Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность работы. В настоящее время особое внимание уделяют диагностике мало изученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом. К их числу относятся клебсиеллезные инфекции. Представители рода Klebsiella широко распространены в природе, а подвид pneumoniae является нормальной микрофлорой респираторного тракта животных и человека. Однако среди этих микроорганизмов имеются патогенные варианты, способные вызывать у животных и людей самостоятельные заболевания. Клебсиеллы известны как возбудители пневмонии, заболеваний мочеполовой системы, острых кишечных инфекции, различных гнойно-септических осложнений, а также внутрибольничных инфекций, менингитов. Заболевания, вызываемые клебсиеллами, протекающие по типу острого сепсиса, предложено рассматривать как самостоятельную нозологическую единицу - клебсиеллез (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Известно так же, что K.pneumoniae играет этиологическую роль при маститах, пневмониях, септицемиях коров, свиней, лошадей, обезьян, инфекционной диареи молодняка животных (Воронин, Дервишов, Ставцева, 1989; Каврук, 1994; Кукава с соавт., 1998; Шахов, 2003; Золотухин, 2004; 2005).

Выделение и идентификация клебсиелл в основном проводится бактериологическим методом. Трудоемкость и длительность изучения биологических свойств бактерий не позволяет быстро идентифицировать бактерии рода Klebsiella. Существующие современные высокоспецифичные методы лабораторной диагностики (ИФА, РИА, ПЦР) из-за сложности методик, высокой стоимости оборудования и реактивов пока недоступны для большинства лабораторий. В связи с выше изложенным возникает необходимость изыскания эффективных и доступных для ветеринарных лабораторий методов индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella.

Ряд исследователей (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Габрилович, 1981; 1983; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Золотухин, 2005; Натидзе с соавт., 2005) приводят убедительные данные о положительных результатах индикации и идентификации возбудителей некоторых заболеваний с помощью бактериофагов. Метод фагодиагностики является специфичным, не требующий больших затрат времени, материалов и доступен лабораториям всех уровней.

В арсенале ветеринарных лабораторий отсутствуют диагностические клебсиеллезные бактериофаги. Поэтому получение специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Klebsiella, выделенных из объектов ветеринарного надзора, с целью диагностики, является актуальным.

Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Klebsiella в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий Klebsiella.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул) выделенных бактериофагов.

4. Сконструировать на основе индикаторных бактериофагов новый биопрепарат - диагностикум.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагоидентификации и фагоиндикации бактерий рода Klebsiella.

6. Разработать схему идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью бактериофагов.

7. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Научная новизна:

Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий рода Klebsiella, изолированных из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов.

Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Впервые разработаны биотехнологические параметры для фагоидентификации и фагоиндикации клебсиелл в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, используемые для приготовления диагностического биопрепарата.

Два штамма бактериофагов депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и признаны перспективными для приготовления диагностического препарата.

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренная Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006 года.

По материалам диссертационных исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технологические параметры выделения бактериофагов бактерий рода Klebsiella.

2. Выделенные фаги имели высокую литическую активность, два бактериофага К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА обладали широким диапазоном литической активности, специфичностью к бактериям рода Klebsiella.

3. Доказана эффективность сконструированного фагового биопрепарата.

4. Разработаны биотехнологические параметры изготовления диагностического фагового препарата.

5. Схема идентификации бактерий рода Klebsiella с помощью специфических бактериофагов.

6. Схема ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных (Ульяновск, 2006); Всероссийских (Ульяновск, 2004; 2005); Межрегиональной (Самара, 2005) научно-практических конференциях.

Основные материалы диссертации заслушаны и одобрены на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН (26.06.2006), на межкафедральном совещании сотрудников кафедр факультета ветеринарной медицины (15.03.2006).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА и индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний:

- в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.06 г.);

- во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (от 21.02.06 г.);

- в условиях производства, проведенных на базе Чердаклинской районной лаборатории (от 10.12.05 г.).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии в соответствии с комплексным планом научной работы «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных» при творческом сотрудничестве с ВНИИВСГЭ.

1. Материалы и методы

Штаммы. В работе были использованы 38 штаммов бактерий рода Klebsiella, из них 5 референс-штаммов, полученных из ГНЦ прикладной микробиологии г. Оболенск и Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» г. Саратов, 10 штаммов из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ), 11 музейных штаммов кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии, 12 культур выделенные нами из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, 123 штамма других родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Proteus spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Providensia spp., Yersinia enterocolitica, а также родов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp.

21 изолят бактериофагов, выделенный нами из объектов окружающей среды.

Питательные среды и реактивы: мясо-пептонный бульон (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); мясо-пептонный агар (0,3 %, 0,7 %, 1,5 %); среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск); среда Плоскирева («Биотехновация», г. Москва); среда Левина (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); висмут-сульфит агар («Pronadisa», Madrid); среда Симонса (НИИ питательных сред, г. Махачкала); среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала); ацетатный агар (АО «Биомед» им. И.И. Мечникова Московская обл.); среды Гисса с индикатором ВР (НПО «Питательные среды» г. Махачкала); реактив Ковача (Basle, Switzerland); физиологический раствор, рН 7,2 - 7,6; 0,04 % спиртовой раствор метилового красного; водный раствор КОН; раствор б-нафтола; трихлорметан ТУ 6-09-4263-76 (СКТБ «Технолог»); трихлорметан ТУ 6-09-4263-76 (СКТБ «Технолог»); 0,04% спиртовой раствор генцианвиолета.

Методы. Выделение и идентификацию бактерий рода Klebsiella проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П 11 октября 1999 года.

Выделение и селекцию бактериофагов проводили по методам Л.И. Адельсона (1962), С. Лурия, Д. Дарнела (1970), И.П. Ревенко (1978), В.Я. Ганюшкина (1988), С.В. Ленева (1991), Габриловича (1992). Биологические свойства фагов изучали по методам М. Адамса (1961), Гольдфарба (1961), Тихоненко (1968), Габриловича (1973), Ганюшкина (1988), H.-W. Ackermann (1997). Индикацию бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора проводили с помощью реакции нарастания титра фага по методике описанной В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкиным (1988). Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили соосаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования (Пономарев, Андреева, Артамонова, 2002).

Полученный в исследованиях цифровой материал обрабатывали с использованием стандартных программ статистического анализа для IBM PC, «STATISTIKA».

2. Результаты исследований и их обсуждение

Выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора.

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода Klebsiella из объектов ветеринарного надзора и патологического материала. Клебсиеллы были выделены в 8 из 18 хозяйств Ульяновской, Самарской областей и республики Татарстан, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. В результате проведенных исследований из патологического материала и объектов ветеринарного надзора, нами изолированно и идентифицированно 12 штаммов клебсиелл, из них 10 штаммов K. pneumoniae, и 2 штамма K. oxytoca.

Поиск бактериофагов клебсиелл и селекция клонов фагов.

Следующим этапом нашей работы стало исследование 28 (5 референс-штаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella на наличие в них профага. В первой серии опытов выделение бактериофагов из бактерий проводили без воздействия индуцирующего фактора (Гольдфарб, 1961). В результате проведенных исследований штаммы Klebsiella не проявили лизогенных свойств.

Во второй серии опытов на исследуемые культуры воздействовали индуцирующим фактором (Лурия, Дарнелл, 1970), в качестве которого использовали ультрафиолетовое облучение и хлороформ. Суточную бульонную культуру обрабатывали ультрафиолетовыми лучами в течение 10, 15, 20, 30, 40, 60 минут с помощью прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18 % мощности которой приходится на область 254 нм. С такой же экспозицией воздействовали хлороформом на исследуемую культуру в соотношении 1 : 10. В наших опытах исследуемые штаммы Klebsiella в результате индукции не проявили лизогенных свойств.

Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов из объектов внешней среды (Гольдфарб, Тимаков, 1961).

Материалом служили следующие объекты: сточные воды свиноводческих и молочно-товарных ферм из разных хозяйств Ульяновской области, сточные воды Ульяновского мясокомбината. В результате проведенных исследований, нами был выделен и селекционирован 21 штамм бактериофагов Klebsiella.

Характеристика фагов бактерий рода Klebsiella.

Морфологию негативных колоний изучали в разведении фагов 10-7 - 10-9 с индикаторной культурой на питательном агаре в посевах методом агаровых слоев (по Грация). Учет проводили через 18 - 24 часа инкубации в термостате при температуре 37 °С. Отмечали величину негативных колоний, форму, степень прозрачности, характер краев колоний, наличие и величина неполного лизиса. Образовавшиеся негативные колонии разделили на два типа (Бабков, 1973). К первому типу относятся круглые, прозрачные в центре негативные колонии диаметром от 2 мм и более с зоной неполного лизиса по периферии шириной 1 - 8 мм. Негативные колонии первого типа образуют фаги серии УГСХА: К - 4, К - 2, К - 60, К - 0х1, К - 33, К - 12, К - 24, К - 210, К - 210, К - 03, К - 032, К - 10, К - 8. Колонии второго типа круглые, прозрачные с ровными краями в диаметре до 2,5 мм с отсутствием зоны неполного лизиса. Колонии второго типа образуют фаги К - 41, К - 42, К - 11, К - 101, К - 14, К - 201, К - 281, К - 44, К - 81.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах. Активность по методу Аппельмана выражается максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема (по Грация). Изученные нами фаги имели литическую активность от 10-5 до 10-8 (по Аппельману) и от 4 х 107 до 8 х 109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Результаты исследований представлены в таблице 1.

Спектр литической активности. Для изучения спектра литической активности использовали метод нанесения капель бактериофагов на газон исследуемой культуры (Ганюшкин, 1988). В качестве исследуемых культур использовали 28 (5 референс-штаммов, 11 музейных и 12 выделенных нами) штаммов бактерий рода Klebsiella. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о разном диапазоне литической активности изолятов фагов, который колеблется от 14 % до 75 %.

Два отобранных бактериофага исследовали дополнительно на 10 штаммах клебсиелл из коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ). В результате было установлено что, фаг К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги проявили литическое действие в отношении 97 % всех исследованных культур (табл. 2).

Фаги К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА с широким спектром литической активности были отобраны для конструирования диагностического биопрепарата.

Таблица 1. Литическая активность фагов бактерий рода Klebsiella

Таблица 2. Спектр литической активности фагов бактерий рода Klebsiella

Специфичность фагов бактерий рода Klebsiella. Изучение специфичности бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА проводили по отношению к представителям других родов семейства Enterobacteriaceae: Escherichia spp., Proteus spp., Morganella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Enterobacter spp., Providensia spp., Yersinia enterocolitica, а также родов семейств Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp.

Установлено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств.

Температурная устойчивость фагов бактерий рода Klebsiella. В результате изучения чувствительности бактериофагов к действию температуры, установили, что фаги К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА понижали свою физиологическую активность при температуре 67 °С и инактивировались при температуре 81 °С (К - 10 УГСХА) и 88 °С (К - 81 УГСХА) в течение 30 минут (табл. 3).

Таблица 3. Температурная устойчивость бактериофагов Klebsiella

Устойчивость фагов бактерий рода Klebsiella к воздействию хлороформа. Чувствительность бактериофагов к хлороформу определяли в соотношении 1 : 10 при постоянном встряхивании в течение 10, 15, 20, 25, 30, 40 минут. Количество негативных колоний в 1 мл исследовали методом агаровых слоев (по Грация). Обработка бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА хлороформом выявила выраженную устойчивость их к воздействию данного агента в течение 40 минут (табл. 4).

Таблица 4. Устойчивость фагов бактерий рода Klebsiella к воздействию хлороформа

Данный химический агент использовали в исследованиях для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий.

Морфология фаговых корпускул. Для электронной микроскопии подготовку препаратов проводили соосаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования по методике, предложенной А.П. Пономаревым, О.Г. Андреевой, Т.Н. Артамоновой (2002).

Исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100B в лаборатории Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных, совместно с профессором А.П. Пономаревым. В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фагов К - 81 и К - 10 серии УГСХА имеют структуры, состоящие из симметричной головки в виде многогранника с отростком.

Вирусные частицы фага К - 10 УГСХА имеют следующие размеры высота головки 62 нм, диаметр головки: 50 нм и длина отростка - 105 нм. Отношение высоты головки к ее диаметру у фагов равно 1,24. Морфология бактериофага К - 10 УГСХА представлена на рисунке 1.

У фага К - 81 УГСХА корпускулы имеют головку высотой 60 нм, диаметр 55 нм, длина отростка - 85 нм. Отношение высоты головки к ее диаметру равно 1,09 нм. Морфология бактериофага К - 81 УГСХА представлена на рисунке 2.

В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов (Murphy с соавт., 1995) относится к семейству Siphoviridae, по классификации А.С. Тихоненко к IV группе - «Фаги с длинным несокращающимся отростком», а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе - «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (Тихоненко, 1968).

Рис. 1. Электронная микрофотография морфология бактериофага К - 10

Рис. 2. Электронная микрофотография УГСХА морфология бактериофага К - 81 УГСХА

Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных фагов Klebsiella.

Для получения фагов с высокой литической активностью нами была установлена множественность инфекции, выраженная в соотношении между количеством фаговых корпускул и количеством микробных клеток индикаторной культуры. Для штамма фага К - 10 УГСХА множественность инфекции составила 2,17 корпускул фага на 1 бактериальную клетку, фага К - 81 УГСХА - 0,21 к 1. Оптимальная экспозиция пассажа при 37 С составила 4 часа. Был осуществлен контроль бактериофагов: определение стерильности, литической активности, спектра лизиса, специфичности; степень нарастания титра фага.

Разработанные нами технологические параметры индикаторных фагов позволили получить специфический биопрепарат с литической активностью 109. При исследовании литической активности полученного препарата в условиях хранения при 2 - 4 °С с периодичностью 3 - 4 месяца в течение года было установлено, что фаги сохраняли свою активность за весь период наблюдения.

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella.

Учитывая строгую специфичность отобранных бактериофагов К - 10 и К - 81 серии УГСХА, нами была разработана схема ускоренной идентификации бактерий рода Klebsiella. Исследования проводили в сравнении с традиционной схемой, представленной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями». В качестве материала для исследований использовали воду, комбикорм, мясо и фекалии, контаминированные бактериями рода Klebsiella в концентрациях 105, 104, 103, 102, 101 м.к. в 1 мл. Выделение и идентификацию чистых культур микроорганизмов проводили в соответствии с правилами, изложенными в выше упомянутых методических указаниях. Фагоидентификация основывалась на обнаружении прозрачной зоны лизиса бактериофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА.

Проведенные исследования подтверждают возможность идентификации бактерий рода Klebsiella индикаторными фагами К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА, с уменьшением времени исследования с 96 до 48 часов, сократив при этом расход реактивов, питательных сред и лабораторной посуды.

Разработка оптимальных условий постановки РНФ.

Решение следующей поставленной задачи заключалось в разработке оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага (РНФ) с различными субстратами.

Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение. Для постановки РНФ опытным путем установили показатели нарастания титра фагов, имеющие диагностическое значение. В наших исследованиях РНФ считали положительной, если увеличение титра фагов произошло в 5 и более раз. Данный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага.

Установление оптимального времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Для решения поставленной задачи проведены эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

- предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 6, 10, 16 и 24 часов при температуре 37 °С.

Установлено, что с помощью исследуемых бактериофагов в РНФ при подращивании материала в течение 5 часов можно обнаружить клебсиеллы в концентрации 103 м.к./мл. С увеличение времени подращивания материала до 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к./мл. На проведение исследования затрачивается 33 часа. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Таблица 5. Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминированного бактериями рода Klebsiella

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Klebsiella от 101 до 1 x 105 м.к./мл не подращивали, а сразу же вносили в пробирки. За 5 часов инкубации исследуемого материала с фагом К - 81 УГСХА обнаруживались бактерии K. pneumoniae № 8172 в концентрации 104 м.к./мл, при увеличение времени культивирования до 6 часов повышает чувствительность реакции с указанным фагом до 103 м.к./мл, а 10 часовая инкубация - до 102 м.к./мл (табл. 6).

бактериофаг инкубирование индикаторный

Таблица 6. Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с индикаторными бактериофагами

На основании полученных данных можно сделать вывод, что наиболее оптимальным является режим РНФ при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 микробных клеток в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов. Одновременное исследование бактериологическим методом позволяло обнаружить бактерии рода Klebsiella в концентрации 104 м.к./мл, при этом на исследование затрачивалось 96 часов: выделение возбудителя (48 часов), изучение биохимических свойств (48 часов).

Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале.

Данные исследования предполагали изучение возможности использования РНФ с индикаторными бактериофагами К - 10 и К - 81 серии УГСХА для обнаружения бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале (вода, комбикорм, фекалии и мясо). Одновременно исследования проводили бактериологическим методом.

По результатам проведенных исследований водопроводной воды, комбикорма и мяса установлено, что нарастание титра фагов более чем в 5 раз произошло при минимальной концентрации бактерий рода Klebsiella 103 м.к./мл.

При исследовании проб фекалий нарастание титра фагов более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерии рода Klebsiella 104 м.к./г. При увеличении времени инкубации бактериофага с фекалиями до 10 часов обнаруживали клебсиеллы в концентрации 103 м.к./г за 22 часа.

При исследовании воды, комбикорма, фекалий и мяса мы наблюдали видимое преимущество метода фагоиндикации - РНФ над бактериологическим методом исследования. Таким образом, диагностическая чувствительность РНФ позволяет обнаруживать бактерии рода Klebsiella в минимальной концентрации 103 - 104 м.к./мл за 18 - 22 часа.

Испытания в условиях производства. Оценивая эффективность реакции нарастания титра фага в условиях производства мы провели исследования по фагодиагностике кишечной инфекции телят, протекающей с участием бактерий рода Klebsiella. Телята принадлежали молочно-товарной ферме учебно-опытного хозяйства УГСХА Чердаклинского района Ульяновской области. Исследованию подвергали 13 проб фекалий от больных диареей телят в возрасте от 2 - 15 суток.

В пробах фекалий телят методом фагоиндикации с помощью бактериофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА бактерии рода Klebsiella были обнаружены в 38 % случаях (5 проб). Время исследования составило 22 часа. Бактериологическим методом данные бактерии были обнаружены в 15 % случаях (в 2 пробах) за 96 часов.

Результаты производственных испытаний указывают на более высокую чувствительность РНФ при обнаружении бактерий рода Klebsiella в сравнении с бактериологическим методом исследования с меньшей затратой времени, реактивов и посуды.

Изучение эффективности сконструированного фагового биопрепарата.

В качестве усовершенствования предложенного метода нами изучалась возможность использования смеси из монофагов. Определение активности монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА и активности смеси данных фагов на индикаторных штаммах, показало равнозначные результаты (табл. 7). Интерференция, то есть взаимное усиление или подавление при взаимодействии фагов отсутствовала.

Таблица 7. Активность монофагов К - 10 УГСХА, К - 81 УГСХА и их смеси

Результаты проведенных исследований подтверждают возможность использования монофагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА в смеси. Следовательно, полученный биопрепарат, состоящий из двух фагов, может использоваться для идентификации, а также в реакции нарастания титра фага для индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале. Предложены оптимальные технологические параметры постановки РНФ, позволяющие повысить эффективность обнаружения бактерий рода Klebsiella.

Заключение

ВЫВОДЫ.

1. Из объектов ветеринарного надзора и патологического материала Klebsiella spp. обнаружены в 8 из 18 хозяйств, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка животных. Изолированно и идентифицированно 12 клебсиелл штаммов, из них 10 штаммов K. pneumoniae и 2 штамма K. oxytoca.

2. Из объектов внешней среды был выделен и селекционирован 21 изолят бактериофагов активных в отношении бактерий рода Klebsiella.

3. Выделенные фаги имели литическую активность от 10-5 до 10-8 (по Аппельману) и от 4 х 107 до 8 х 109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грация). Изученные фаги характеризовались разным диапазоном литической активности. Установлено что, два бактериофага отличались широким диапазоном литической активности: К - 10 УГСХА лизировал 76 % штаммов бактерий рода Klebsiella, К - 81 УГСХА - 73 %, а в сумме фаги лизировали 97 % всех исследованных культур. Установлено отсутствие активности селекционированных фагов к представителям бактерий других родов и семейств, то есть фаги специфичны к бактериям рода Klebsiella.

4. Показана устойчивость фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА к воздействию высокой температуры. Температурный диапазон составил 67 - 88 °С. Установлена устойчивость названных фагов к воздействию хлороформа в течение 40 минут.

5. В соответствии с морфологическими параметрами бактериофаг К - 10 УГСХА относится к семейству Siphoviridae, к IV группе по классификации А.С. Тихоненко (1968), а фаг К - 81 УГСХА к семейству Myoviridae и к V морфологической группе.

6. Разработанные биотехнологические параметры изготовления и контроля клебсиеллезных бактериофагов позволяют получить специфический диагностический препарат с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА.

7. Разработанная схема выделения и фагоидентификации клебсиелл с помощью фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА, позволяет выделить и идентифицировать бактерии рода Klebsiella за 48 часов.

8. Разработанные технологические параметры ускоренной индикации бактерий рода Klebsiella в объектах ветеринарного надзора и патологическом материале с помощью РНФ с использованием индикаторных бактериофагов (К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА), позволяют обнаружить бактерий рода Klebsiella в концентрации 103 - 104 м.к./мл (г) исследуемого субстрата за 18 - 22 часа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Предложены два штамма фагов К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА активных по отношению к представителям бактерий рода Klebsiella, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы во Всероссийском государственном центре качества и стандартизации ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага К - 10 УГСХА - Phagum Klebsiella 10 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006, К - 81 УГСХА - Phagum Klebsiella 81 УГСХА - ДЕП от 21.02.2006), признаны перспективными и используются для изготавления диагностических препаратов.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Klebsiella, предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Klebsiella в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 26.06.2006 года.

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю индикаторных бактериофагов Klebsiella К - 10 УГСХА и К - 81 УГСХА», одобренной Ученым советом Ульяновской ГСХА и утвержденной ректором академии 17.01.2006 года.

Литература

1. Бульканова Е.А. Выделение, диагностика и идентификация бактерий рода Klebsiella // Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2004. - Ч. 1. - С. 257 - 262.

2. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Митрохина Е.Н. Биологические свойства бактерий рода Klebsiella и их значение в патологии животных // Вестник УГСХА, серия «Ветеринария». - 2004. - № 12. - С. 34 - 40.

3. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из сточных вод // Вестник УГСХА, серия «Ветеринария». - 2004. - № 12. - С. 40 - 42.

4. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение бактериофагов рода Klebsiella из объектов внешней среды // Сб. науч. тр. Межрегион. научно-практ. конф. молодых ученых Приволжского федерального округа. - Самара, 2005. - С. 189 - 191.

5. Бульканова Е.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Литическая активность бактериофагов энтеробактерий рода Klebsiella выделенных из объектов внешней среды // Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2005. - Ч. 5. - С. 155 - 157.

6. Бульканова Е.А., Мелехин А.С., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Биологические свойства бактериофагов Klebsiella выделенных из объектов внешней среды // Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2005. - Ч. 5. - С. 155 - 157.

7. Бульканова Е.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Изучение устойчивости клебсиеллезных бактериофагов к воздействию температуры и хлороформа // Матер. Междунар. научно-практ. конф. - Ульяновск, 2006. - Ч. 1. - С. 333 - 336.

8. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н., Мелехин А.С., Барт Н.Г., Катмакова Н.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. научн. конф. - Ульяновск, 2006. - С. 227 - 231.

9. Золотухин С.Н., Мелехин А.С., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н. Чувствительность патогенных энтеробактерий, выделенных при диареях молодняка животных к антибиотикам и специфическим бактериофагам // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. научн. конф. - Ульяновск, 2006. - С. 233 - 236.

10. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Мелехин А.С., Бульканова Е.А., Феоктистова Н.А., Пожарникова Е.Н. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии // Ветеринарная патология. - 2006. - № 3. - С. 80 - 85.

Размещено на Allbest.ru