Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab’)2-фрагментов

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Разработка биотехнологической схемы получения препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина на основе F(ab')2-фрагментов

ГЕНЕРАЛОВ С.В.

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель: кандидат медицинских наук Никифоров Алексей Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович, кандидат медицинских наук Храмов Михаил Владимирович

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита диссертации состоится 19 марта 2009 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г.Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Автореферат диссертации разослан «____»_________________2009 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов,

Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», учёному секретарю диссертационного совета.

Учёный секретарь диссертационного совета Л.В. Карпунина

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Бешенство, являясь летальной, острой зоонозной природно-очаговой инфекцией, представляет большую опасность для человека и, по оценке ВОЗ, по наносимому экономическому ущербу среди инфекционных болезней занимает пятое место. Заболеваемость бешенством регистрируется на территории большинства стран мира, где ежегодно свыше 10 миллионов человек получают различные повреждения от животных и более 4 миллионов человек -- специфическую антирабическую помощь. Бешенство до сих пор остается практически неизлечимым заболеванием, от него ежегодно погибает до 50 тысяч человек. В Российской Федерации социально-экономическое значение проблемы бешенства в последние годы неуклонно растет, в том числе вследствие формирования новых очагов инфекции. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Почти во всех регионах страны периодически отмечается активизация природных очагов бешенства, растет число случаев заболевания среди диких плотоядных животных, вовлекаются в эпизоотический процесс домашние и сельскохозяйственные животные. В период с 2000 по 2006 годы в 35 субъектах Российской Федерации было зарегистрировано 99 случаев гидрофобии среди людей (Хадарцев с соавт., 2006; Государственный доклад о санитарно-эпидемиологической обстановке…, 2007).

Оптимальным методом системной антирабической постэкспозиционной профилактики бешенства является комбинированное введение антирабической вакцины и антирабического иммуноглобулина (WHO Expert Consultation on Rabies…, 2004). Для пассивной иммунизации людей применяют гетерологичный или гомологичный иммуноглобулин. Отрицательной стороной всех гетерологичных препаратов антирабического иммуноглобулина является опасность развития аллергических осложнений. Согласно данным ВОЗ, у 1-2% пациентов при введении гетерологичного иммуноглобулина могут возникнуть побочные реакции (WHO Expert Consultation on Rabies…, 2004). При использовании гомологичного иммуноглобулина таких осложнений не возникает, но его себестоимость в несколько раз превышает таковую гетерологичного иммуноглобулина. Перспективным направлением является создание препаратов с менее выраженными реактогенными свойствами, но в то же время с доступной ценой.

Наиболее рациональным направлением совершенствования лошадиных иммуноглобулинов представляется разработка способов дополнительной очистки c помощью ферментативного гидролиза иммуноглобулина с последующим фракционированием на хроматографической колонке.ования, возможность быстрого механического удаления фермента из реакционной среды, отсутствие контаминации конечного пстрого у Настоящее исследование посвящено разработке нового препарата с улучшенными свойствами на основе антирабического иммуноглобулина.

Цель работы состояла в разработке оптимальной схемы получения препарата F(ab')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина с применением иммобилизованного пепсина.

Задачи исследования:

1. Выбрать оптимальный способ получения препарата иммобилизованного пепсина, стабильного в условиях ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

2. Охарактеризовать биохимические свойства иммобилизованного пепсина.

3. Разработать экспериментальную схему эффективного ферментативного гидролиза иммуноглобулина с помощью иммобилизованного пепсина.

4. Подобрать оптимальные условия для хроматографического фракционирования и концентрирования препарата F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина.

5. Охарактеризовать препарат F(ab')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина по соответствию физико-химических свойств нормативным документам, предъявляемым к антирабическому иммуноглобулину.

6. Исследовать протективные и реактогенные свойства препарата антирабического иммуноглобулина на основе F(ab')2-фрагментов в сравнении с коммерческим препаратом нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина на лабораторных животных.

Научная новизна

Получен антирабический препарат на основе F(ab')2-фрагментов, для осуществления этапа ферментативного гидролиза предложено использование иммобилизованного пепсина. Сконструированы стабильные биокатализаторы, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Показано, что реактогенные свойства препарата F(ab')2-фрагментов менее выражены, чем у нерасщепленного иммуноглобулина, при этом специфическая активность препаратов практически одинакова.

Практическая значимость работы

Разработана биотехнологическая схема получения препарата F(ab')2 фрагментов антирабического иммуноглобулина, предназначенного для постэкспозиционной профилактики гидрофобии у людей. Схема включает следующие этапы: иммобилизацию пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хроматографическое отделение F(ab')2-фрагментов от остатков Fc-части молекулы иммуноглобулина и нерасщепленного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующую фильтрацию. Показано, что для осуществления ферментативного гидролиза иммуноглобулина наиболее эффективно использовать пепсин, иммобилизованный на нерастворимых матрицах. В качестве матриц могут выступать AH-агароза, Dowex AG 1X8, природный силикат. Для очистки препарата подобраны условия хроматографического фракционирования на геле SP-Sepharose-XL. F(ab')2-фрагменты элюировали вторым пиком без примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина. Элюцию проводили 0,02 М ацетатным буфером (рН 5,5) на колонке размером 5,0 х 30 см со скоростью 4 мл/мин. Для концентрирования препарата подобраны условия лиофильного высушивания. Высушивание проводили в течение 48 часов, начальная температура материала составляла минус 40 °С, давление в камере -- 2-3 Па, температура испарителя -- минус 90 + 2°С. Полученный препарат на основе F(ab')2-фрагментов нетоксичен, его специфическая активность не уступает таковой нерасщеплённого иммуноглобулина, при этом реактогенные свойства менее выражены.

По результатам проведенных научных исследований разработаны методические рекомендации «Получение F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях». Методические рекомендации одобрены Учёным советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 2 от 17 апреля 2007 г.) и утверждены директором института 15.05.2007.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ иммобилизации пепсина на природном силикате с помощью растворимого карбодиимида является оптимальным для получения биокатализатора, предназначенного для ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина.

2. Разработанная схема с использованием ферментолиза гетерологичного антирабического иммуноглобулина при 37°С и рН 4,5+0,5 в течение 24 часов и хроматографического фракционирования на геле SP-Sepharose-XL позволяет получать антирабический препарат, представляющий собой монофракцию F(ab')2-фрагментов антител.

3. Препарат F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к коммерческому препарату гетерологичного антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности.

4. Уровень вируснейтрализующей активности экспериментальных образцов препарата F(ab')2-фрагментов равен таковому коммерческого препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

5. Препарат на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина не обладает анафилактогенными свойствами.

Работа выполнена в отделе профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб" в рамках темы НИР: «Разработка и внедрение в производство новых медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики возбудителей опасных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы» (шифр: 26205).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на: ежегодных научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2007 - 2008); Всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы» (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 2 статьи, одна в издании, рекомендованном «Перечнем ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 192 источников, из них зарубежных - 100. Объём диссертации составляет 144 страниц машинописного текста, включает 28 рисунков и 5 таблиц.

2. Собственные исследования и их обсуждение

Материалы и методы

Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизацию пепсина осуществляли следующими методами: адсорбцией на DEAE-целлюлозе (Chen et al., 1977), сополимеризацией фермента (Khan et al.. 1985), с осаждением гидроксидом титана (Райхер с соавт., 1992), ковалентным присоединением фермента к следующим носителям: природному силикату (Puvanakrishnan et al., 1984), ионообменным смолам Amberlite A26 и Dowex AG 1X8 (Sannier et al., 1993), DEAE-целлюлозе, аминогексилагарозе (Tomono et al., 1981).

Штаммы микроорганизмов. Штамм фиксированного вируса бешенства CVS был предоставлен ГИСК им. Л.А Тарасевича для постановки реакции нейтрализации.

Характеристика биофизических и иммунобиологических свойств препарата. Для определения активности пепсина применяли метод Н.П. Пятницкого (Кушманова, Ивченко, 1983). Для определения рН- и термостабильности иммобилизованного пепсина испытуемый образец инкубировали при соответствующих условиях в течение 18 часов без перемешивания, после чего исследовали активность образца.

Концентрацию белка определяли биуретовым методом (МУК 4.1/4.2.588-96). Оптическую плотность раствора определяли на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором. Контрольный раствор готовили из стандартного образца предприятия.

Для определения цветности и прозрачности измеряли оптическую плотность исследуемого раствора в кюветах с толщиной слоя 3 мм по сравнению с дистиллированной водой при длинах волн 400 и 540 нм соответственно. Измерение оптической плотности каждой пробы проводили трижды, затем рассчитывали средний арифметический показатель.

Для определения белкового состава использовали методы электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы (МУК 4.1/4.2.588-96) и в полиакриламидном геле (Laemli, 1970).

Испытание препарата F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина на токсичность осуществляли на белых мышах, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл препарата. Наблюдение за животными осуществляли ежедневно в течение 7 суток.

Определение специфической активности препарата на основе F(ab')2-фрагментов проводили методами in vivo и in vitro. Определение специфической активности in vivo осуществляли в реакции нейтрализации с предварительно установленной дозой инфицирующего вируса (Методы лабораторных исследований по бешенству, 1975). Для определения активности препарата на основе F(ab')2-фрагментов иммуноглобулина в качестве стандарта использовали отраслевой стандартный образец антирабического иммуноглобулина ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток. Начиная с пятых суток учитывали животных погибших от бешенства. Анализ результатов проводили по методу Reed и Muench (Методы лабораторных исследований по бешенству, 1975). Для изучения специфической активности препарата F(ab)2-фрагментов in vitro использовали метод дот-иммуноанализа с использованием диагностикума на основе коллоидного золота, разработанного в РосНИПЧИ "Микроб" (Подборонова с соавт., 2008).

Реактогенные свойства F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина изучали на морских свинках в реакции активной анафилаксии. Животных однократно сенсибилизировали подкожным введением испытуемых препаратов в количестве 0,5 мл, содержащих 0,1 мг белка. На двадцать первый день внутрисердечно вводили разрешающие дозы соответствующих препаратов. Учёт результатов проводили по соотношению числа погибших животных к числу взятых в опыт и по тяжести реакции. Силу анафилактической реакции оценивали по четырехплюсовой схеме (Руководство по иммунологии, 1973).

Анафилактический индекс определяли по формуле Weigle W.O. (Степанова, Менявцева, 1983):

;

где 4,3,2,1,0 - оценка шока в крестах; a,b,c,d,e - количество животных, у которых имел место шок соответствующей тяжести.

Лабораторные животные. В работе использовали белых мышей обоего пола, массой 10-12 г для постановки реакции нейтрализации и 18-20 г для осуществления испытания на токсичность. Для постановки реакции активной анафилаксии использовали морских свинок обоего пола массой 300-350 г.

Статистические методы. Статистический анализ результатов проводили по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьёв, 1962; Лакин, 1990). Вычисления проводили с использованием программ Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation) и Statistica 6 (Statsoft Inc).

Получение иммобилизованного фермента пепсина

На начальном этапе исследований был сконструирован иммобилизованный пепсин. Изучено десять вариантов иммобилизации пепсина на носителях различного происхождения. Для присоединения ферментов к носителям были использованы методы адсорбционной и ковалентной иммобилизации. В таблице 1 сравнивается протеолитическая активность пепсина, иммобилизованного на различных носителях, измеренная по методу Н.П. Пятницкого. Для дальнейшего ферментативного гидролиза иммуноглобулина и получения F(ab')2-фрагментов целесообразно выбрать биокатализатор с активностью не менее 3-4 ед/мл. Использование менее активных ферментов приводит к значительному увеличению объема твёрдой фазы в реакционной среде, что затрудняет перемешивание и способствует снижению скорости реакции.

Таблица 1 Протеолитическая активность иммобилизованного пепсина, полученного различными способами

При выборе метода иммобилизации фермента, помимо его активности, учитывали другие свойства: стабильность при фиксированных значениях рН (3,5; 4,5; 5,5) и температуры (23, 30, 37°С), стабильность при хранении в течение 30 дней при 4°С, возможность многократного применения. Установлено, что для этапа ферменативного гидролиза наиболее подходят нерастворимые ферменты, полученные ковалентным присоединением пепсина к аминогексилагарозе с помощью глутарового альдегида, а также ковалентным присоединением к полистирольному носителю Dowex AG 1X8 и природному силикату с помощью карбодиимида. Биокатализаторы, полученные иммобилизацией на природном силикате или носителе Dowex, после пятикратного применения сохраняют 80-82% первоначальной протеолитической активности, а пепсин, иммобилизованный на AH-агарозе, сохраняет 75-76% первоначальной активности. Для проведения гидролиза рекомендуется выбирать пепсин, иммобилизованный на природном силикате с помощью карбодиимида, поскольку данный биокатализатор достаточно активен, стабилен, а стоимость носителя, необходимого для его получения, минимальна. пепсин гидролиз антирабический иммуноглобулин

Разработка технологии получения F(ab')2-фрагментовантирабического иммуноглобулина с помощью гетерогенного катализа

В последующих экспериментах были выбраны условия получения, очистки и концентрации F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. Для осуществления этапа ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина выбрана модель реактора периодического действия ёмкостного типа с мешалкой. В качестве исходного сырья для получения F(ab)2-фрагментов использовали коммерческий препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина (РосНИПЧИ "Микроб"). Наиболее эффективно проведение ферментативного гидролиза в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,0 - 5,0) в течение 24 ч при температуре 37°С. Оптимальная концентрация иммуноглобулина в реакционной смеси должна составлять 20-30 мг/мл. Было установлено, что для ферментативного гидролиза иммобилизованным пепсином одного грамма иммуноглобулина оптимальным соотношением является такое количество фермента, которое бы обеспечивало 200 единиц протеолитической активности, измеренной по методу Н.П.Пятницкого.

Схемы ферментативного гидролиза могут отличаться типом используемого иммобилизованного фермента, поскольку, как было установлено, глубина расщепления молекул иммуноглобулина практически не зависит от данного фактора. На окончательный выбор иммобилизованного фермента влияют такие параметры, как его биохимические свойства, стоимость носителя, удобство работы.

Рис. 1. Профиль элюции продуктов ферментативного гидролиза на SP-сефарозе XL

Для отделения F(ab')2-фрагментов из реакционной смеси были подобраны условия хроматографического фракционирования продуктов ферментативного гидролиза. Было показано, что для этой цели следует применять гель SP-Sepharose-XL. При хроматографии на колонке размером 5,0х30 см и скорости элюции 4 мл/мин F(ab')2-фрагменты элюировали вторым пиком без примесей низкомолекулярных пептидов и нерасщепленных молекул иммуноглобулина (рис. 1, 2). Элюцию проводили 0,02 М Na-ацетатным буфером, рН 5,5.

Рис. 2. Электрофорез продуктов ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина в полиакриламидном геле Примечание:

1 - маркеры молекулярного веса; 2 - антирабический иммуноглобулин (фракция 1); 3-7 - F(ab')₂-фрагменты антирабического иммуноглобулина (фракция 2); 8-9 - гидролизат антирабического иммуноглобулина.

Для концентрирования F(ab')2-фрагментов был предложен метод лиофильного высушивания. Данный метод позволяет в конечном итоге получить препарат с высокой концентрацией белка с минимальным риском снижения протективной активности. Учитывая большой объем удаляемого растворителя и низкую концентрацию белка, лиофилизацию проводили в течение 48 часов. Предварительно осуществляли замораживание материала до температуры минус 40 °С. Процесс лиофильного высушивания характеризовался максимально щадящими условиями. Продолжительность процесса сублимационной сушки до температуры препарата минус 34°С составляла 8 часов, давление в камере составляло порядка 2-3 Па, температура испарителя -- минус 90 + 2°С. Повышение температуры препарата от минус 34 до минус 10 происходило в течение двух часов. Этап удаления связанной влаги занимал 27 часов. При завершении процесса заданные параметры не менялись в течение пяти часов и соответственно равнялись следующим показателям: температура сублиматора - минус 91°С, температура нагревателей -- 15°С, температура материала -- 21°С. Лиофильно высушенный препарат представлял собой белую пористую массу, легко растворимую в воде. Для дальнейших исследований препарат в стерильных условиях растворяли в физиологическом растворе до необходимой концентрации.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана технология получения препарата на основе F(ab')2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина и методов хроматографического фракционирования, принципиальная схема осуществления которой представлена на рисунке 3.

Основными этапами получения препарата на основе F(ab')2-фрагментов антирабического гетерологичного иммуноглобулина являются иммобилизация пепсина, ферментативный гидролиз антирабического иммуноглобулина, хроматографическое отделение F(ab')2-фрагментов от остатков Fc-части молекулы иммуноглобулина и нерасщепленного иммуноглобулина, концентрирование и стерилизующая фильтрация.

Полученный по данной схеме препарат на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина представлял прозрачную жидкость слабо жёлтого цвета. Концентрация белка составляла 8,0%, рН -- 6,7; цветность -- 0,11; прозрачность -- 0,03. Препарат был электрофоретически однороден, не содержал примесей Fc-фрагментов или остатков нерасщепленного иммуноглобулина. Таким образом, по физико-химическим параметрам препарат F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, полученный по данной схеме, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к препарату антирабического гетерологичного иммуноглобулина.

Исследвание иммунологических свойств F(ab')2-фрагментов гетерологичного антирабического иммуноглобулина

Заключительным этапом исследований явилось изучение протективных и реактогенных свойств F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина. При изучении протективных свойств препарата на основе F(ab')2-фрагментов in vivo установлено, что данный препарат обладает достаточной вируснейтрализующей активностью. Результаты исследования специфической активности в реакции нейтрализации приведены в таблице 2.

Средняя величина логарифма титра нейтрализующих антител составила 3,73 + 0,52 для F(ab')2-фрагментов и 3,9 + 0,23 для отраслевого стандартного образца антирабического иммуноглобулина. Полученные данные указывают на несущественность различий в нейтрализующей способности сравниваемых препаратов.

Таблица 2 Результаты реакции нейтрализации

Исследование протективных свойств in vitro, методом дот-иммуноанализа, также показало, что титр антител препарата F(ab')2-фрагментов и антирабического иммуноглобулина примерно одинаков и составляет 1:3200 - 1:6400. Таким образом, специфическая активность F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина существенно не отличается от специфической активности исходного препарата в тестах in vivo и in vitro.

Для оценки безопасности испытуемого препарата, а также для установления выраженности его повреждающего действия на живой организм, были изучены токсигенные и реактогенные свойства. При сравнении реактогенных свойств установлено, что препарат на основе F(ab')2-фрагментов нетоксичен, обладает меньшей реактогенностью, чем исходный иммуноглобулин (рис. 4).

При проведении тестов активной анафилаксии реакция животных на введение F(ab')2-фрагментов отсутствовала, в то время как при введении аналогичных доз иммуноглобулина имели место случаи гибели животных. Различие анафилактогенных свойств гетерологичного антирабического иммуноглобулина и его F(ab')2-фрагментов статистически достоверно (р < 0,05; X = 4,5).

Таким образом, в результате нашей работы разработана оптимальная биотехнологическая схема получения препарата на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, обладающего достаточной протективной активностью и менее выраженными реактогенными свойствами по сравнению с препаратом нерасщепленного иммуноглобулина. Результаты проведённых исследований обосновывают перспективность применения F(ab')2-фрагментов в качестве лечебно-профилактического малореактогенного иммуноглобулинового препарата.

Выводы

1. Сконструированы стабильные препараты иммобилизованного пепсина, пригодные для осуществления ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Для иммобилизации пепсина наиболее подходящим является ковалентное присоединение к природному силикату с помощью карбодиимида.

2. Разработана методология ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина. Установлено, что для ферментативного гидролиза иммобилизованным пепсином одного грамма иммуноглобулина оптимальным соотношением является такое количество фермента, которое бы соответствовало 200 единицам протеолитической активности.

3. Разработаны оптимальные условия хроматографического отделения F(ab')2-фрагментов от компонентов реакционной смеси на колонке с гелем SP-Sepharose-XL и последующего концентрирования методом лиофильного высушивания.

4. Препарат F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина соответствует нормативным физико-химическим параметрам, предъявляемым к препарату коммерческого гетерологичного антирабического иммуноглобулина: содержанию белка, прозрачности, цветности, электрофоретической однородности, не содержит примесей Fc-фрагментов или остатков нерасщепленного иммуноглобулина.

5. При сравнении вируснейтрализующей активности препаратов на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина и нерасщепленного антирабического иммуноглобулина в реакции нейтрализации и дот-иммуноанализе показано, что вируснейтрализующая активность исследуемых препаратов находится на равном уровне.

6. В сравнительном изучении реактогенных свойств в реакции активной анафилаксии показано, что препарат на основе F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина является более безопасным, чем исходный препарат нерасщепленного гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Никифоров А.К., Волох О.А., Киреев М.Н., Дятлов И.А., Генералов С.В. Применение новых технологий в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина // Инновационные технологии медицины XXI века: Материалы Всероссийского научного форума. - М.: ЗАО «МЕДИ Экспо». - 2006. - С.137-138.

2. Никифоров А.К., Генералов С.В., Волох О.А., Киреев М.Н., Абрамова Е.Г. Использование ферментативного катализа для получения препарата антирабического иммуноглобулина с улучшенными свойствами на основе F(ab')2-фрагментов // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -- М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т.1. - С. 86 - 87.

3. Генералов С.В., Волох О.А., Абрамова Е.Г., Киреев М.Н., Лобовикова О.А., Никифоров А.К. Конструирование иммобилизованного пепсина для получения F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина // Окружающая среда и здоровье: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов. - Рязань, 2007. - С. 239 - 240.

4. Генералов С.В., Волох О.А., Лобовикова О.А., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К. Получение F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях // Методические документы и отчёты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. Реферативный сборник. - Саратов, 2007. - С.20.

5. Генералов С.В., Волох О.А., Абрамова Е.Г., Киреев М.Н., Лобовикова О.А., Никифоров А.К. Получение иммобилизованного пепсина для ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Саратов: ООО «Приволжское издательство». - 2007.- С. 189 - 190.

6. Никифоров А.К., Генералов С.В., Волох О.А., Лобовикова О.А., Абрамова Е.Г., Киреев М.Н. Применение нативного и иммобилизованного пепсина для получения F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина // Биопрепараты. - 2007. - №2. - С. 20 - 21.

7. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелёв И.А., Савицкая Л.В., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Михеева Т.А., Кочкалова Н.Н., Киреев М.Н. Способ получения F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина с использованиием иммобилизованного пепсина // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. -- Волгоград: Издательство ВолГМУ. - 2008. - С. 13 -15.

8. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелёв И.А., Савицкая Л.В., Минаева Л.Н., Галкина М.В., Михеева Т.А., Кочкалова Н.Н., Киреев М.Н. Получение препарата F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина с использованием иммобилизованного пепсина // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - № 3. - С. 53 - 56.

9. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Храмкова Е.М., Шепелёв И.А., Савицкая Л.В., Кочкалова Н.Н., Киреев М.Н. Получение антирабического препарата на основе F(ab')2-фрагментов иммуноглобулина // Вакцинология. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М. - 2008. - С.38-39.

10. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Никифоров А.К., Савицкая Л.В., Галкина М.В., Минаева Л.Н., Михеева Т.А., Будыхо С.В. Характеристика протективных и реактогенных свойств препарата F(ab')2-фрагментов антирабического иммуноглобулина // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: тезисы Всероссийской научно-практической конференции. - М. - 2008. - С. 39.

Размещено на Allbest.ru