Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Разработка методов выделения и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila

03.00.23 - биотехнология

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Канаева Татьяна Ивановна

Саратов - 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия"

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

доктор медицинских наук

Нафеев Александр Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, профессор

Новиков Борис Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"Оренбургский государственный аграрный университет"

Защита диссертации состоится "25" декабря 2009 года в 14: 00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО "Саратовский государственный аграрный университет им.Н.И. Вавилова" по адресу: г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Саратовский ГАУ им.Н.И. Вавилова"

Автореферат диссертации разослан "19" ноября 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

Общая характеристика работы

1. Изучить биологические свойства бактерий вида A. hydrophila.

2. Разработать транспортную среду, среду накопления и селективную среду для выделения бактерий вида A. hydrophila.

3. Разработать схему выделения и идентификации бактерий вида A. hydrophila из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

4. Изучить распространение бактерий вида A. hydrophila.

5. Создать биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации A. hydrophila методом планшетной реакции агглютинации (РА).

Научная новизна работы. Разработана оптимальная схема выделения и идентификации бактерий вида A. hydrophila из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированы новые среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий вида A. hydrophila, а также среда для внутривидовой дифференциации данных бактерий. Изучено распространение аэромонад в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Создан биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации A. hydrophila методом пластинчатой РА.

Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема позволяет выделять и идентифицировать штаммы A. hydrophila из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды. С помощью сконструированной дифференциальной среды появилась возможность определять биоварианты A. hydrophila. Сконструирован биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации бактерий вида A. hydrophila методом пластинчатой РА.

По материалам диссертационной работы предложена "Инструкция по выделению и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila", разработанная для сотрудников медико-биологических научных учреждений, врачей бактериологических лабораторий, в помощь работникам рыбоводческих хозяйств, определяющая временный порядок и правила проведения лабораторных исследований по выделению и идентификации данных бактерий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Транспортная среда (УГСХА-тр.А. h.) позволяет сохранять жизнеспособность бактерий вида A. hydrophila при перевозке проб исследуемого материала до лаборатории. Среда накопления (УГСХА-1А. h.) способствует максимальному росту и размножению аэромонад. Плотная селективная среда (УГСХА-2А. h.) высоко специфична и обеспечивает рост большинства штаммов данного вида микроорганизмов. Дифференциальная среда для биоваров Aeromonas hydrophila позволяет осуществлять идентификацию до подвида.

2. Оптимальная схема дает возможность за 48 ч выделять и идентифицировать бактерии вида A. hydrophila из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

3. Бактерии A. hydrophila широко распространены в объектах санитарного надзора: выделяются из открытых водоемов, сточной воды и речной рыбы, при этом имеют стабильную сезонность.

4. Диагностический биопрепарат позволяет идентифицировать A. hydrophila методом пластинчатой РА.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО "Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия" в рамках научно-исследовательской темы: "Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний".

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2006, 2007, 2008), Международных научно-практических конференциях "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008), "Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел" (Москва, 2008), "Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных" (Покров, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, включают 20 рисунков, 18 таблиц. Список использованных литературных источников содержит 126 наименований, в том числе 81 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Штаммы: В работе было использовано 2 референс-штамма бактерий Aeromonas hydrophila 01 и 02, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА, а также 52 штамма выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Помимо этого, при определении специфичности сконструированных сред, а также в других исследованиях использовались 21 штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida; Proteus mirabilis; Citrobacter freundii; Escherichia coli; Morganella morganii; Proteus vulgaris; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter сlоасаe; Pasteurella multocida; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia enterocolitica; Listeria monocytogenes; Staphylococus aureus, полученные из музея кафедры.

Питательные среды: Для бактериологического исследования использовали следующие готовые питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО "Питательные среды", г. Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО "Питательные среды", г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала), триптон-кровяной агар (Difco), соевый агар (Difco), среды Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, манит, арабиноза, рамноза, дульцит, раффиноза, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО "Питательные среды", г. Махачкала), очищенный агар (Difco), DNA base (Difco), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).

Приборы и оборудование: Холодильники бытовые и минусовые, микропланшетный фотометр Anthos Labtec Instruments (Австрия), ультратермостаты УТ-15У4-2, термостаты ТС-80М-2, микроскоп "Биомед 6" с видеофотонасадкой, микроскопы МБИ-3, электронный микроскоп JEM-7A (Япония), ультразвуковой дезинтегратор "Soniprep 150" (Великобритания) с частотой 23 кГц, лабораторная центрифуга СМ-6М (Латвия), лупа бинокулярная МБС-9, колбы мерные, пипетки, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 мл, стекла покровные, стекла предметные, чашки Петри, пробирки, петли пастеровские, штампы-пробойники, вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия).

Методы: В работе использовались методы для выделения бактерий вида A. hydrophila на триптон-кровяном агаре (ТВА) (Difco) предложенные B. E. Rose и A. J. G. Okaend (1998), на триптон-соевом агаре (Difco) L. Soler (2003), метод выделения с помощью среды Шмита-Шантелье по М.А. Сидорову (1995). Часть исследований проводили по рекомендациям "Методы исследований объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады", разработанные Московским научно-исследовательским институтом гигиены им.Ф. Ф. Эрисмана в 1980 году. Морфологические, культуральные, биохимические свойства определяли по методам рекомендованным А.С. Лабинской (1974). Для выявления капсулообразования применяли окраску по методу Ольта (Сидоров, 1995). Подвижность бактерий исследовали двумя методами: "висячая капля" и посев "уколом" в полужидкий агар (Лабинская, 1974). Фенотипическое определение вирулентных факторов - по методам предложенным B. E. Rose и A. J. G. Okaend (1998). Для определения чувствительности A. hydrophila к химиотерапевтическим средствам использовали метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики (Паркер, 1988). Реакцию иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони (Остерман, 1983). Постановку реакции агглютинации осуществляли пробирочным и капельным методами (Фримель, 1979).

Статистическую обработку результатов проводили по методу И.А. Ойвина (1960). Эксперименты проводились не менее чем в трех повторениях. Нами учитывались лишь те результаты, достоверность которых была не ниже 95 %.

Результаты исследований

Изучение специфичности существующих сред для выделения A. hydrophila

В рамках диссертационных исследований изучали специфичность действия трёх существующих и рекомендованных к применению авторами селективных сред: А-1 и А-2, триптон-кровяной агар (ТВА) с добавлением 5 % дефибринированной крови и ампициллина, среда Шмита-Шанделье. По нашим данным на испытанных средах растут как штаммы A. hydrophila, так и ассоцианты данных бактерий. Отсутствие ингибиторов в среде А-2 позволяет выживать и расти на ней большинству бактерий из сопутствующей микрофлоры (Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida; Citrobacter freundii; Escherichia coli; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter сlоасаe; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia enterocolitica). Среда ТВА, хотя и содержит селективный агент, все же не обладает высокой специфичностью, т.к. наблюдается рост Klebsiella pneumoinae, Enterobacter сlоасаe, Yersinia pseudotuberculosis. Кроме того, на среде ТВА с ампициллином не растут антибиотикочувствительные и негемолитические штаммы A. hydrophila. На среде Шмита-Шантелье по нашим данным растут не только аэромонады, но и Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida. Отсюда следует, что селективные свойства испытанных сред недостаточны.

Конструирование среды накопления

Из результатов наших исследований по определению чувствительности A. hydrophila к химиотерапевтическим средствам следует, что наиболее приемлемым селективным агентом для селективной среды, был бы ампициллин, доксициклин или пенициллин. Но некоторые виды из возможных ассоциантов (Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoinae, Enterobacter сlоасаe, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica) так же устойчивы к данным антибиотикам. Кроме того, некоторые штаммы A. hydrophila являются ампициллинчувствительными, другие неустойчивы по отношению к доксициклину. Таким образом, мы пришли к выводу, что антибиотики нельзя использовать в виде селективного агента в среде для выделения A. hydrophila.

Чувствительность к красителям - один из критериев в систематике микроорганизмов. В результате проведенных нами опытов, выяснили, что селективный агент должен состоять из 3 г/л конго-рота, так как 94,4 % штаммов возможных ассоциантов чувствительны к данной концентрации красителя и не растут на испытуемой среде, и 0,1 г/л кристаллического фиолетового (33,3 % чувствительных штаммов из возможных ассоциантов). В качестве азотно-витаминной основы использовали дрожжевой экстракт, а в качестве источника углерода - мальтозу. Проведя испытания, выяснили, что лучшие показатели по количеству КОЕ имеет образец питательной среды, содержащий 4,0 г дрожжевого экстракта и 3,5 г мальтозы. Хорошей минеральной базой оптимального состава для A. hydrophila является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки A. hydrophila, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в селективную среду в применяемых дозах. Во избежание выпадения селективного агента в осадок и равномерного распространения его во всей среде решено было добавить желатин (1 %), учитывая также, что желатин является растворимым белком, а бактерии A. hydrophila обладают протеолитической активностью и способны разжижать желатин.

В результате вышеизложенных исследований, предложенный нами рецепт среды накопления для бактерий A. hydrophila УГСХА-1А. h. имеет следующий состав: вода дистиллированная - 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; мальтоза - 3,5 г; К₂НРО₄ - 2,0 г; МgSО₄ - 5,0 г; желатин - 10,0 г; конго-рот - 3,0 г; кристаллический фиолетовый - 0,1 г. Дрожжевой экстракт вносили в 1000 мл холодной воды, медленно нагревали. Затем последовательно добавили калий фосфорнокислый двузамещенный и магния сульфат, мальтозу, конго-рот (в виде 0,3 % водного раствора) и кристаллический фиолетовый (в виде 0,01 % водного раствора). Кипятили 2-3 минуты, при постоянном помешивании. В бульон вносили желатин и оставляли для набухания на 1 час, затем подогревали в водяной бане при 40-50°С до полного расплавления желатина. После этого горячую среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр и разливали в стерильные пробирки по 5 мл. Стерилизовать при 110°С 30 минут. Цвет среды красно-коричневый. Оптимальное время культивирования составляет 24 часа. Предложенная среда УГСХА-1А. h. обладает высокой специфичностью (отсутствует рост ассоциантов).

Конструирование плотной селективной среды и дифференциально-диагностической среды для A. hydrophila

Прототипом плотной селективной среды послужила среда накопления УГСХА-1А. h., к которой вместо желатина был добавлен агар-агар. Состав: вода дистиллированная - 1000 мл; агар-агар - 15 г; дрожжевой экстракт - 4,0 г; мальтоза - 3,5 г; К₂НРО₄ - 2,0 г; МgSО₄ - 5,0 г; конго-рот - 3,0 г; кристаллический фиолетовый - 0,1 г. Цвет среды красно-коричневый. Колонии A. hydrophila на данной среде округлые, выпуклые, блестящие, до 3 мм в диаметре, светло-бежевые, без изменения цвета среды под ними. Плотная среда позволяет проводить селекцию бактерий вида A. hydrophila по морфологии колоний и является также высоко специфичной.

Вид Aeromonas hydrophila включает биовары: A. hydrophila subsp. dhakensis; A. hydrophila subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. ranae; A. hydrophila subsp. аnaerogenes; A. hydrophila subsp. decolorationis, имеющих сходные биохимические характеристики, композицию ДНК и последовательность нуклеотидных образований. Для внутривидовой дифференциации нами была разработана среда, которая позволяет сократить набор тестов до минимума, к тому же он менее трудоемок и требует меньших затрат времени и посуды. Состав среды следующий: МПБ - 1000 мл, L-арабиноза - 10 г, D-сахароза - 1 г, натрий хлорид - 5 г, агар-агар - 20 г, феноловый красный (0,2 % раствор в 50 % этиловом спирте) - 12 мл. Дифференциацию основывали на различие следующих ферментативных свойств: кислотообразование из L-арабинозы и D-сахарозы, гидролиз мочевины и образование газа.

Разработка схемы выделения бактерий A. hydrophila

Разработку бактериологического метода выделения и идентификации проводили, используя свойство разработанных сред: накопительной и плотной селективной, а также референс-штаммов A. hydrophila 01 и 02. Производили посевы исследуемого материала на среду накопления. Спустя 24 часа культивирования при температуре 37°С на среде УГСХА-1А. h. наблюдали рост бактерий и разжижение желатина. Второй этап: со среды накопления пересевали культуру на плотную селективную среду УГСХА-2А. h. и среду ТВА с добавлением 5 % дефибринированной крови. Спустя 24 часа культивирования при 37°С на плотной селективной среде наблюдали рост округлых, выпуклых, бежевых, блестящих колоний, 3 мм в диаметре. Выделенные бактерии проверяли и окончательно идентифицировали с помощь окраски по Граму, с последующей микроскопией, тестов на оксидазу, индол, уреазу, триптофан, ОF-теста, реакции на углеводы, наличие аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы, образование сероводорода. На среде ТВА с кровью и DNA агаре вокруг колоний A. hydrophila спустя 48 ч культивирования появляется широкая зона лизиса. Схема выделения представлена на рисунке 1.

aeromonas hydrophila ветеринарный санитарный надзор

Рис. 1. Схема выделения Aeromonas hydrophila

Предложенная схема позволяет выделять и идентифицировать бактерии A. hydrophila за 48 часов. С помощью данной схемы нами выделено 52 штамма бактерий вида A. hydrophila из проб от объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Были исследованы пробы морской рыбы, поступающей на рынки города Ульяновска в замороженном состоянии, а так же речной рыбы из местных водоемов. Кроме того, проводились исследования по обнаружению аэромонад в пробах воды из открытых водоемов Ульяновской области, сточных водах и водопроводной воде Ульяновска. Также были исследованы пробы сырого молока, мяса и мясных продуктов, яйца, овощи и фрукты на контаминацию A. hydrophila. Результаты исследования различных проб представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты исследования объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию бактериями

Aeromonas hydrophila

Примечание: "+" случаи контаминации Aeromonas hydrophila; "-" отсутствовала контаминация Aeromonas hydrophila.

Наибольшее количество выделенных бактерий A. hydrophila приходится на открытые водоемы, сточные воды и речную рыбу. Из таких продуктов, как яйца, овощи, фрукты, а так же мяса и мясных продуктов изучаемых бактерий не выделено.

Изучили морфологические и биохимические свойства выделенных бактерий. Благодаря данным световой и электронной микроскопии мы установили, что выделенные нами A. hydrophila это прямые палочки с закругленными концами, располагаются поодиночке, парами, цепочками, подвижные (монотрихи). Бактерии имеют капсулу, микрокапсулу, кроме жгутиков в некоторых штаммах просматриваются пили. По Граму окрашивались отрицательно. Все выделенные штаммы A. hydrophila были оксидазоположительными, образовывали индол, давали положительные результаты в реакции с метиловым красным и реакции Фогеса-Проскауэра. На среде Хью-Лейфсона изменение цвета наблюдалось во всех пробирках, это говорит о том, что все выделенные микроорганизма относятся к факультативнам анаэробам. Положительные по аргининдигидролазе и отрицательные по лизиндекарбоксилазе и орнитиндекарбоксилазе. Выделенные штаммы не одинаково реагируют с углеводами, гидролизуют мочевину, образуют сероводород. Это связано с наличием внутри вида деления на биоварианты с разной биохимией. Для фенотипического определения вирулентных факторов определяли наличие гемолитической активности у выделенных штаммов на триптон-кровяном агаре (Difco) с добавлением 5 % дифибринированной крови. Протеолитическую активность проверяли на питательном бульоне с желатином. ДНКазную активность на среде DNA ВА (Difco). Все выделенные бактерии отличаются по вирулентности. Так наиболее вирулентными по нашим данным являются штаммы выделенные из сточных вод и открытых водоемов, а так же молока.

Выживаемость A. hydrophila на разработанной транспортной среде

Для перевозки проб исследуемого материала до лаборатории рекомендуем использовать транспортную среду УГСХА-тр.А. h. Она содержит желатин (5 %), уплотняющий среду, и необходимые питательные вещества. Мы исследовали температурную устойчивость и выживаемость бактерий A. hydrophila. В работе были использованы 1 референс-штамм A. hydrophila и 12 штаммов выделенных нами из различных объектов окружающей среды и патологического материала, а так же пищевых продуктов. Рост бактерий проверяли на среде УГСХА-тр.А. h. и плотной селективной среде УГСХА-2А. h., при - 4, +5, +30, +41, +45°С, в течение от 1 до 4 суток. Рост бактерий A. hydrophila при - 4°С не наблюдался, но при высевании из пробирок с замороженными бульонными культурами на агар и инкубации чашек в термостате при оптимальной температуре (30°С), наблюдался характерный рост бактерий A. hydrophila. Данные бактерии могут находиться в замороженном состоянии на среде УГСХА-тр.А. h. до 12 месяцев, в бытовом холодильнике (при температуре +5°С) до 4 месяцев. При температуре +5°С в пробирках со средой УГСХА-тр.А. h. наблюдали рост аэромонад спустя 48 часов, в то время как на чашках, вырастали мелкие колонии уже через 24 часа. Температура +30°С является оптимальной для роста бактерий A. hydrophila, спустя 24 часа в пробирках наблюдается характерный рост, а на чашках с УГСХА-2А. h. образование колоний. Температура +41°С считается не приемлемой для роста аэромонад, однако 10 из 12 проверяемых нами штаммов росли при данной температуре как в пробирках с транспортной средой, так и на чашках с УГСХА-2А. h. Референс-штамм также имел характерный рост на данных средах, спустя 24 часа. А вот при температуре +45°С не наблюдалось роста ни в пробирках, ни на чашках Петри. Соответственно температурные границы роста бактерий A. hydrophila составляют от +5°С до +41°С и выживаемость бактерий на среде УГСХА-тр.А. h. при температуре +5°С достигает 4 месяцев.

Особенности распространения бактерий А. hydrophila

Наиболее распространены бактерии А. hydrophila в воде открытых водоемов. Исследовали 128 проб озёрной воды и 60 проб речной воды Ульяновской области. Из озерной воды данный микроорганизм выделяли в 9,1 % исследуемых проб. Из речной воды - в 2,7 % проб. По нашим данным, наибольшее количество выделяемых бактерий приходится на период мая-августа. Из 24 случаев выделения бактерий А. hydrophila из воды открытых водоемов показатели сезонности по месяцам распределяются следующим образом: январь - 0, февраль - 0, март - 2, апрель - 2, май - 5, июнь - 10, июль - 12, август - 9, сентябрь - 2, октябрь - декабрь - 0.

Конструирование антигенного препарата для идентификации А. hydrophila

Одной из задач диссертационной работы была конструирование диагностического биопрепарата для идентификации бактерий А. hydrophila. Мы учли, что антигены бактерий A. hydrophila локализуются в жгутиках, капсуле, клеточной стенке, рибосомах, цитоплазматической мембране и цитоплазме. Для получения гипериммунных сывороток, мы предложили собственную схему гипериммунизации кроликов и набор антигенов A. hydrophila. Накопление бактериальной массы осуществляли на МПБ в термостате в течение 48 ч, при температуре 37°С, затем для очистки клеток от питательного субстрата двукратно центрифугировали на аппарате СМ-6М при 1900 g в течение 20 мин и ресуспензировали физиологическим раствором. Наработанную бактериальную массу разделили на 4 образца. Для инактивации A. hydrophila в один из образцов был добавлен мертиолят (1: 10000), другой подвергся кипячению на водяной бане в течение 30 мин. В третий добавили мертиолят (1: 10000) и для дезинтеграции 0,25 % SDS (додецилсульфат натрия) детергент, разрушающий нативную структуру клетки. Четвертый образец, после добавления мертиолята (1: 10000), подвергли ультразвуковой дезинтеграции с помощью прибора "Soniprep 150" (частота 23 кГц) при охлаждении спиртом со льдом. Первоначально для получения ультразвукового антигена был проведен опыт по выбору оптимальной амплитуды для максимального разрушения клеток ультразвуком. Стерильные пробирки (эппендорф на 1,5 мл) заполняли 1,0 мл культуры, ставили в акустическую камеру дезинтегратора, так чтобы подающая энергию насадка была опущена в среду на 1 см и поочередно выставляли амплитуду ультразвуковых колебаний: 3 мк, 5 мк, 7 мк. По результатам микроскопии установили, что оптимальной является амплитуда в 7 мк.

Таким образом, получили готовые антигенные препараты 4-х видов (Т - антигенный препарат подвергшийся кипячению; М - антигенный препарат с добавленным мертиолятом; SDS - антигенный препарат содержащий SDS; УЗ - антигенный препарат обработанный на ультразвуковом дезинтеграторе). Проверили данные антигенные препараты на стерильность и получив отрицательные результаты (отсутствие колоний на агаре спустя 48 ч инкубации), антигенные препараты стандартизировали по показателям оптической плотности с помощью микропланшетного фотометра Anthos Labtec Instruments (Австрия) приведя их к единым цифрам - 0,620-0,650 нм.

В результате гипериммунизации кроликов получили сыворотки A, B, C и D. Для выяснения антигенного действия применяемых суспензий определяли динамику образования агглютининов в ответ на гипериммунизацию кроликов. Установили, что титр антител, регистрируемых в РА, имеет значительную разницу при гипериммунизации различными антигенными препаратами, так максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение ультразвукового дезинтеграта и равна к 10 дню гипериммунизации 1: 80. К 20 дню титр антител вырос до 1: 320 и оставался самым высоким. В дальнейшем изучали структуру антигенных препаратов для выбора наиболее оптимального, содержащего наибольшее количество антигенных детерминант. С этой целью нами была использована реакция диффузионной преципитации (РДП). В результате в двух случаях, между центральной лункой, содержащей сыворотку А и В и лунками, заполненными исследуемыми антигеными препаратами, образовывалось по одной полосе преципитации, причем линии преципитации полностью сливались, что говорит об идентичности антигенов. Между центральной лункой содержащей сыворотку С и лунками заполненными антигенным препаратом, содержащим SDS и УЗ образовывались две полосы преципитации (что говорит о наличие в системе как минимум двух комплексов антиген-антитело) (рис.2а). Между центральной лункой содержащей сыворотку D и: лунками заполненными Т и М образовывалось по одной линии преципитации, лункой заполненной антигенным препаратом, содержащим SDS - две полосы преципитации, и одной лункой, заполненной ультразвуковым дезинтегратом наблюдалось 3 полосы преципитации (рис.2б).

а б

Рис.2. Результаты РДП

а - РДП с полученной гипериммунной сывороткой (С) и изготовленными антигенами (М, Т, SDS, УЗ);

б - РДП с полученной гипериммунной сывороткой (D) и изготовленными антигенами (М, Т, SDS, УЗ)

Благодаря проведенным исследованиям был выбран антигенный препарат бактерий A. hydrophila содержащий до 3-х специфических антигенов, что позволило сконструировать серологический комплект для антигенной идентификации выделенных бактерий, включающий гипериммунную сыворотку и ультразвуковой антиген. Для проверки данного препарата исследовали выделенные "полевые" штаммы A. hydrophila в пластинчатой реакции агглютинации. Получив положительные результаты пришли к выводу, что данный биопрепарат можно использовать для антигенной идентификации выделенных бактерий методом РА.

Выводы

Практические предложения

· Предложены среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий A. hydrophila, а также дифференциальная среда для определения биовариантов A. hydrophila.

· Предложена новая схема выделения и идентификации штаммов A. hydrophila из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды.

· Предложен диагностический биопрепарат для идентификации бактерий A. hydrophila методом пластинчатой РА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Васильев, Д.А. Тесты по идентификации Pseudomonas aeruginosa и Aeromonas hydrophila / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.И. Елантьева, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 26-28 апреля, 2005. - Ульяновск, 2005. - Ч.5. - С.230-233.

2. Васильев, Д.А. Токсины Aeromonas hydrophila / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.И. Елантьева, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 26-28 апреля, 2005. - Ульяновск, 2005. - Ч.5. - С.233-236.

3. Канаева, Т.И. Распространение бактерии Aeromonas hydrophila и ее роль в патогенезе человека / Т.И. Канаева, И.Р. Насибуллин // Молодежь и наука XXI века: Материалы Международной научно-практической конференции, 21-23 марта 2006. - Ульяновск, 2006. - С.352-356.

4. Канаева, Т.И. Обзор по выделению и идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, С.Н. Золотухин // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Материалы Международной научной конференции, 21-23 июня 2006. - Ульяновск, 2006. - С.93-96.

5. Канаева, Т.И. Ускоренный метод внутривидовой дифференциации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Э.А. Афонин, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование в реализации национального проекта "Развитие АПК": Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 22-24 ноября 2006. - Ульяновск, 2006. - С.345-348.

6. Канаева, Т.И. Рост бактерий Aeromonas hydrophila при различных температурных режимах культивирования / Т.И. Канаева, Э.А. Афонин, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: Материалы 2-й Открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, 24-26 апреля 2007. - Ульяновск, 2007. - С.71-73.

7. Канаева, Т.И. Выделение и идентификация бактерий вида Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы Международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008. - Москва, 2008. - С.124-125.

8. Канаева, Т.И. Результаты апробации использования антигенного биопрепарата при идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая 2008. - Ульяновск, 2008. - С.40-47.

9. Канаева, Т.И. Результаты апробации предлагаемой схемы выделения и типизации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая 2008. - Ульяновск, 2008. - С.47-51.

10. Канаева, Т.И. Разработка селективных сред и бактериологической схемы диагностики бактерий Aeromonas hydrophila, вызывающих аэромоноз рыб / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Материалы Международной научно-практической конференции, 26-27 ноября 2008. - Москва, 2008. - С.378-382.

11. Канаева, Т.И. Разработка бактериологической схемы диагностики аэромоноза рыб / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, 2-5 декабря 2008. - Покров, 2008. - С.111-114.

12. Канаева, Т.И. Изучение морфологических и биохимических свойств бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, 2-5 декабря 2008. - Покров, 2008. - С.222-223.

13. Канаева, Т.И. Новые методы выделения и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов. - Томск, 2009. - С.110-111.

14. Канаева, Т.И. Получение гипериммунных сывороток для идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов. - Томск, 2009. - С.111-113.

15. Канаева, Т.И. К вопросу выделения и идентификации бактерий Аeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев // Вестник Саратовского госагроуниверситета им.Н.И. Вавилова. - 2009. - № 9. - С.25-27.

16. Канаева, Т.И. Возможность использования антигенного биопрепарата для идентификации бактерий Аeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев // Вестник Саратовского госагроуниверситета им.Н.И. Вавилова. - 2009. - № 10. - С.27-31.

Размещено на Allbest.ru