Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического использования

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность работы.

В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Proteus в патологии животных и человека (Papapetropoulou, Pagonopoulou, Kouskouni, 1997; Золотухин, 2004; 2005).

Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Lamikanra, Fayinka, Olusanya, 1989; Золотухин, 2002). В то же время представители этого рода являются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и др. (Бутакова, Илинская, Юрова, 1991; Зыкин, 2003; Заркуа, Мечурчлишвили, Гадуа, 2005; Чанишвили с соавт., 2005; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

Также имеется множество экспериментальных данных о патогенности названных микроорганизмов для животных. Протеи выделяются при маститах, эндометритах, раневых инфекциях и других воспалительных процессах у различных видов животных. Особое внимание заслуживают работы по изучению этиологической роли протея в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных (Каврук, Бритова, Гиряева, 1983; Каврук, 1986; 1994; Парайко, Парайко, 1990; Мищенко с соавт., 1999; Золотухин, 2004, Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых протеем, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для лабораторий любого уровня метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых родов микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Натидзе с соавт., 2005). Методы индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Proteus с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Proteus в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйственных животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Proteus.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.

4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат-диагностикум.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

7. Разработать схему идентификации протеев с помощью бактериофагов.

Научная новизна.

Получены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении штаммов бактерий рода Proteus, выделенных из объектов ветеринарного надзора. Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.

Впервые разработаны биотехнологические параметры фагоиндикации и фагоидентификации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.

Практическая значимость.

Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, которые используются для изготовления диагностических препаратов. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата из выделенных фагов и схемы фагодиагностики.

Для конструирования биопрепарата были отобраны два фага, которые депонированы в государственной коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов ФГУ «ВГНКИ» (Справка о депонировании штамма бактериофага П-16 УГСХА от 21.02.2006 №263-3/19; Справка о депонировании штамма бактериофага П-261 УГСХА от 21.02.2006 №263-4/19) для получения патентов.

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных протейных бактериофагов П-16 УГСХА, П-261 УГСХА», одобренная Ученым Советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006.

Для врачей-бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (26.06.2006).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждена актом производственных испытаний (от 10.01.2006), актами комиссионных испытаний в Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006), актами комиссионных испытаний в Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 17.02.2006).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Усовершенствована схема выделения бактериофагов применительно к протеям, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.

Сконструирован биопрепарат-диагностикум из селекционированных фагов и разработаны технологические параметры его изготовления для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

Разработаны схемы ускоренной индикации бактерий Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и идентификации протеев с использованием созданного биопрепарата.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов «Аграрная наука - развитию агропромышленного комплекса» (Ульяновск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2006), на Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно - исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных» при творческом сотрудничестве с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и эпидемиологии (ВНИИВСГиЭ).

1. Материалы и методы исследований

биопрепарат бактерия сельскохозяйственный

Штаммы бактерий. В работе были использованы 40 штаммов бактерий рода Proteus: 14 штаммов были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА»; 14 штаммов получены из музея лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГиЭ; 12 выделены из объектов ветеринарного надзора.

Использовали также 97 штаммов бактерий гетерологичных родов и семейств: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Штаммы бактериофагов. Изучались биологические свойства 22 изолятов протейных бактериофагов, выделенных из объектов ветеринарного надзора Ульяновской и Самарской областей.

Исследуемые объекты. В качестве объектов ветеринарного надзора использовали интактные: водопроводную воду, сточные воды животноводческих ферм и общественных туалетов, фекалии животных и комбикорм, патологический материал от больных и павших животных, контаминированное бактериями рода Proteus мясо.

Методы. Для выделения бактерий рода Proteus использовали схему, изложенную в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденных Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 11.10.1999. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), Л.И. Адельсоном (1962), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), А.С. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвили (1968), И.М. Габриловичем (1973), И.П. Ревенко (1978), В.Я. Ганюшкиным (1988). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий рода Proteus в объектах окружающей среды, кормах и пищевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Бейли, 1962; Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

Выделение бактерий рода Proteus из объектов ветеринарного надзора. Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Proteus из объектов ветеринарного надзора. В период с 2003 по 2006 год было исследовано на наличие бактерий рода Proteus 64 пробы фекалий, сточных вод, патологического материала от больных и павших животных, взятые в 10 хозяйствах Ульяновской и Самарской областей. В результате проведенных исследований было выделено 12 штаммов бактерий рода Proteus из проб, взятых в 7 хозяйствах, что составило 70 %.

Изучение спектра литического действия коммерческого коли-протейного бактериофага. Вторым этапом наших исследований было изучение спектра литического действия коммерческого колипротейного бактериофага на 14 музейных штаммах бактерий рода Proteus и 12 штаммах бактерий рода Proteus, выделенных от животных. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения бактериофага на газон бактериальной культуры. В наших исследованиях изучаемый поливалентный бактериофаг проявил активность в отношении 11 культур, процент лизиса был равен 42,3 %.

Поиск и селекция бактериофагов. Следующим этапом работы была попытка выделить бактериофаги Proteus из имеющихся штаммов бактерий рода Proteus. Мы предполагали возможное наличие лизогенных культур, так как бактериофаги, выделенные из них, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985). В первой серии опытов использовали методику выделения бактериофагов энтеробактерий без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3. В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 30 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ 8, 18,0 % мощности которой приходилось на область 254 нм. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Proteus методом агаровых слоев. В наших исследованиях мы не удалось выделить фаги бактерий рода Proteus. Следующий этап работы был посвящен выделению бактериофагов из объектов внешней среды. При исследовании 20 проб сточных вод и 12 проб фекалий, удалось выявить присутствие 22 изолятов фагов по наличию на газоне индикаторной культуры Proteus негативных колоний или зон лизиса. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний по методикам, описанным И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994).

Характеристика выделенных фагов Proteus.

Морфология негативных колоний. Морфологию негативных колоний изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые выделенными бактериофагами, были разделены нами на пять типов. 1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0-1,5 мм в диаметре - 7 фагов. 2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,0-4,0 мм в диаметре - 4 фага. 3 тип: мутные негативные колонии округлой формы, 1,0-2,5 мм в диаметре - 6 фагов. 4 тип: менее мутные негативные колонии округлой формы с выраженным вторичным ростом бактерий в центре и ореолом по периферии, 6,0-8,0 мм в диаметре - 1 фаг. 5 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы с ровными краями и ореолом по периферии, 2,0-3,0 мм в диаметре - 2 фага.

Спектр литической активности. Для изучения спектра литической активности селекционированных фагов использовали 26 штаммов бактерий рода, проводили его методом нанесения фага на газон бактериальной культуры. Наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, которые лизировали 24 штамма протеев из 26 изученных штаммов, независимо от вида, что составляет 86,5 %.

Литическая активность. Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методами Аппельмана и Грациа (Ревенко, 1978). Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что выделенные протейные бактериофаги обладали различной литической активностью, показатели которой колебались по Аппельману от 10-5 до 10-8, по Грациа от 2,1х106 до 2,0х109. Наиболее высокой литической активностью обладали фаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА: титр по Аппельману 10-8 у обоих фагов, по Грациа 2,0х109 и 1,8х109, соответственно. Для конструирования биопрепарата было отобрано два фага: П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами по Грациа и Аппельману и широким спектром литического действия.

Биологические свойств фагов П-16 и П-261 серии УГСХА.

Спектр литической активности. Для изучения спектра литической активности бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА мы использовали дополнительно 14 штаммов бактерий рода Proteus из музея ВНИИВСГиЭ. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Таким образом, совместный процент лизиса бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА на 40 штаммах бактерий рода Proteus составил 95,0 %.

Таблица 1. Спектр литического действия бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА

Название бактериофага	Количество исследуемых культур	Из них чувствительны к фагу	Процент лизируемых культур
П-16 УГСХА	40	22	55,0
П-261 УСХА	40	27	67,5
Процент лизиса			95,0

Специфичность действия бактериофагов Proteus. Изучение специфичности двух бактериофагов Proteus (П-16 УГСХА, П-261 УГСХА) проводили по отношению к представителям других семейств и родов с использованием штаммов: E.coli - 46 штаммов, Citrobacter spp - 6 штаммов, Morganella spp. - 6 штаммов, Klebsiella spp. - 4 штамма, Salmonella spp. - 6 штаммов, Enterobacter spp. - 4 штамма, Y.enterocolitica - 12 штаммов, Staphylococcus spp. - 3 штамма, Streptococcus spp. - 2 штамма, Pseudomonas aurеginоsa - 4 штамма, Bacillus cerеus - 3 штамма. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что фаги неактивны к представителям бактерий гетерологичных родов и семейств. Таким образом, селекционированные нами фаги являются специфичными для рода Proteus.

Температурная устойчивость бактериофагов Proteus. Результаты проведенных исследований позволяют применять прогревание как метод инактивации микрофлоры при работе с протейными бактериофагами, так как воздействие температуры в диапазоне 60-73 0С не понижали литическую активность бактериофагов, в то время как бактериальные клетки протеев в наших исследованиях погибали при температуре 62 0С в течение 30 минут.

Устойчивость к воздействию хлороформа. Бактериофаги обычно устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий (Ревенко, 1978). Определение чувствительности бактериофагов и бактерий проводили методом обработки фаговой суспензии и бульонных культур протеев хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что селекционированный бактериофаг П-16 УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа. В то время как бактериофаг П-261 УГСХА уже через 15 минут обработки хлороформом значительно терял свою активность. Обработка бактерий индикаторных штаммов P.vulgaris 261 и P.vulgaris 3 в течение 15 минут хлороформом приводила к их полной гибели.

Морфология фаговых корпускул. Для изучения морфологии фаговых корпускул проводили электронно-микроскопические исследования лизатов бульоных культур: P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 с бактериофагами П-16 и П-261 серии УГСХА в титре от 1,8х109 до 2,0х109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грациа). В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага П-16 УГСХА имеют структуры, состоящие из головки гексагональной формы размером 25 нм (± 4) и аналога отростка длиной 1,2 нм (± 0,2). Вирионы бактериофага П-261 УГСХА имеют сходные с фагом П-16 УГСХА структуры: головку гексагональной формы размером 22,5 нм (± 0,2) и аналог отростка длиной 0,6 нм (± 0,1). В соответствии с Международной номенклатурой вирусов по морфологическим параметрам оба фага, П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, были отнесены к семейству Podоviridae (Murphy, 1995), по классификации А.С. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

Изменение литической активности при хранении. Для разработки технологических параметров изготовления биопрепатара из фагов П-16 и П-261 серии УГСХА необходимо было установить изменение литической активности указанных штаммов при хранении в условиях 2-4 0С. Полученные результаты свидетельствуют о том, что селекционированные протейные бактериофаги при хранении в условиях 2-4 0С в течение 12 месяцев незначительно снижали литическую активность до 107 -10 8 фаговых корпускул в 1 см3 .

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий Proteus.

Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к бактериям рода Proteus, нами была разработана схема ускоренной идентификации этих микроорганизмов по показателям лизиса культур на плотной питательной среде. Предлагаемая нами схема позволяет идентифицировать бактерии рода Proteus за 48 часов (2 суток). Срок бактериологического исследования по схеме изложенной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» составил 96 часов (4 суток) при большей затрате посуды и реактивов.

Определение количественного показателя РНФ, имеющее диагностическое значение.

Определение параметров постановки РНФ и разработку количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методике, предложенной В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962). Проведены эксперименты с использованием МПБ, контаминированного 18 часовыми индикаторными культурами P. vulgaris 261 (для фага П-261 УГСХА) и P. vulgaris 3 (для фага П-16 УГСХА) от 101 до 105 м.к./мл. В качестве контроля использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, образовавшихся на плотной питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Учет результатов РНФ проводили согласно оценке, предложенной В.Я.Ганюшкиным (1988): при увеличении количества частиц от 3 до 5 раз бактериофага в опытной пробе по отношению к контролю результат считался слабо положительным, при увеличении свыше 5 раз - положительным, при увеличении в 10 и более раз - резко положительным.

По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации протеем МПБ в концентрации 102 м.к./мл.

Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus, оптимальное время экспозиции устанавливали из шести следующих параметров:

- при предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37С;

- при увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37С.

Для изучения чувствительности РНФ, в зависимости от времени подращивания, МПБ контаминировали бактериями рода Proteus в концентрации от 101 до 105 м.к./мл и инкубировали в термостате при температуре 37 0С в течение 5, 16, 24 часов. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2. Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминированного бактериями рода Proteus

Фаги	№	Варианты исследований	Минимальное количество протеев, обнаруживаемое с помощью	Время, затраченное на проведение исследований, (в часах)
		Длительность подращивания исследуемого материала	РНФ	Бактериологический метод	РНФ	Бактериологический метод
		Часы
П-16 УГСХА	1	5	102	104	22	79
	2	16	102	102	32	88
	3	24	102	102	40	96
П-261 УГСХА	1	5	102	104	22	79
	2	16	102	102	32	88
	3	24	102	102	40	96

Установлено, что подращивание материала в течение 5 часов позволяет обнаружить протей с помощью РНФ в концентрации 102 м.к./мл для фагов П-261 УГСХА, а для фага П-16 УГСХА 102 м.к./мл. При подращивании исследуемого материала в течение 16 часов чувствительность реакции не повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл, соответственно. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество протеев обнаружить удалось через 88 часов. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus в концентрации от 101 до 105 м.к./мл, не подращивали, а увеличивали время контакта с фагом до 5, 10, 16, 24 часов. Результаты представлены в таблице 3.

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 5 часов позволяет обнаружить протеев с помощью РНФ в концентрации 102 м.к./мл для фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА. При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 10-16 часов чувствительность реакции не повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл, соответственно. Бактериологическим методом это же количество протеев удалось обнаружить через 88 часов. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции также не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл соответственно. Бактериологическим методом протеев удавалось обнаружить в концентрации 102 м.к./мл на проведение данного метода затрачивается 88 часов. На основании наших данных, считаем, что наиболее оптимальным являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 102 и 102 м.к. в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов.

Таблица 3. Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами

Фаги	№	Варианты исследований	Минимальное количество протеев, обнаруживаемое с помощью	Время, затраченное на проведение исследований, (в часах)
		Время контакта исследуемого материала с фагом	РНФ	Бактериологический метод	РНФ	Бактериологический метод
		часы
П-16 УГСХА	1	5	102	104	18	79
	2	10	102	103	23	82
	3	16	102	102	29	88
	4	24	102	102	41	96
П-261 УГСХА	1	5	102	104	18	79
	2	10	102	103	23	82
	3	16	102	102	29	88
	4	24	102	102	41	96

Разработка схемы постановки РНФ при помощи селекционированных бактериофагов с образцами объектов ветеринарного надзора.

Пробы образцов объектов ветеринарного надзора (водопроводная вода, комбикорм, фекалии, мясо) в объеме 10 г (мл) вносили в колбы и контаминировали P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 в концентрации 101-105 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г (мл) пробы. Пробы мяса (кусочки свинины) растирали в фарфоровой ступке. Для контроля использовали колбы с пробами, не контаминированными бактериями Proteus.

По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов П-16 и П-261 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации: 102 м.к. протеев в 1 мл водопроводной воды, 103 м.к. протеев в 1 г комбикорма, 103 м.к. протеев в 1 г фекалий, 103 м.к. протеев в 1 г мяса.

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования по фагодиагностике кишечной инфекции поросят, протекающей с участием протеев. Обнаружение проводили бактериологическим методом и с помощью РНФ.

При исследовании 11 проб фекалий от больных диареей поросят, бактериологическим методом выделено бактерий рода Proteus из 36 % проб, а в РНФ - 55 % проб. Результаты исследований свидетельствуют о более высокой чувствительности РНФ (18 часов) при обнаружении бактерий рода Proteus в испражнениях больных диареей поросят в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени (96 часов), реактивов и посуды.

Изучение эффективности поливалентного фагового препарата.

В таблице 4 приведены результаты предварительного титрования фагов и их смеси на индикаторных штаммах протеев.

Таблица 4. Литическая активность протейных монофагов и их смесей

Название фага	Титр фага в моноварианта	Титр смеси фагов
П-16 УГСХА	2,0х109	1,0х109
П-261 УГСХА	1,8х109	1,0х109

Так как исходное число фаговых корпускул в смеси у каждого фага было практически в два раза меньше, то и результаты титрования смеси показали по каждой культуре двукратное уменьшение титра фага (по Грациа), что составило 1,0х109 для обоих фагов соответственно. В абсолютных числах этот показатель являлся диагностическим - 1,0х109 корпускул при исходной концентрации обоих фагов 104. Таким образом, на индикаторных культурах была установлена возможность использования смеси протейных фагов с целью индикации.

Заключение

ВЫВОДЫ.

При исследовании 64 проб патологического материала и объектов ветеринарного надзора из 10 хозяйств Ульяновской и Самарской областей в 7 хозяйствах, что составило 70 %, было выделено 12 культур бактерий рода Proteus.

Выделено из объектов внешней среды 22 изолята фагов, активных по отношению к бактериям рода Proteus и изучены их биологические свойства.

Отобрано два штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, которые имели титр 10-8 по Аппельману и 1,8х109 - 2,0х109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий рода Proteus, не лизировали представителей родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas, сохраняли литическую активность в пределах 107 -108 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2-4 0С и были термостабильными.

Установлено, что фаг П-16 УГСХА был устойчив к действию 10 % раствора хлороформа в течение 30 минут, а фаг П-261 УГСХА был чувствителен к данному реагенту.

Определено, что по морфологическим параметрам бактериофаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА могут быть отнесены к семейству Podоviridae согласно Международной номенклатуре вирусов, а по классификации А.С. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

Разработаны биотехнологические параметры изготовления и контроля специфического диагностического биопрепарата с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА.

Разработана схема идентификации протеев с помощью сконструированного фагового препарата, позволяющая идентифицировать бактерии рода Proteus за 48 часов.

Разработана схема ускоренной индикации бактерий рода Proteus с помощью РНФ в объектах ветеринарного надзора с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить их за 18 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Предложены для конструирования биопрепарата-диагностикума 2 штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, активных по отношению к представителям бактерий рода Proteus, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Proteus предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов, согласно «Методические рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов».

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно “Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-261 УГСХА и П-16 УГСХА».

Литература

Феоктистова Н.А. Биологические особенности бактерий рода Proteus и их роль в патологии животных // Региональные проблемы народного хозяйства: Матер. Всерос. науч.- практ. конф. молодых ученых, 8-9 апреля 2004 г. - Ульяновск, 2004. - Ч. 1 - С.329-336.

Феоктистова Н.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Proteus из объектов внешней среды // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Матер. Всерос. науч-практ. конф., 26-28 апреля 2005 г. - Ульяновск, 2005. - Ч.4,5. - С.-173-176.

Феоктистова Н.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных фагов бактерий рода Proteus // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Матер. Всерос. науч.-практ. конф., 26-28 апреля 2005 г. - Ульяновск, 2005. - Ч.4,5. - С.-176-179.

Феоктистова Н. А. Температурная устойчивость протейных бактериофагов // Молодежь и наука XXI: Матер. Межд. науч.-практ. конф., 21-23 марта 2006 г. - Ульяновск, 2006. - Ч.1. - С.401-403.

Феоктистова Н.А., Юдина М.А. Устойчивость протеев и их бактериофагов к воздействию хлороформа // Молодежь и наука XXI: Матер. Междунар. науч.- практ. конф., 21-23 марта 2006 г. - Ульяновск, 2006. - Ч.1. - С.403-406.

Феоктистова Н.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Тарасова А.В. Поиск бактериофагов бактерий рода Proteus и селекция клонов фагов // Вестник УГСХА. - Ульяновск, 2006. - №1. - С.54-56.

Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк, Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н., Мелехин А.С., Барт Н.Г., Катмакова Н.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных бактерий // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. науч. конф., 21-23 июня 2006 г. - Ульяновск, 2006. - С.227-231.

Золотухин С.Н., Мелехин А.С., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк, Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н. Чувствительность патогенных энтеробактерий, выделенных при диареях молодняка животных к антибиотикам и специфическим бактериофагам // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. науч. конф., 21-23 июня 2006 г. - Ульяновск, 2006. - С.233-236.

Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н., Мелехин А.С. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии // Ветеринарная патология. - 2006. - №3. - С.80-85.

Размещено на Allbest.ru

...