для жизни гормонами, принимающими участие в регуляции обмена веществ и адаптации организма при неблагоприятных условиях.

При исследовании концентрации глюкозы в сыворотке крови животных опытной группы с инъекцией лектина ЛII показано, что количество данного углевода достоверно не отличалось от значений животных интактной группы, что согласуется с литературными данными (Гаврилова, Сметанина, Карпунина, 2001). Содержание глюкозы у животных группы плавания оказалось в 2,5 раза больше, чем у животных интактной группы (табл. 3). При этом предварительное введение лектина ЛII не повлияло на концентрацию глюкозы у животных после плавания, которая оставалась повышенной относительно контрольных значений.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что лектин ЛII способствует повышению выносливости животных в экстремальных условиях, вызванных в данном случае стрессом в виде плавания, регулирует метаболические процессы и приводит к норме некоторые важные биохимические параметры в организме крыс. Можно предположить, что бактериальный лектин действует как цитопротектор, стабилизируя и предохраняя мембраны клеток от повреждений при стрессорных воздействиях. Надо отметить, что наши данные согласуются с предыдущими исследованиями (Неверова и др., 2006; 2007), согласно которым лектин ЛII обладал сходным действием на некоторые биохимические параметры крови животных в условиях других видов стресса (холодовой, этаноловый, иммобилизационный), что говорит о широком спектре действия лектина в различных стресс-условиях.

Изучение влияния лектина ЛЙЙ на микрофлору толстого кишечника крыс в норме и при различных видах стресса

Ранее нами было показано, что интраперитонеальное введение лектина ЛII животным перед иммобилизационным и этаноловым стрессами способствовало нормализации, а при холодовом - увеличению количества молочнокислых бактерий в кишечнике животных (Неверова и др., 2007). В настоящей работе было исследовано непосредственное действие лектина ЛII на микрофлору толстого кишечника крыс при ректальном введении препарата.

В ходе проведенных экспериментов было установлено, что количество молочнокислых бактерий (стрептококков и лактобацилл) у животных контрольной группы (ректальное введение 200 мкл стерильной дистиллированной воды за сутки до забора проб) достоверно не отличалось от количества бактерий у животных интактной группы и составило 3,15·10⁵ КОЕ/г (табл. 4). Поэтому дальнейшие сравнения производили с показателями животных контрольной группы.

Через сутки после ректального введения крысам 200 мкл лектина ЛII (в концентрации 4 мкг/мл), количество молочнокислых бактерий в толстом кишечнике достоверно повышалось относительно значений у животных контрольной группы до 4,65·10⁵ КОЕ/г.

В группах животных после холодового и этанолового стресса, через сутки было отмечено уменьшение количества молочнокислых бактерий на 35% и 32% соответственно (табл. 4).

Возможно, в данном случае холодовой стресс приводил к замедлению общих процессов метаболизма в организме и к замедлению роста молочнокислых бактерий в толстом кишечнике крыс. Пероральное введение крысам этилового спирта могло привести к частичной стерилизации микрофлоры толстого кишечника, и, в частности, к снижению количества молочнокислых бактерий.

Таблица 4 ? Влияние лектина ЛЙЙ и действие различных видов стресса на молочнокислую микрофлору толстого кишечника крыс

Характер воздействия	Количество клеток · 105 КОЕ/г
	M±m
Интактная группа	3,90 ± 0,21
Контроль	3,15 ± 0,40
ЛЙЙ	4,65 ± 0,16*°
иммобилизационный стресс	0,60 ± 0,20*°
холодовой стресс	2,10 ± 0,12*°
этаноловый стресс	2,15 ± 0,10*
ЛЙЙ + иммобилизационный стресс	3,60 ± 0,10?
ЛЙЙ + холодовой стресс	3,00 ± 0,12*?
ЛЙЙ + этаноловый стресс	2,70 ± 0,21*?

Примечание:

* - P< 0,05 относительно интактной группы животных;

° - P< 0,05 относительно контрольной группы;

^Д - Р< 0,05 относительно лектина ЛII.

У крыс после иммобилизационного стресса через сутки также происходило снижение количества молочнокислых бактерий в толстом кишечнике на 80% относительно количества данных бактерий у животных контрольной группы. Наши данные согласуются с литературными, согласно которым различные виды стрессов приводили к уменьшению количества молочнокислой микрофлоры в кишечнике животных (Петровская, 1976; Лизько, 1983; Наумов, 1989).

Предварительное введение лектина ЛII P.polymyxa 1460 в организм животных при всех видах стресса способствовало нормализации количества молочнокислых бактерий до значений у животных контрольной группы.

Также было отмечено, что количество энтеропатогенной кишечной палочки в толстом кишечнике животных контрольной группы достоверно не отличалось от количества данных бактерий у животных интактной группы и составляло 0,80·10⁵ КОЕ/г (табл. 5).

Ректальное введение животным лектина ЛII приводило к полному отсутствию роста кишечной палочки. У животных опытной группы после воздействия иммобилизационного стресса отмечалось сокращение количества кишечной палочки на 62%. Однако после холодового и этанолового стрессов, численность кишечной палочки в толстом кишечнике крыс увеличивалась в 2,5 и 2 раза соответственно.

Усиление роста кишечной палочки происходило, как можно предположить, за счет подавления данными видами стресса роста некоторых молочнокислых бактерий. Из литературных данных также известно, что при подавлении роста облигатной микрофлоры толстого кишечника происходит усиление роста факультативной микрофлоры (Коршунов и др., 1997).

Таблица 5 ? Влияние лектина ЛЙЙ и действие различных видов стресса на содержание кишечной палочки в толстом кишечнике крыс

Характер воздействия	Количество клеток · 105 КОЕ/г
	M±m
Интактная группа	1,05 ± 0,20
Контроль	0,80 ± 0,21
ЛЙЙ	0 *°
иммобилизационный стресс	0,30 ± 0,21*°
холодовой стресс	2,10 ± 0,14*°
этаноловый стресс	1,80 ± 0,12*°
ЛЙЙ + иммобилизационный стресс	0,90 ± 0,10?
ЛЙЙ + холодовой стресс	0,75 ± 0,10?
ЛЙЙ + этаноловый стресс	0,75 ± 0,22?

Примечание:

* - P< 0,05 относительно интактной группы животных;

° - P< 0,05 относительно контрольной группы;

^Д - Р< 0,05 относительно лектина ЛII.

Предварительное введение лектина ЛII в толстый кишечник крыс при всех стрессовых воздействиях способствовало нормализации количества кишечной палочки.

Введение бактериального лектина ЛII крысам также повлияло и на содержание стафилококков в толстом кишечнике, количество которых сократилось более чем на 60% относительно показателей у контрольных животных (табл. 6).

Таблица 6 - Влияние лектина ЛЙЙ и действие различных видов стресса на количество стафилококков в толстом кишечнике крыс

Характер воздействия	Количество клеток · 103 КОЕ/г
	M±m
Интактная группа	1,50 ± 0,24
Контроль	1,20 ± 0,20
ЛЙЙ	0,45 ± 0,12*°
иммобилизационный стресс	2,85 ± 0,22*°
холодовой стресс	0,45 ± 0,12*°
этаноловый стресс	0,75 ± 0,16*°
ЛЙЙ + иммобилизационный стресс	1,50 ± 0,21?
ЛЙЙ + холодовой стресс	1,20 ± 0,10?
ЛЙЙ + этаноловый стресс	1,35 ± 0,12?

Примечание:

* - P< 0,05 относительно интактной группы животных;

° - P< 0,05 относительно контрольной группы;

^Д - Р< 0,05 относительно лектина ЛII.

Как видно из данных таблицы, различные виды стресса также по-разному повлияли на количество бактерий. После иммобилизационного стресса количество стафилококков у животных опытной группы было в 2,4 раза больше, чем у животных контрольной группы. Иммобилизационный стресс является одним из самых сильных видов стресса для животного. Под его действием, как было показано ранее, происходило подавление роста некоторых молочнокислых бактерий и энтеробактерий. Возможно, за счет этого увеличивался рост условно-патогенной микрофлоры (стафилококков), которая оказалась более устойчивой к данному виду стресса.

Количество стафилококков в толстом кишечнике крыс после холодового и этанолового стрессов снизилось относительно контрольных значений на 62% и 37% соответственно. Предварительное введение лектина нормализовало рост стафилококков и их количество было сопоставимо со значениями у животных контрольной группы.

На основании полученных результатов можно говорить о том, что лектин ЛII P.polymyxa 1460 способен стимулировать рост ряда молочнокислых бактерий и подавлять рост энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике экспериментальных животных при негативных воздействиях, вызванных холодовым, этаноловым и иммобилизационным стрессами. Возможно, в данном случае лектин ЛII проявил не только бактерицидные, но и тканепротекторные свойства, стимулируя пролиферацию клеток слизистой кишечника и контролируя природу и плотность выделяемых поверхностных гликоконъюгатов, которые являются субстратом для молочнокислых бактерий.

Исследование бактерицидных, фунгицидных и ранозаживляющих свойств лектина ЛII и экзополисахаридных гелей с добавлением лектина

Следующим этапом наших исследований явилось определение бактерицидных, фунгицидных и ранозаживляющих свойств лектина ЛII и экзополисахаридных гелей с добавлением данного лектина.

Известно о бактерицидных свойствах лектина ЛII по отношению к некоторым почвенным бактериям (Карпунина и др., 2003). В процессе наших исследований оказалось, что лектин ЛII обладает бактерицидными и фунгицидными свойствами в отношении ряда условно-патогенных бактерий и грибов, которые, как известно из литературных источников (Шляпников, Рыбкин, 1999; Блатун, 2007), наиболее часто встречаются в ранах с первичным загрязнением. Было обнаружено, что лектин ЛII в концентрациях от 4·10^-4 до 4 мкг/мл подавлял рост всех взятых в опыт тест-культур (бактериальная взвесь 10⁶ кл/мл): E.coli 01, S.aureus 209-P, P.aeruginosa АТСС 27533 и C.albicans 130 (табл. 7).

Мы предположили, что подавление роста микроорганизмов могло осуществляться благодаря связыванию лектина со специфичными рецепторами клеточной стенки. В случае грамположительных бактерий таковыми, возможно, является глюкозамин, входящий в состав пептидогликана, основного компонента клеточной стенки; в случае грамотрицательных бактерий, возможно взаимодействие со специфичными рецепторами, находящимися непосредственно на внешней мембране бактериальной клетки.

Таблица 7 - Влияние лектина ЛII на рост некоторых микроорганизмов

Лектин ЛII, мкг/мл	Культуры бактерий
	E.coli 01	S.aureus 209-Р	P. aeruginosa АТСС 27533	C.albicans 130
4	+	+	+	+
0,4	+	+	+	+
0,04	+	+	+	+
0,004	+	+	+	+
0,0004	+	+	+	+

Примечание: (+) - подавление роста.

В результате исследований также было обнаружено, что гели, созданные на основе коммерческого ксантана, а также полимиксана (ПМ) 88А, лаксарана Z и ЭПС X.campestris В-610, никак не повлияли на рост и развитие тест-бактерий, а коммерческий ксантан подавлял рост только C.albicans 130 (табл. 8).

Таблица 8 - Влияние экзополисахаридов на рост некоторых микроорганизмов

Экзополисахариды	Культуры бактерий
	E.coli 01	S.aureus 209-Р	P.aeruginosa АТСС 27533	C.albicans 130
Ксантан	-	-	-	+
Полимиксан 88А	-	-	-	-
КМОЭЦ	+	+	+	+
ЭПС X.campestris B-610	-	-	-	-
Лаксаран 1596	+	+	+	+
Лаксаран Z	-	-	-	-
Лаксаран 1936	+	+	+	+

Примечание: (+) - подавление роста, (-) - отсутствие подавления роста.

Гели, созданные на основе КМОЭЦ, лаксарана 1596 и 1936 подавляли рост всех взятых в опыт культур.

При добавлении в состав гелей лектина ЛII (4 мкг/мл), бактерицидными и фунгицидными свойства по отношению к тест-культурам обладали все гели, за исключением гелей, приготовленных на основе ксантана и ЭПС X.campestris В-610 (табл. 9).

Возможно лектин бацилл ЛII, в случае с гелями, приготовленными на основе ПМ 88А и лаксарана Z, и явился тем компонентом, который определял бактерицидные свойства этих гелей, а в случае же ксантана и ЭПС X.campestris В-610 лектин был заблокирован специфичными к нему углеводами, поскольку, как известно, в состав ксантана наряду с глюкозой и маннозой входит и глюкуроновая кислота (Southwick et al., 1980), являющаяся специфичным углеводом для лектина ЛII.

Таблица 9 - Влияние экзополисахаридных гелей с добавлением лектина ЛII на рост некоторых микроорганизмов

Экзополисахариды + ЛII	Культуры бактерий
	E.coli 01	S.aureus 209-Р	P.aeruginosa АТСС 27533	C.albicans 130
Ксантан + ЛII	-	-	-	-
Полимиксан 88А + ЛII	+	+	+	+
КМОЭЦ + ЛII	+	+	+	+
ЭПС X.campestris B-610 + ЛII	-	-	-	-
Лаксаран 1596 + ЛII	+	+	+	+
Лаксаран Z + ЛII	+	+	+	+
Лаксаран 1936 + ЛII	+	+	+	+

Примечание: (+) - подавление роста, (-) - отсутствие подавления роста.

В ходе дальнейшего эксперимента были исследованы ранозаживляющие свойства лектина ЛII и гелей, приготовленных на основе бактериальных ЭПС с добавлением лектина. У животных контрольной группы в течение первых суток после нанесения ран отмечали небольшое увеличение тканевого дефекта, который был наполнен сгустком крови. Вокруг зоны повреждения было выявлено нарушение микроциркуляции (гиперемия и резкий отек) и небольшая воспалительная реакция. На третьи сутки опыта эпидермис по краям раны под струпом начинал загибаться, плотно прилегая к стенке раневого канала. При этом края ранения оставались широкими по сравнению с первым днем эксперимента. К шестым суткам эпидермис не полностью перекрывал раневую щель, заполненную молодой грануляционной тканью, т.е. отмечалось частичное заживление раны с помощью рубца. По истечении семи дней эксперимента рубец на кожи животных был четко виден.

При нанесении на поверхность ранения животных геля с добавлением лаксарана 1936 процесс заживления ранения заметно не ускорялся. При добавлении в гель данного ЭПС лектина ЛII, образование корочки и в дальнейшем рубца происходило быстрее (на сутки). Сходные результаты были отмечены нами и в отношении гелей (с добавлением лектина ЛII), приготовленных на основе лаксарана Z, лаксарана 1596 и ПМ 88А. При этом во многих случаях рубец становился незаметным уже на 6 сутки эксперимента.

При добавлении лектина в состав гелей, приготовленных на основе ЭПС X.campestris В-610, коммерческих экзополисахаридов КМОЭЦ и ксантана, процесс заживления ранений ускорялся незначительно относительно контроля и гелей без лектина ЛII.

Анализ и обобщение представленных результатов позволяют считать, что добавление лектина ЛII в состав гелей на основе лаксарана 1936, лаксарана Z, лаксарана 1596 и ПМ 88А стимулирует и ускоряет процесс регенерации эпителия крыс. Возможно, это объясняется тем, что лектин обладает высокой бактерицидной и фунгицидной активностью относительно ряда микроорганизмов, которые могут присутствовать в загрязненных ранениях.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов были получены новые данные о биологической активности лектина ЛII P.polymyxa 1460 in vitro и in vivo, которые открывают перспективы возможного применения этого биологически активного вещества в медико-биологических исследованиях и ветеринарной практике.

Выводы

1. Установлено, что лектин ЛII P.polymyxa 1460 не является токсичным в концентрациях от 410^-4 до 4 мкг/мл по данным исследований на инфузориях C.steinii и белых лабораторных мышах. Лектин бацилл ЛII не оказывает негативного влияния на морфо-функциональное состояние внутренних органов мышей, стимулируя работу некоторых из них.

2. Обнаружено, что лектин ЛII при предварительном интраперитонеальном введении в дозе 2 мкг/животное способен регулировать метаболизм животных в условиях патологических нарушений в организме, вызванных стрессированием плаванием, приводя активность глутатион-S-трансферазы, аланинаминотрансферазы к норме и достоверно снижая активность аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови крыс при стрессировании плаванием; лектин ЛII повышает выносливость животных при стрессе, увеличивая время принудительного плавания в два раза.

3. Показано, что введение лектина ЛII P.polymyxa 1460 в дозе 2 мкг/животное снижает повышенное содержание мочевины, но не влияет на концентрацию холестерина и глюкозы в сыворотке крови экспериментальных животных при стрессировании плаванием.

4. Выявлено влияние лектина ЛII P.polymyxa 1460 на микрофлору толстого кишечника белых крыс в норме и при стрессах (иммобилизационный, холодовой и этаноловый). Обнаружено положительное влияние лектина на рост некоторых представителей молочнокислой микрофлоры и на снижение присутствия энтеропатогенной кишечной палочки и стафилококков в толстом кишечнике.

5. Показано, что лектин ЛII в различных концентрациях и в составе полисахаридных гелей в концентрации 4 мкг/мл проявляет бактерицидные и фунгицидные свойства по отношению к некоторым микроорганизмам in vitro, а также способствует ускорению заживления резаных ранений экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кикалова, Т.П. Исследование влияния лектина бацилл на некоторые органы мышей / Т.П. Кикалова, Н.Н. Неверова, Г.П. Демкин, Л.В. Карпунина // Вавиловские чтения - 2007: Мат. конф., посвящ. 120-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26-30 ноября, 2007. - Саратов, 2007. - С. 305.

2. Кикалова, Т.П. Лектин бацилл и его действие в условиях стресса / Т.П. Кикалова, Н.Н. Неверова, М.Д. Сметанина, Л.В. Карпунина // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: IV-я Межрегиональная конференция молодых ученых, 14-16 октября 2008. - Саратов, 2008. - С. 68.

3. Кикалова, Т.П. Влияние лектина бацилл на белковый и липидный обмен у самцов крыс при стрессе / Т.П. Кикалова, М.Д. Сметанина, Л.В. Карпунина // Фундаментальные исследования. - 2008. - № 11. - С. 63-64.

4. Кикалова, Т.П. Изучение бактерицидных свойств экзополисахаридных гелей с добавлением лектина бацилл / Т.П. Кикалова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина // Фундаментальные исследования. - 2008. - № 12. - С. 41-42.

5. Кикалова, Т.П. Влияние лектина Paenibacillus polymyxa на морфо-функциональное состояние органов животных / Т.П. Кикалова, Н.Н. Неверова, Г.П. Демкин, Л.В. Карпунина // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2009. - № 2. - С. 18-22.

6. Кикалова, Т.П. Биопроба лектина бацилл на мышах и инфузориях Colpodа / Т.П. Кикалова, Л.В. Карпунина // Успехи современного естествознания. - 2009. - № 4. - С. 57

...