Уточнение спектральной зависимости кожной световой чувствительности Lymnaea Stagnalis (L) по проявлениям теневого рефлекса

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 591.185.61:594.381.5

Уточнение спектральной зависимости кожной световой чувствительности Lymnaea stagnalis (l) по проявлениям теневого рефлекса

В.В. Жуков

В.В. Малащенко

К.А. Судоплатов*

Исследовано проявление оборонительной реакции моллюска Lymnaea stagnalis на ритмическое раздражение теневыми стимулами у группы интактных моллюсков и особей с предварительно удаленными глазами. Оценка оборонительной реакции, возникающей на выключение света (теневой рефлекс), производилась по балльной шкале. Установлена зависимость проявления теневого рефлекса от длины волны фонового освещения кожи прудовика. Максимум световой чувствительности моллюсков обеих групп приходится на 490 нм.

lymnaea stagnalis, оборонительный теневой рефлекс, кожная световая чувствительность, спектральная зависимость

Световая чувствительность моллюска Lymnaea stagnalis обеспечивается фоторецепторными клетками сетчатки [1] и эпителия кожи [2]. Глаза определяют направленное движение прудовика к источнику света [3], в то время как резкое уменьшение освещенности кожных покровов запускает оборонительное поведение, включающее сокращения щупалец и втягивания тела в раковину, названное теневым рефлексом [4]. Животные с удаленными глазами сохраняют положительный фототаксис, хотя для его проявления требуются большие величины светового потока [5]. Участие сенсорных сигналов кожных фоторецепторов в осуществлении двух форм поведения подтверждается регистрацией в периферических нервах моллюска реакций как на включение (on-ответ), так и выключение (off-ответ) освещения [6]. Установленная по электроретинограмме спектральная зависимость световой чувствительности сетчатки близка к спектру абсорбции родопсина с максимумом около 490 нм [7]. Первые данные о спектральной характеристике кожной световой чувствительности были получены по оценке вероятности проявления теневого рефлекса, максимум которой наблюдался при фоновом освещении 520 нм [8]. Позднее спектральные измерения были выполнены на основе регистрации степени втягивания тела животного в раковину, хотя оборонительный рефлекс имеет ряд дополнительных градаций. Максимальная величина этого компонента теневого рефлекса приходится на 500-510 нм [9]. Полученная же по проявлениям фототаксиса у прудовиков с удаленными глазами спектральная кривая имеет более размытый диапазон положения максимума - от 490 до 510 нм [10]. Результаты измерений на основе балльной оценки проявления теневого рефлекса половозрелых моллюсков обнаружили плохое совпадение со спектрами поглощения родопсина [11], что, вероятно, можно объяснить доминантой репродуктивного поведения животных этой возрастной группы. Указанные расхождения побудили нас к дополнительному исследованию этого вопроса.

Ювенильные особи Lymnaea stagnalis высотой раковины около 15 мм до опытов содержались в прохладном подвальном помещении в емкостях с отстоянной водой при искусственном освещении (12С:12Т). За день до эксперимента моллюсков переносили в лабораторию в условия естественного режима освещения. Были сформированы две группы по 10 моллюсков: одну - составляли интактные животные, другую - животные, подлежащие операции по удалению глаз. моллюск теневой рефлекс

Операционные вмешательства проводили на моллюсках, анестезированных 0,57%-ным раствором ультракаина. Удаление глаз проводили электролитически заточенными вольфрамовыми иглами за пять дней до проведения экспериментов.

Экспериментальная установка включала в себя светонепроницаемый короб, блок фотостимуляции, схему измерения освещенности и блок видеорегистрации [11]. Для измерения освещенности применяли фотометр, собранный на основе полупроводникового фотодиода OPT101. Энергетическую освещенность рабочей поверхности фотодиода ( = 4 мм²), создаваемую светом длины волны л, оценивали по величине выходного напряжения электрической цепи фотометра на основании известной спектральной характеристики его чувствительности по формуле:

, (1)

где - число квантов с длиной волны , поглощенных в единицу времени.

Для получения пучка света с одинаковыми значениями квантового потока разных длин пользовались соотношением:

, (2)

где индекс относится к величинам первого установленного для измерений значения длины волны (как правило, 410 нм), а индекс - ко всем последующим.

Вычисленное значение устанавливали, регулируя световой поток диафрагмой. Энергетическую освещенность, создаваемую на коже моллюска, монохроматическим потоком оценивали как

, (3)

где =44,8 мм² и =7 мм² - площади сечения рукава световолоконного жгута, по которому свет подводили к животному, и светового пятна в плоскости положения поверхности тела моллюска, соответственно.

Число квантов с длиной волны , приходящихся на единицу площади кожи моллюска за 1 с (плотность квантового потока), вычисляли как

. (4)

Регистрацию реакции моллюска осуществляли с помощью web-камеры Creative Web Cam Pro PD 1030 со смонтированной на ней линзой. Для подсветки применяли инфракрасный светодиод HIR333C/H0 (л_p = 850 нм, Дл = 45 нм), включенный в цепь источника постоянного тока. Создаваемая энергетическая освещенность, рассчитанная для максимума эмиссии, составляла 0,22 Вт/м² и не вызывала двигательной активности ни у одного из исследованных животных при включении или выключении светодиода.

Алгоритм эксперимента по получению спектральной зависимости теневого рефлекса. Опыт начинали через 15-20 мин после помещения животного в экспериментальную камеру. В период стимуляции длительность затенения 10 с чередовалась с двухминутными интервалами освещения. Видеорегистрацию начинали за 5 с до нанесения теневого стимула и продолжали 5 с после его окончания. Каждый моллюск из группы получал по 20 стимулов для устанавливаемой длины волны в экспериментах по получению спектральной зависимости теневого рефлекса и по 10 - в опытах по установлению зависимости реакции от плотности потока квантов. Перед началом нового блока стимуляции следовал интервал 15-20 мин фонового освещения.

Обработка результатов. Для оценки состояния моллюска применяли балльную шкалу [12]. Степень проявления реакции () определяли как разность балльных оценок состояния моллюска после () и до () нанесения стимула:

. (5)

При спектральных измерениях среднее значение балльной оценки реакции каждого животного () для длины волны фонового освещения определяли по 20 стимулам ():

. (6)

Полученное значение нормировали по отношению к максимальной величине реакции данного животного и использовали как относительную оценку кожной световой чувствительности:

. (7)

Для построения итоговых спектральных зависимостей получены значения усреднением по группе животных:

. (8)

Оценку статистической достоверности различий средних величин проводили по критерию Стьюдента.

Зависимость балльной оценки теневого рефлекса от плотности квантового потока фонового освещения была получена для длин волн 450, 490 и 530 нм, заведомо попадающих в интервал поиска максимального значения кожной световой чувствительности моллюска. В диапазоне доступных световых потоков полученная зависимость была близка к линейной (рис. 1). В дальнейших экспериментах мы применяли освещение с плотностью квантового потока

6.00-6.34Ч10¹⁷м^-2с^-1 потому, что в этих условиях спектральные различия произведенных теневыми стимулами эффектов были максимальны и статистически достоверны (p?0,01).

Рис.1. Зависимость выраженности теневого рефлекса интактных (слева) и оперированных (справа) моллюсков Lymnaea stagnalis от фонового освещения: ось ординат - балльная оценка рефлекса; ось абсцисс - плотность квантового потока (1 ед. = 10¹⁷ м^-2с^-1) фонового освещения; вертикальные линии - стандартное отклонение (n = 5) Fig. 1. The dependence of the manifestation of the shadow reflex in intact (left) and operated (right) Lymnaea stagnalis from the background illumination: оrdinate - evaluation of the reflex manifestation; аbscissa - quantum flux density of the background illumination (1 unit = 10¹⁷ м^-2s^-1); vertical bars - standard deviation (n=5)

Реакция моллюска на длительное ритмическое воздействие теневых стимулов. Так как при получении спектральной зависимости чувствительности каждый моллюск подвергался воздействию 120 теневых стимулов, то в отдельной серии контрольных испытаний выясняли возможность развития привыкания к ритмическому раздражению. С этой целью моллюск подвергался воздействию пяти блоков из 20 теневых стимулов, наносимых на фоне освещения 490 нм с плотностью квантового потока 6,00Ч10¹⁷м^-2с^-1. Как и в последующих экспериментах, блоки стимуляции чередовались 15-20-минутными интервалами постоянного освещения. Были получены реакции пяти интактных моллюсков из опытной группы. Сравнивали суммарную балльную оценку реакции моллюсков на первый и последний блоки стимуляции. Отсутствие достоверных различий между средними величинами балльной оценки реакции на блоки стимулов (p>0,05) было принято как свидетельство того, что ритмическое нанесение теневых стимулов на фоне выбранных значений освещенности не приводит к развитию привыкания или сенситизации животного.

Кривые спектральной зависимости балльной оценки рефлекса оказались совпадающими по положению максимумов, но различающимися по их значению. Спектральная кривая, полученная для оперированных моллюсков, имеет более острый пик по сравнению с зависимостью, полученной для интактных животных (рис. 2). Нормированная спектральная зависимость кожной световой чувствительности, полученная для интактных моллюсков, несколько шире таковой для оперированных животных (рис. 2). Отметим также, что вблизи максимума и в коротковолновой области спектральная кривая интакных животных явно ближе к спектру абсорбции родопсина А₁, рассчитанному для л_max=490 нм, чем в случае моллюсков с удаленными глазами.

Рис. 2. Спектральные зависимости кожной световой чувствительности (слева) и балльной оценки проявления теневого рефлекса (справа), полученные для интактных (пустые квадраты) и оперированных (черные треугольники) моллюсков Lymnaea stagnalis при квантовом потоке фонового освещения 6,34Ч10¹⁷м^-2с^-1: спектр поглощения родопсина палочек (сплошная линия) рассчитан по формуле [13] для л_max = 490 нм; ось ординат - нормированное значение световой чувствительности (левый график) и балльная оценка выраженности рефлекса (правый график); оси абсцисс - длина волны, нм; вертикальные линии - стандартное отклонение (n=10)

Fig. 2. Spectral dependence of skin light sensitivity (left) and manifestation of the shadow reflex (right) obtained for the intact (open squares) and operated (black triangles) Lymnaea stagnalis at the quantum flow of background illumination 6.34Ч10¹⁷ м^-2s^-1: the absorption spectrum of rhodopsin in rods (solid line) was calculated by the formula [13] for л_max = 490 nm; оrdinate - normalized value of light sensitivity (left diagram) and manifestation of the shadow reflex (right diagram); аbscissa - wavelength, nm; vertical bars - standard deviation (n=10)

Спектральные характеристики зрительного пигмента прудовика, полученные путем регистрации электрических реакций глаза [7], отдельных фоторецепторных клеток [14] или соответствующих форм поведения [10], указывают на его принадлежность к группе родопсинов. Сведения же о свойствах кожных фоторецепторов менее определенны [9]. При этом прудовик остается единственным брюхоногим моллюском, для которого данные о спектральной характеристике светочувствительного пигмента кожи были получены благодаря хорошо выраженному оборонительному теневому рефлексу [8, 9]. Найденная в наших опытах спектральная зависимость балльной оценки проявления теневого рефлекса достаточно близка к кривой абсорбции родопсина с максимумом около 490 нм. Полученное значение совпадает с установленным по электроретинограмме максимумом световой чувствительности фоторецепторов глаза прудовика [7], что позволяет предполагать идентичность пигмента в рецепторах сетчатки и кожи моллюска. Данные о спектральной характеристике одиночных фоторецепторов сетчатки L.stagnalis имеют существенный разброс [14], что объективно связано с технической сложностью длительной внутриклеточной регистрации электрических сигналов этих весьма мелких клеток. Довольно существенным представляется расхождение положения максимума полученной нами спектральной зависимости с тем, что получила Medioni - 520 нм [8]. Причиной этого обстоятельства могло отчасти стать, с одной стороны, применение упомянутым автором в спектральных измерениях интерференционных фильтров с полосой пропускания 15 нм, с другой - выравнивание освещения по энергии, а не по квантовым потокам, что должно было немного «поднять» длинноволновую часть полученной зависимости. Отметим, однако, что спектральная зависимость теневого рефлекса, определенная по измерениям силы двигательного компонента, также сдвинута, хотя и в меньшей степени, в длинноволновую область [9].

Различия значений балльных оценок спектральных кривых интактных и оперированных животных, возможно, проистекают из взаимодействия сенсорных потоков от фоторецепторов сетчатки и кожи. Очевидно, что фоновое освещение возбуждает у интактных животных on-фоторецепторы как глаза [15], так и кожи [6, 16, 17]. Световое раздражение и тех и других рецепторов индуцирует положительный фототаксис [3, 5], который в определенной степени противоположен по своей направленности оборонительному рефлексу. Это взаимодействие, хотя и ослабляется, но полностью не устраняется удалением глаз, что, очевидно, вносит свой вклад в конечное проявление рефлекса. Поэтому более аккуратное определение спектральной характеристики светочувствительного пигмента кожи будет возможно на основании регистрации сенсорных ответов самих фоторецепторов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Stoll C.J. Observations on the ultrastructure of the eye of the basommatophoran snail Lymnaea stagnalis (L.) / C.J. Stoll // Proc.Kon.Ned.Akad.Wet. - 1973. - V. 76C. - P. 414-424.

2. Zylstra U Distribution and ultrastructure of epidermal sensory cells in the freshwater snail Lymnaea stagnalis and Biomphalaria pheifferi / U. Zylstra // Neth. J. of Zool. - 1972. - V. 22. - P. 286-289.

3. Stoll C.J. On the role of eyes and non-ocular light receptors in orientational behaviour of Lymnaea stagnalis / C.J. Stoll // Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. - 1973. -

V. 76C. - P. 204 -214.

4. Fцh H. Der Schattenreflex bei Helix pomatia nebst Bemerkungen ьber den Schattenreflex bei Mytilus edulis, Lymnaea stagnalis und Testuda ibera / H. Fцh // Zool.Jb. - 1932. - H. 52. - S. 1-78.

5. Duivenboden Y.A. Non-ocular photoreceptors and photoorientation in the pond snail Lymnaea stagnalis / Y.A. van Duivenboden // J.Comp.Physiol. - 1982. - V. 149. - P. 362-368.

6. Судоплатов К.А., Жуков В.В. Электрические реакции периферических нервов Lymnaea stagnalis на фотостимуляцию кожной поверхности // Эвол. биохим. физиол. - 1999. - Т. 35. - № 4. - С. 274-280.

7. Жуков В.В., Грибакин Ф.Г. Спектральная чувствительность глаза Lymnaea stagnalis L. и Planorbarius corneus L. в ультрафиолетовой и видимой области спектра // Сенсорные системы. - 1990. - Т. 4. - № 4. - С. 341-350.

8. Medioni J. Etude de la sensibilitй vesuelle de Limnaea stagnalis L. par la mйthode de la rйaction skioptique / Jean Medioni // C.R. Acad. Sci. Paris. - 1958. - V. 152. - P. 840-843.

9. Жуков В.В., Король Е.В. Исследование теневого рефлекса брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis // Эвол. биохим. физиол. - 1994. - Т. 30. - № 2. - С. 198-207.

10. Ваколюк И.А., Жуков В.В. Изучение фоторецепции Lymnaea stagnalis по проявлениям фототаксиса // Эвол. биохим. физиол. - 2000. - Т. 36. - № 5. - С. 419-423.

11.Судоплатов К.А, Сычев А.В. Спектральная характеристика теневого рефлекса у половозрелых особей прудовика обыкновенного (Lymnaea stagnalis L.) // Вестник РГУ им Канта. - 2010. - Вып. 7. - С. 97-102.

12. Stoll C.J. Sensory systems involved in the shadow response of Lymnaea stagnalis, as studied with the use of habituation phenomena / C.J. Stoll // Proc.Kon.Ned.Akad.Wet. - 1972. - V. 75C. - P.342-351.

13. Govardovskii V.I. In search of the visual pigment template / Victor I.Govardovskii, Nanna Fyhrquist, Tom Reuter, Dmitry G. Kuzmin, Kristian Donner // Visual Neuroscience. - 2000. - V. 17. - P. 509-528.

14. Sakakibara M. Electrophysiological responses to light of neurons in the eye and statocyst of Lymnaea stagnalis / Manabu Sakakibara, Tomoyo Aritaka, Akira Iizuka, Hiroyuki Suzuki, Tetsuro Horikoshi, Ken Lukowiak // J.Neurophysiol. - 2005. - V. 93. - P. 493-507.

15. Stoll C.J. Optic nerve activity in Lymnaea stagnalis (L.) to photic stimulation of the eye / C.J. Stoll, A. Bijlsma // Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. - 1973. - V. 76C. - P. 406-413.

16. Stoll C.J. Extraocular photoreception in Lymnaea stagnalis L. / C.J. Stoll // Neurobiology of Invertebrates. Gastropoda Brain Tihany 1975 / Ed. J. Salanki. Budapest: Akad.Kiado, 1976. - V. 4. - P. 487-495.

17. Chono K. Non-ocular dermal photoreception in the pond snail Lymnaea stagnalis / Koji Chono, Yutaka Fujito, Etsuro Ito // Brain Research - 2002 - V. 951. - P. 107-112.

Размещено на Allbest.ru