Экзополисахариды ксантомонад и клебсиелл: физико-химические, биологические свойства и перспективы применения

Автореферат диссертации разослан _____ ноября 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов,

Театральная пл., ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Полисахариды являются важнейшими компонентами клеток микроорганизмов. Многие физиологические, биохимические и иммунохимические особенности полисахаридов определяются их распределением в клетке: наружная и цитоплазматическая мембрана, цитоплазма, выделение в виде внеклеточных слизей в окружающую среду (экзополисахариды) (Захарова, 1982; Мальцева, 1981; Sutherland, 1979; Гринберг, 1992). Экзополисахариды (ЭПС) выполняют ряд важных биологических функций: защитную, резервную и др. В настоящее время экзополисахариды широко применяются во многих отраслях промышленности, благодаря своим уникальным свойствам - загущения, студнеобразования, эмульгирования, влагоудержания и стабилизации. В нашей стране в основном применяются полисахариды растительного происхождения - крахмал, пектин, агар. Индустриальные потребности в биополимерах данного класса все более возрастают. Полисахариды, полученные из микроорганизмов, обладают рядом преимуществ (климатическая независимость, простота и экономичность производства, регулирование свойств) и занимают все более лидирующие позиции. Поэтому во многих развитых странах производству полисахаридов микробного происхождения, а среди них и бактериальным, уделяют большое внимание. При получении ЭПС используют разные способы, как традиционные, так и принципиально новые. Сфера применения полисахаридов определяется с учетом их свойств, как функциональных - способность растворяться в воде, создавать высоковязкие растворы, студни, гели, так и биологических. В настоящее время получение и применение бактериальных полисахаридов очень развито за рубежом, выпускаются такие полисахариды как ксантан, геллан, курдлан и другие.

В нашей стране разные отрасли индустрии нуждаются в полисахаридах и их в большом количестве закупают в таких странах, как Великобритания, США, Франция и Китай. В силу этого изучение экзополисахаридов бактериального происхождения и разработка их получения имеет важное научное и практическое значение.

Цель работы - выделение ЭПС Xanthomonas campestris и Кlebsiella pneumoniaе, изучение их физико-химических и биологических свойств.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования (состав питательной среды, температура, время культивирования) для повышения продукции ЭПС X. campestris В - 610, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae K - 2 в лабораторных условиях.

2. Получить варианты X. campestris В - 610 с повышенной продукцией экзополисахаридов.

3. Выделить и очистить экзополисахариды X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 и К. pneumoniae K - 2 из культуральной жидкости.

4. Определить молекулярную массу, моносахаридный состав и вязкость раст-воров полученных экзополисахаридов X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В- 610/11, В - 610/16, В - 610/23 и К. pneumoniae K - 2.

5. Исследовать острую токсичность ЭПС ксантомонад и клебсиелл методом биопроб на инфузориях и лабораторных животных (мыши, крысы, кролики).

6. Изучить влияние ЭПС ксантомонад на качество хлебобулочных изделий и возможность создания пищевых пленочных покрытий на их основе.

Научная новизна

Впервые получены варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/1,

В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23, продуцирующие в 3 - 3,5 раза больше экзополисахаридов, чем исходный штамм, изучены их молекулярная масса, моносахаридный состав и вязкость растворов.

Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris В - 610 и его вариантов, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae K - 2 для продуцирования ими максимального количества экзополисахаридов (время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 єС, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода - сахароза).

На биотест - объектах (инфузории, лабораторные животные) показано отсутствие токсичности ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 и слабая токсичность ЭПС К. pneumoniae K - 2 в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных.

Установлено, что добавление ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения данного биополимера в качестве основы для пищевых пленочных покрытий.

Практическая значимость работы

Способность нетоксичных ЭПС ксантомонад улучшать органолептические и физико-химические показатели хлебобулочных изделий и создавать пищевые пленочные покрытия открывает перспективы их дальнейшего изучения для использования в пищевой промышленности.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Е.В. Полукаровым, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобреные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Полученные варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23 с повышенной продукцией ЭПС и ЭПС К. pneumoniae K - 2 имеют молекулярные массы в пределах 1?106 - 10?106 Да, вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа·с и 150 мПа·с соответственно. ЭПС ксантомонад содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту, а ЭПС клебсиелл -маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты, следы фукозы, арабинозы.

2. Оптимальными условиями культивирования ксантомонад и клебсиелл для бульшей продукции ЭПС являются: время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 єС, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, среда с сахарозой.

3. ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных, а ЭПС К. pneumoniae K - 2 - слаботоксичен в тех же концентрациях.

4. Введение ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия улучшают органолептические и физико-химические показатели выпеченных изделий. ЭПС X. campestris В - 610/1 могут являться основой для пищевых пленочных покрытий.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: международной научной конференции «Пути повышения качества услуг общественного питания» (Саратов, Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова, 2005); научно-практических конференциях профессорско-реподавательского состава и аспирантов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова (Саратов, 2005; 2006; 2007); международных научно-практических конференциях «Вавиловские чтения - 2005, 2006, 2007» (Саратов, 2005; 2006; 2007); 10-й международной Пущинской школе - конференции молодых ученых (Пущино, 2006); всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных» (Саратов, 2007); 4 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2007); X международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); 5 Московском международном конгрессе «Биотехнология: перспективы, состояние, развитие» (Москва, 2009); конкурсе научных проектов молодых ученых Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова “Инновационная наука - молодой взгляд в будущее” (Саратов, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 151 странице, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Список использованных литературных источников включает 290 наименований, в том числе 153 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект, материалы и методы исследований

В работе использовали культуры: Xanthomonas campestris В - 610 и

В - 611, полученные из коллекции культур микроорганизмов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН и Klebsiella pneumoniae K - 2, полученная из коллекции микроорганизмов Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского.

Ксантомонады и клебсиеллы для продуцирования ЭПС выращивали на жидких и твердых питательных средах (Берджи, 1997): среда 1 - глюкоза или сахароза - 10 г, дрожжевой экстракт - 2 г, углекислый кальций - 3 г, агар - 20 г, дистиллированная вода - 1000 мл; среда 2 - триптон - 5 г, хлорид натрия - 5 г, дрожжевой экстракт - 2,5 г, агар - 20 г, дистиллированная вода - 1000 мл, при встряхивании на шуттель - аппарате в течение трех суток при 200 об/мин и температуре 27 °С.

Для получения вариантов ксантомонад - продуцентов ЭПС 1 мл бактериальной взвеси X. сampestris В - 610 в концентрации 5·106 кл/мл подвергли облучению в высокочастотном электромагнитном поле (Samsung CE101KR, Корея) с экспозицией от 1 до 14 с при постоянном увеличении мощности от 90 до 900 Вт для каждого изменения параметра времени (Глухова, 1988; Оганесян, 1985). Морфологию бактерий изучали, используя микроскопию и окрашивание по методу Грама (Розанов, 1952). Наличие капсул определяли по методам Ольта, Михина, Гисса (Розанов, 1952).

Выделение ЭПС проводили по методу (Захарова, 1982; Глухова, 1988) в нашей модификации. Количество полисахаридов в культуральной жидкости определяли с помощью фенол-серного метода (Dubois et al., 1956). Содержание белка определяли по методу М. Brаdford (1976). Динамическую вязкость 1 % растворов экзополисахаридов определяли на ротационном вискозиметре Themo Haake Viskoteter R-7 (Нидерланды). Относительную вязкость - при помощи капиллярного вискозиметра Оствальда (Мет. указания…, 1995). Молекулярную массу выделенных экзополисахаридов определяли методом гель-хроматографии, используя гелевый носитель TSK 6000 G PWXL (Япония). ЭПС детектировали на автоматическом анализаторе 2690 Alliance Waters. Аналитическую колонку калибровали декстранами («Fluka», Швейцария) и коммерческим ксантаном (Родижель, Франция). Определение рН 1 % растворов экзополисахаридов проводили на рН-метре Mettler TOLEDO (Щвейцария). Химическую природу ЭПС определили методом ионообменной хроматографии, используя анионообменный носитель DEAE - C Toyopearl 650 M (Захарова, 1982). Определение моносахаридного состава экзополисахаридов проводили методом тонкослойной хроматографии (Захарова, 1982) и с помощью жидкостного хроматографического углеводного анализатора№, используя колонку Carbopac PA (Dionex, США), хроматограф SMART LINE 5000 (KNAUER, Германия) и детектор DECADE II Anthec Leyden (Нидерланды). Анализ проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя колонки (Dionex, США). Проверку ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 на идентичность ксантану проводили по методу (European pharmacopoeia, 2004).

Токсичность ЭПС определяли согласно методам (Гос. фармокопея…, 1989; Мет. указания..., 2003; ГОСТ 13496.7 - 97) на инфузориях, полученных из Пензенской областной ветеринарной лаборатории и лабораторных животных: белых мышах, крысах и кроликах. Проведение эксперимента и подготовку ЭПС ксантомонад и клебсиелл проводили в соответствии с «Правилами производства и контроля качества лекарственных средств» (ГОСТ Р 52249 - 2004). Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 18.03.1986 г.). Лабораторных животных содержали по общепринятым методикам (Башенина, 1975) и выдерживали карантин - 21 день. Вскрытие и патоморфологическую диагностику внутренних органов и тканей проводили согласно общепринятым методам (Меркулова, 1956; Карпуть, 1986; Мет. указания...,1999). Гистологические исследования проводили по методу Г.А. Меркулова (1956) и окрашивали гемотоксилином и эозином.

Количество и качество клейковины в муке определяли с помощью способа, рекомендованного ГОСТ 27839 - 88. Отбор проб для органолептических показателей и физико - химических исследований проводили по ГОСТ 5667 - 65. Влажность готовых булочных изделий определяли по ГОСТ 21094 - 95. Кислотность измеряли по ГОСТ 5670 - 96. Пористость измеряли с помощью пробника Журавлева по ГОСТ 5669 - 96. Пленочные покрытия создавали по методам (Пассаглиа, 1967; Бухарова, 2004).

Результаты экспериментов обрабатывали методами статистики с оценкой достоверности по критерию Стьюдента-Фишера (Боресков, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор штамма и оптимальных условий культивирования X. campestris для продуцирования экзополисахаридов

При выращивании X. campestris В - 610 и В - 611 на среде 1, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или сахарозу, при встряхивании на шуттель-аппарате при 130 об/мин, количество ЭПС X. campestris В - 610 превышало продукцию ЭПС X. campestris В-611 в 2,7 и 2,1 раза соответственно. В связи с этим в дальнейшей работе для выделения ЭПС был использован штамм Х. campestris В - 610, а в качестве источника углерода для выращивания бактерий была взята сахароза (табл. 1).

Таблица 1 - Продукция экзополисахаридов X. сampestris

Выделение ЭПС ксантомонад проводили по методу (Захарова, 1982; Глухова, 1988) в нашей модификации. Для этого культуральную жидкость, полученную после выращивания бактерий в течение 3 суток, разбавляли дистиллированной водой в 3 раза, интенсивно перемешивали при нагревании до 50 °С в течение 1 часа для смыва ЭПС с клеток. Затем центрифугировали при 2000 g в течение 20 минут для удаления клеток и надосадочную жидкость концентрировали методом упаривания при 50 - 60 °С до 1/2 объема от первоначального. ЭПС осаждали из раствора тремя объемами этанола, сушили при температуре 25 - 30 °С и измельчали на мельнице до частиц не более 0,5 мм. Полученные после выделения ЭПС ксантомонад представляли собой порошки белого цвета. Все порошки не имели запаха, не содержали белок и клеток продуцента. Растворы очищенных ЭПС были бесцветны.

На процесс выхода ЭПС существенное влияние оказывало и встряхивание культуральной жидкости X. сampestris В - 610 на шуттель-аппарате. При встряхивании при 200 об/мин продукция ЭПС X. campestris В - 610 повышалась с 2,70 до 5,99 г/л. Дальнейшее культивирование ксантомонад проводили при перемешивании 200 об/мин.

Как видно из кривой роста X. сampestris В - 610 (рис. 1), продукция ЭПС достигала максимума к 32 ч и практически не изменялась до 66 ч.

Рис. 1. Кривая роста (-425 нм) и продукции ЭПС ( 490 нм) X. campestris В-610

Получение вариантов X. сampestris В-610 с высокой продукцией ЭПС

С помощью облучения в высокочастотном электромагнитном поле при разных режимах воздействия на клетки X. сampestris В - 610 - 1, 3, 5 с и 90 - 180 Вт, были получены варианты, продуцирующие ЭПС различной вязкости и условно обозначенные как: X.campestris В - 610/1 (3 с, 90 Вт), В - 610/4 (1 с, 180 Вт), В - 610/11 (5 с, 720 Вт), В - 610/16 (9 с, 720 Вт), В -610/23 (двукратное облучение при 9 с, 720 Вт). Отбор клеток проводили визуально по признаку изменения морфологии колоний и их повышенной ослизненности.

Культуру X. campestris В - 610 и полученные варианты X. сampestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 далее выращивали при разных температурных режимах: 1 - двое суток при 27 єС; 2 - одни сутки при 27 єС и сутки при 5 єС; 3 - одни сутки при 5 єС и сутки при 27 єС. При этом было замечено, что рост и слизистость колоний были лучшими у исходной культуры при первом режиме выращивания, а для вариантов X. campestris В - 610/1, В-610/4, В- 610/11, В - 610/16 и

В - 610/23 - при третьем. Количество ЭПС, как видно из таблицы 2, у X. campestris

В - 610 составило 5,8 г/л, а для вариантов ксантомонад в пределах 8,96 - 9,40 г/л. Выделенные ЭПС X. сampestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16 и В - 610/23 были условно нами названы ксантомонанами 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23.

Таблица 2 - Влияние температуры на продукцию ЭПС ксантомонад

Примечание: 1 - двое суток при 27 єС; 2 - одни сутки при 27 єС и сутки при 5 єС; 3 - одни сутки при 5 єС и сутки при 27 єС.

Подбор оптимальных условий выращивания Кlebsiella pneumoniae K - 2 для продуцирования экзополисахаридов

Для определения оптимальной температуры биосинтеза ЭПС культуру K. pneumoniae K - 2 выращивали на твердой питательной среде 2 при различных температурах: 25 °С, 27 °С, 36 °С. Было замечено, что при температуре 27 °С на чашках Петри вырастали более слизистые колонии, чем при температурах 25 ° и 36 °С. Известно, что повышение скорости перемешивания оказывает существенное влияние на продукцию ЭПС бактерий. Экспериментально было установлено, что при выращивании клебсиелл на среде 2 при скорости перемешивания культуральной жидкости 150 и 200 об/мин на шуттель-аппарате продукция ЭПС на среде с глюкозой составила 1,8 и 3,1 г/л; на среде с сахарозой - 2,2 и 3,8 г/л соответственно. В дальнейшем для получения ЭПС K. pneumoniae K - 2 использовали скорость перемешивания 200 об/мин. Выделение ЭПС клебсиелл проводили по методу выделения ксантомонад, как было описано нами выше. ЭПС K. pneumoniae K - 2 был назван нами клебсилан. Продукцию клебсилана сравнивали, выращивая бактерии на среде 2 и среде 1, подобранную нами для получения ЭПС ксантомонад, как было описано выше. Как видно из таблицы 3, при выращивании клебсиелл на среде 2, как с сахарозой, так и глюкозой в разных концентрациях, продукция ЭПС была значительно меньше в 2,7 - 4, 4 раза, чем на среде 1.

Таблица 3 - Влияние состава среды на продукцию клебсилана

Как видно из кривой роста (рис. 2), максимальная продукция клебсилана на среде 1 приходится на 44 - 50 ч.

Рис. 2. Кривая роста (- 425 нм) и продукции ЭПС ( 490 нм) К. pneumoniae К - 2

Определение химической природы ЭПС ксантомонад и клебсиелл

Определение химической природы ЭПС X. campestris В - 610 и его вариантов: ксантомонанов 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23 и клебсилана проводили методом ионообменной хроматографии. Как видно из рисунка 3, ЭПС ксантомонад состоят из разных фракций: X. campestris В - 610 - из 1 нейтральной и 1 кислой фракций; ксантомонан 610/1 - 1 нейтральной; ксантомонан 610/4 - 2 нейтральных и 1 кислой; ксантомонан 610/11 - 1 нейтральной и 2 кислых; ксантомонан 610/16 - 1 кислой; ксантомонан 610/23 - 1 нейтральной и 1 кислой. Клебсилан представлен только 1 нейтральной фракцией.

Физико-химические свойства и моносахаридный состав экзополисахаридов ксантомонад и клебсиелл

Для определения молекулярной массы ЭПС изучаемых бактерий использовали гель-хроматографию 26 90 Alliance, Рhotogiode array Detector 996 и Waters Refractive Index Detector 2414. Было установлено, что молекулярная масса всех ЭПС ксантомонад и клебсиелл составила 1?106 - 10?106 Дa (рис. 4).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Динамическая вязкость 1 % растворов ЭПС X. campestris В - 610 и его вариантов: ксантомонана 610/1, 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23, определяемая с помощью ротационного вискозиметра, была различна и составляла 270, 160, 490, 480, 340 и 480 мПа·с соответственно. Значения рН растворов ЭПС всех исследованных бактерий были в пределах 7,4 - 7,53. Добавление хлорида калия в количестве 1 г на 100 мл 1% раствора ЭПС ксантомонад понижала их вязкость на 30 - 40 %, дальнейшее увеличение хлорида калия до 2 г уже не влияло на значение динамической вязкости. Растворы ЭПС К. pneumoniae K - 2 (1 %) обладали динамической вязкостью 150 мПа·с и значением рН 7,5.

Рис.8. Хроматограммы определения молекулярных масс ксантомонанов и клебсилана на колонке с TSK 6000G PWXL. Буфер 0,1 М NaNО3, 0,04 % NaN3. Скорость элюции 0,5 мл/мин

Примечание: а - время выхода декстрана М.м. 2·106 Да - 11,670 мин; б - декстрана М.м. 110 кДа - 13,115 мин; в - ксантана марки Родижель (Франция) М.м. 2·106 - 10·106 Да - 14,807 мин; г - клебсилана - 16,140 мин; д - ксантомонана 610/4 -15,125 мин; е - ксантомонана 610/1 - 14,390 мин; ж - ксантомонана 610/16 - 14,110 мин; з - ксантомонана 610/23 - 14,090 мин; и - ксантомонана 610/11 - 14,597 мин.

Определение моносахаридного состава ЭПС проводили методом тонкослойной хроматографии и с помощью жидкостного хроматографического углеводного анализатора (Dionex). Оказалось, что в состав всех ЭПС ксантомонад входят манноза, глюкоза и галактуроновая кислота (рис. 5), а ЭПС К. pneumoniae K - 2 (клебсилан) состоит из маннозы, глюкозы, галактозы, галактуроновой и глюкуроновой кислот и следы фукозы, арабинозы (рис. 6, 7, 8).

Рис. 5. Определение моносахаридного состава ЭПС ксантомонад методом тонкослойной хроматографии

Примечание: 1, 2, 9 - углеводы-свидетели, 3 - ЭПС X. сampestris В - 610, 4 - ксантомонан 610/1, 5 - ксантомонан 610/4; 6 - ксантомонан 610/11; 7 - ксантоманан В - 610/16, 8 - ксантомонан 610/23.

Рис. 6. Определение моносахаридного состава клебсилана методом тонкослойной хроматографии

Примечание: 1, 4 - углеводы - свидетели; 2, 3 - клебсилан.

Рис. 7. Хроматограмма выхода фукозы (1), арабинозы (2), галактозы (3), глюкозы (4), маннозы (5) на колонке Carbopac PA (Dionex, США). Буфер 20 mM NaOH. Скорость элюции 0,7 мл/мин

Рис. 8. Хроматограмма определения моносахаридного состава клебсилана

Примечание: 1 - фукоза; 2 - арабиноза; 3 - галактоза; 4 - глюкоза; 5 - манноза

Изучение биологических свойств ксантомонанов и клебсилана

определение токсичности ксантомонанов и клебсилана методом биопроб на инфузориях

экзополисахарид токсичность продуцирование ксантомонан

Определение токсичности ксантомонанов 610/1, 610/4, 610/11, 610/16, 610/23 и клебсилана проводили по стандартному ускоренному методу биопробой (ГОСТ 13496.7-97) на инфузории колподы (Colpoda steinii) и инфузории туфельки (Paramecium caudatum) (Метод. указания…, 2003). Метод основан на воздействии препаратов на культуру инфузорий и наблюдении за их подвижностью и жизнеспособностью. При добавлении к взвеси инфузорий 0,05 % водного раствора ксантомонана 610/1 через 30 с движение инфузорий замедлялось, они практически не двигались или вращались вокруг своей оси (возможно, это было связано с механическими трудностями из-за высокой вязкости раствора). Жизнеспособность инфузорий сохранялась. Сходное воздействие на инфузории оказали и препараты ксантомонанов 610/4, 610/11, 610/16 и 610/23 в этой же концентрации, однако движение инфузорий было еще более замедлено, так как растворы этих препаратов обладали еще бульшей вязкостью, чем ксантомонан 610/1. При введении препарата клебсилана к взвеси инфузорий через 30 с происходило нарушение координации их движения, они двигались хаотично, однако через 3 мин движение инфузорий приходило в норму и в дальнейшем поведение инфузорий не отличалось от описанного выше. В ходе исследований было нами отмечено, что инфузории не изменялись в размере, сохраняли свою форму и физиологические характеристики. Таким образом, так как гибели инфузорий по истечении 3 ч не происходило, и они сохраняли свою подвижность, все исследуемые ксантомонаны, согласно ГОСТ Р 13496.7 - 97, можно отнести к нетоксичным веществам, а клебсилан - к слаботоксичным.

Влияние ЭПС на организм лабораторных животных при пероральном введении и нанесении на кожу

Было изучено влияние ксантомонанов 610/1, 610/4 и клебсилана на организм лабораторных животных (мыши, крысы, кролики) согласно стандартам (Гос. фармакопея…, 1989; Метод. указания…, 2003; ГОСТ 13496.7 - 97) в дозировках 0,06 г и 3 г/1 кг массы тела. В опыте участвовало 40 белых мышей - самцов, 20 белых крыс - самцов, 24 кролика - самца. Животные были разбиты соответственно на 4 группы: 1 группа - контрольная, 2 группа получала клебсилан, 3 группа - ксантомонан 610/1 и 4 группа - ксантомонан 610/4. ЭПС разводили в физиологическом растворе и вводили натощак перорально через катетер мышам в количестве 1 мл в дозировке 3 г/1 кг массы тела; крысам - 2 мл в дозировке 0,06 г/1 кг массы тела; контрольной группе вводили физиологический раствор в том же количестве каждой группе животных соответственно. Кроликам однократно натощак давали препарат ЭПС, разведенный в воде в дозировке 0,06 г на 1кг живой массы (100 мл), а контрольной группе в том же количестве давали воду. Наблюдения за лабораторными мышами и крысами проводили в течение 3 суток, за кроликами 14 суток. По окончании периода наблюдений всех животных контрольной и опытных групп подвергли эвтаназии, проводили вскрытие и оценку состояния внутренних органов, системы пищеварения. Гибели экспериментальных животных ни в одной группе отмечено не было. Были отмечены отклонения в поведении в группе животных, получивших клебсилан: повышенная жажда, беспокойство. Поведение других опытных животных не отличалось от поведения животных контрольной группы. У животных, получавших дозировку 0,06 г/1 кг массы тела ксантомонана 610/1 и 610/4, не было отмечено отклонений в функциональном состоянии организма, клинических симптомах, макроскопических и патологических изменений органов и тканей от состояния животных контрольной группы, что позволяет сделать вывод о нетоксичности препарата. У животных, которым вводили клебсилан, отмечались изменения в состоянии внутренних органов (селезенка и почки были увеличены, в кишечнике наблюдали скопление газов), что позволяет отнести данный препарат к слаботоксичным. Гистоморфологическая картина внутренних органов животных, получавших ксантомонаны, сохранена; каких-либо изменений в структуре исследуемых органов не наблюдалось. Гистоморфологическая картина внутренних органов животных, получавших клебсилан, была несколько изменена, наблюдалась десквамация эпителия слоистых органов, а также нарушения в паренхимных органах.

При изучении кожно-раздражающего действия исследуемые вещества: ксантомонаны 610/1, 610/4 и клебсилан в виде мази на глицериновой основе наносили на депилированный участок кожи кроликов, в качестве контроля - чистый глицерин. Наблюдения за состоянием кожи кроликов проводили в течение 36 дней. Было отмечено, что мази на основе ксантомонанов 610/1 и 610/4 в их составе не вызывали покраснения кожи и не затормаживали рост волос по сравнению с контролем. Рост волос у кроликов на участке кожи с ксантомонаном 610/1 был отмечен через 6 дней, с ксантомонаном 610/4 - 8 дней. В то же время мазь с клебсиланом вызывала покраснение кожи, которое проходило через 2 часа, и замедление роста волос на 34 дня. Согласно ГОСТ 13496.7 - 97, токсичность исследуемых препаратов определяют по наличию воспалительного процесса на участке нанесения мази. Ксантомонаны 610/1 и 610/4 считаются нетоксичными из-за отсутствия воспалительных реакций, а клебсилан - слаботоксичным из-за их наличия.

Изучение влияния бактериальных экзополисахаридов на качество хлебобулочных изделий и создание пищевых пленочных покрытий на их основе

Известно, что добавление бактериальных полисахаридов в тесто в количестве 0,05 - 0,5 % к массе муки улучшает его физические характеристики: увеличивает водопоглотительную способность, повышает формоустойчивость, улучшает газоудерживающие свойства (Morris, 2005; Самохвалова, 1990; Бухарова, 2004). Проведены исследования по изучению влияния ксантомонанов 610/1 и 610/16 на качество хлебобулочных изделий на примере булочки «Октябренок». Ксантомонаны добавляли непос-редственно в муку в сухом виде в разных концентрациях 0,2; 0,3 и 0,45 % к массе муки. Для сравнения качества хлебобулочных изделий в опытные образцы наряду с ксантомонанами добавляли коммерческий ксантан Родижель (Франция) и хлебоулучшитель «Пышка» в количестве 0,3 % к массе муки.

Было отмечено, что консистенция теста образцов с добавлением «Пышки» была более плотная и жесткая, чем у булочек с ксантомонанами и ксантаном, у которых консистенция нежная, пористая структура ровная, без крупных разрывов. Добавление ксантомонана 610/1 и ксантана способствовало приданию более круглой формы всем выпеченным изделиям, а образцы с добавлением ксантомонана 610/16 имели неровную поверхность. Булочки с добавлением ксантомонанов и ксантана обладали более ярким, выраженным ароматом сдобы (особенно с добавлением ксантомонана 610/1), с «Пышкой» - аромат сдобы был не выражен. Булочки, с добавленными ЭПС при нажатии на них восстанавливались быстрее, чем образцы контрольные и с «Пышкой». При сравнении изделий разрез у булочек с ксантомонанами был ровный, в то время как, у булочек с ксантаном - шероховатый. При органолептической оценке отметили, что при добавлении к образцам ксантомонанов и ксантана на поверхности появлялся глянец, у остальных образцов этого не отмечалось. Установлено, что булочные изделия с добавленными ксантомонанами обладали лучшими физико-химическими показателями (пористость, объем, кислотность) по сравнению с контрольными образцами. Добавление ксантомонанов существенно не повлияло на влажность выпеченных изделий и не превышало установленную ГОСТом величину (не более 39 %). Было также замечено, что введение ксантомонана 610/1 в булочки из муки со слабой клейковиной улучшало структуру их пористости и состояние мякиша (сжимаемость), делая его более эластичным и упругим. На основании оценки органолептических и физико-химических показателей хлебобулочных изделий показано, что ксантомонан 610/1 в количестве 0,45 % к массе муки улучшает их качество.

Кроме того, экспериментально было показано, что ксантомонан 610/1 можно использовать и для изготовления пищевых пленочных покрытий. Было обнаружено, что пленки, созданные на основе этого ЭПС (0,05 %), имели эластичную, гладкую поверхность, легко и равномерно наносились на булочки «Октябренок» и были неотделимы от поверхности булочек. Результаты проведенных исследований показывают целесообразность изучения возможности применения ЭПС ксантомонад в пищевой промышленности.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования X. campestris В - 610, X. campestris В - 611 и К. pneumoniae K - 2 (время культивирования 44 - 50 ч, температура 27 єС, встряхивание на шуттель-аппарате при 200 об/мин, в качестве источника углерода - сахароза) для повышения продукции ЭПС.

2. Получены варианты X. campestris В - 610: X. campestris В - 610/1, В - 610/4, В - 610/11, В - 610/16, В - 610/23, производящие ЭПС в бульшем количестве, чем исходный штамм, отличающиеся по физико-химическим и биологическим свойствам.

3. Показано, что полученные ЭПС ксантомонад имеют молекулярные массы в пределах 1?106- 10?106 Да и вязкость растворов в пределах 160 - 490 мПа·с, содержат в составе глюкозу, маннозу, галактуроновую кислоту. ЭПС К. pneumoniae K - 2 имеют молекулярную массу 1•106 - 10•106 Да, вязкость растворов 150 мПа·с, содержат в составе маннозу, глюкозу, галактозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты и следы фукозы, арабинозы.

4. Установлено что ЭПС X. campestris В - 610/1, В - 610/4 не являются токсичными в концентрации 0,05 % для инфузорий и в дозировках 0,06 - 3 г/кг живой массы для лабораторных животных. ЭПС К. pneumoniae K - 2 слаботоксичен в тех же концентрациях.

5. Показано, что добавление ЭПС X. campestris В - 610/1 в хлебобулочные изделия способствует улучшению их качества. Впервые показана возможность применения ЭПС X. campestris В - 610/1 в качестве основы пищевых пленочных покрытий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бухарова, Е.Н. Использование микробного полисахарида ксантана в общественном питании / Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина // Актуальные проблемы современной науки: Тр. 1-го Международного форума (6-й Международной конференции) молодых ученых и студентов. Естественные науки. Химия. Нефтехимия. Химическая технология. Технология продуктов питания, 12 - 15 сентября 2005. - Самара, 2005. - Ч. 11. - С. 97-99.

2. Рысмухамбетова, Г.Е. Использование экзополисахарида микробной природы в диетическом питании / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Актуальные проблемы современной науки: Тр. 1-го Международного форума (6-й Международной конференции) молодых ученых и студентов. Естественные науки. Химия. Нефтехимия. Химическая технология. Технология продуктов питания, 12 - 15 cентября 2005. - Самара, 2005. - Ч. 11. - С. 114-116.

3. Рысмухамбетова, Г.Е. Выделение полисахарида из штаммов Xanthomonas cam- pestris/ Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Вавиловские чтения - 2005: Материалы конференции, 23 - 25 ноября 2005. - Саратов, 2005. - С. 88-90.

4. Рысмухамбетова, Г.Е. Исследование продукции экзополисахаридов Xanthomonas campestris / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Пути повышения качества услуг общественного питания: Тезисы докладов Международной научной конференции, 23 - 24 декабря 2005. - Саратов, 2005. - С. 78-80.

5. Рысмухамбетова, Г.Е. Влияние различных факторов на продукцию экзополисахаридов культурой Xanthomonas campestris / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Биология - наука XXI века: Тезисы 10-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, посвященная 50 - летию Пущинского научного центра РАН, 17 - 21 апреля 2006. - Пущино, 2006. - С. 392.

6. Рысмухамбетова, Г.Е. Получение полисахаридов из Кlebsiella pneumoniae / Г.Е. Рысмухамбетова, И.А. Штыркова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Вавиловские чтения - 2006: Материалы конференции, посвященной 119 - й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 4 - 8 декабря 2006. - Саратов, 2006. - С. 85-86.

7. Суркова, Н.А. Использование микробных полисахаридов в блюдах диетического питания / Н.А. Суркова, Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Технология и продукты здорового питания: Материалы конференции, 28 - 29 мая 2007. - Саратов: Научная книга, 2007 - С. 114-116.

8. Рысмухамбетова, Г.Е. Экзополисахариды бактериального происхождения / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных: Материалы всероссийской научно-практической конференции, 29 января - 2 февраля 2007. - Саратов, 2007. - С. 65-66.

9. Бухарова, Е.Н. Применение бактериальных экзополисахаридов при производстве продуктов питания / Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина // Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 4 междуна- родного конгресса, 12 - 16 марта 2007. - М., 2007 - С. 158.

10. Рысмухамбетова, Г.Е. Определение токсичности экзополисахаридов биопробой на инфузории колподы / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.Н. Бухарова, И.В. Суровцова, Л.В. Карпунина // Вавиловские чтения - 2007: Материалы конференции, посвященной 120 - й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26 - 30 ноября 2007. - Саратов, 2007. - С. 337.

11. Рысмухамбетова, Г.Е. Влияние бактериальных экзополисахаридов на качество булочных изделий / Г.Е. Рысмухамбетова, Е.В. Полукаров, Н.А. Невесенко, Н.С. Кораблева, Н.Р. Суровцева, Е.Н. Бухарова, Л.В. Карпунина // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы международной научно-практической конференции, 11 - 13 марта 2008. - М., 2008 - С.163.

12. Кораблева, Н.С. Применение микробных полисахаридов в питании / Н.С. Кораблева, Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина, О.А. Васюкович // Пищевые технологии и биотехнологии: Сборник тезисов докладов IX Международной конференции молодых ученых, 3 - 5 июня 2008. - Казань, 2008. - С. 291.

13. Кулешова, Ю.В Создание пищевых пленочных покрытий из полисахаридов микробного происхождения / Ю.В. Кулешова, О.Ю. Швецова, Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Н.А. Невесенко, Л.В. Карпунина // Пищевые технологии и биотехнологии: Сборник тезисов докладов IX Международной конференции молодых ученых, 3 - 5 июня 2008. - Казань, 2008. - С. 332.

14.* Рысмухамбетова, Г.Е. Выделение и очистка экзополисахаридов из ксантомонад / Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина, Е.Н. Бухарова, Д.А. Жемеричкин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2008. - № 4. - С. 42 - 45.

15. Кичемазова, Н.В. Изучение физико-химических и биологических свойств экзополисахарида Кlebsiella pneumoniae / Н.В. Кичемазова, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина // Материалы конференции по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов за 2008 год: Сборник научных статей, 6 - 10 апреля 2009. - Саратов, 2009. - С. 9-10.

16. Бухарова, Е.Н. Применение различных полисахаридов как улучшителей дрожжевого и заварного теста / Е.Н. Бухарова, Е.В. Полукаров, О.Ю. Швецова, А.Д. Москалева, Г.Е. Рысмухамбетова, Л.В. Карпунина // Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 5 международного конгресса, 16 - 20 марта 2009. - М., 2009. - С. 56.

17. Бухарова, Е.Н. Пищевые пленочные покрытия // Е.Н. Бухарова, Г.Е. Рысмухамбетова, Ю.В. Кулешова, И.А. Бухарова, А.В. Банникова, Л.В. Карпунина// Биотехнология: перспективы, состояние, развитие: Материалы 5 международного конгресса, 16 - 20 марта 2009. - М., 2009 - С. 55.

Размещено на Allbest.ru