Антагонистические свойства бактерий, выделенных из листьев капусты

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Растения тесно взаимодействуют с бактериями, обитающими на поверхности вегетативных частей, цветков и плодов. Выделяются следующие типы взаимоотношений бактерий и растений: патогенез, симбиоз и ассоциативность.

Патогенез - такой тип взаимодействия, который включает триединую систему: растение-хозяин, патоген и окружающая среда, частью которой является непатогенная микробиота. Бактериальное сообщество филлопланы различается по количественному и качественному составу как между сообществами различных растений, так и внутри одного вида. Бактериальные популяции филлопланы имеют сельскохозяйственное и экологическое значение, поскольку взаимодействия внутри этих популяций определяют степень, в которой патогены способны колонизировать растительные ткани и впоследствии выживать в данной среде. Теоретически бактерии, населяющие поверхность и сосудистую ткань растений, способны препятствовать проникновению патогена в ткани растения, когда он находится в фазе резидента и, таким образом, сократить распространение патогена на конкретном растении или среди растений [1, 2].

Почти любой этап жизненного цикла патогена или его взаимодействия с растением-хозяином можно прервать или изменить при помощи других непатогенных ассоциантов, которые колонизируют поверхность листьев. Эти непатогенные микроорганизмы, возможно, способны образовывать своеобразный барьер против инфекции, но существует много факторов окружающей среды, которые замедляют и затрудняют развитие бактерий на поверхности растений [3, 4].

Сосудистый бактериоз является одним из самых серьезных заболеваний растений семейства Капустные (Brassicбceae). Заболевание вызывается бактерией Xanthomonas campestris pv. campestris. Источниками заражения являются, как правило, зараженные семена и растительные остатки [5]. Поэтому растения должны быть защищены от поражения болезнью, начиная с момента прорастания. Обработка семян контрольными биологическими агентами может быть полезна в качестве программы интегрированного управления заболеваниями [5, 6].

Микроорганизмы-антагонисты чаще всего были изолированы из отмирающей, пораженной болезнью ткани растения. Другой же подход основан на выделении антагонистов из здоровых тканей растений, что представляет наибольший интерес, так как они способны расти, развиваться и распространяться в здоровом растении [7, 8].

Виды Bacillus имеют особые характеристики, которые делают их хорошими объектами разработки биологических средств защиты растений. К таким характеристикам относятся:

- во-первых, способность производить антибиотические вещества и различные токсины; эта способность является основной при выборе их как биоагентов;

- во-вторых, спорообразование, которое увеличивает жизнеспособность и сохраняемость этих бактерий в окружающей среде;

- в-третьих, Bacillus являются обычными обитателями почв.

Антагонистическая активность чаще всего связана с производством вторичных метаболитов. Большинство антибиотиков, производимых Bacillus spp., были охарактеризованы как дипептиды, или циклические пептиды, с низким молекулярным весом [2, 9, 10]. Фитосанитарный эффект, создаваемый микробными метаболитами, может быть связан с ростостимулирующим действием, увеличением сопротивляемости растения-хозяина болезням либо непосредственным влиянием на возбудителя заболевания. Ко всему прочему, способность бактерий рода Bacillus колонизировать филлоплану растения также считается важной особенностью этих бактерий как агентов биологического контроля и может быть использована против сосудистых патогенов [10, 11].

Биологические методы борьбы с болезнями растений с использованием антагонистических бактериальных агентов довольно успешно тестируются в лабораторных условиях, а некоторые применяются на практике [6, 12, 13]. Для защиты яровой пшеницы, в основном, от грибных болезней создан биофунгицид Бацизулин на основе бактерий из рода Bacillus. Его эффективность составила 56,2-82,4 % и не уступает многим химическим и биологическим протравителям семян [12]. Препарат Гамаир на основе штамма Bacillus subtilis M-22 используется для защиты от широкого спектра возбудителей как бактериальных, так и грибных заболеваний [14]. Препараты группы экстрасол, разработанные Всероссийским НИИ сельскохозяйственной микробиологии ООО «Бисолби-Интер» на основе Bacillus subtilis, в комплексе с другими полезными микроорганизмами может быть использован в качестве биоудобрений, а также против бурой ржавчины, мучнистой росы, снежной плесени, фитофториоза, фузариоза, капустной килы, всевозможных бактериозов, гельминтоспорозов, корневых гнилей и многих других [15].

Цель данной работы: проверка и выявление возможных антагонистических свойств бактерий, изолированных с образцов листьев капусты, по отношению к возбудителю сосудистого бактериоза капусты.

Объектом исследований антагонистических свойств являются бактерии рода Bacillus, изолированные с образцов листьев капусты белокочанной, не зараженной сосудистым бактериозом.

Для выделения бактерий использовали суспензию, полученную путем смыва с поверхности фрагментов листьев капусты белокочанной согласно методике выделения и изучения эпифитных и ризосферных микроорганизмов по Возняковской Ю.М. (1969) [16]. Исследование культурально-морфологических свойств полученных чистых культур проводилось в соответствии с практикумом по микробиологии Нетрусова А.И. и др. (2005) [17]. Морфологические особенности выделенных культур исследовали под микроскопом Axio Imager A1 (Karl Zeiss, Germany). Идентификацию полученных штаммов проводили посредством секвенирования участка гена 16S рРНК (табл. 1).

Таблица 1. Список праймеров, использованных в исследовании

антагонистический метаболит бактериоз капустный

Микробиологические исследования антагонистических свойств по отношению к возбудителю сосудистого бактериоза. Изучение антагонистических свойств проводилось in vitro методом перпендикулярных штрихов [17]. На поверхность плотной агаризованной среды в чашке Петри высевали штрихом культуру исследуемого штамма, возможного биоагента, и инкубировали при температуре 27єС в течение 24 ч. Затем перпендикулярно штрихом подсевали культуру тест-штамма. Чашку вновь инкубировали, но теперь при условиях, благоприятных для роста патогенна, - 25єС, 24 ч. Возможную антагонистическую активность бактерий определяли по наличию зоны ингибирования роста штриха тест-штамма на границе со штрихом роста исследуемого штамма бактерии. Используемая в опыте среда «капустный агар №19»М [16].

Микроcкопирование и фотографирование препаратов бактериальных культур проводилось на микроскопе Axio Imager A1 (Karl Zeiss, Germany). Для проверки антагонистических свойств биоагента на вегетирующих растениях нами была взята за основу методика, описанная Е. Вульф с соавторами [19], с некоторыми изменениями. Для эксперимента использовались семена капусты белокочанной гибрида Триумф F1, который не является устойчивым к черной гнили.

Этапы постановки теста in vivo.

1. Семена были обработаны раствором KMnO4 для поверхностного обеззараживания. Часть семян была отобрана для проращивания отрицательного контроля (К-) при температуре 25єС в термостате на увлажненной фильтровальной бумаге в чашках Петри.

2. Для заражения семян была приготовлена бактериальная суспензия фитопатогена в воде или фосфатном буфере. В опыте использовали инокулюм с титром 2,3х105 КОЕ/мл (определялся путем подсчета колоний при высеве суспензии на питательную среду).

3. Обработка семян проводилась нами в течение 30 мин в суспензии фитопатогена при комнатной температуре с дальнейшим подсушиванием.

4. Часть подсушенных семян была отделена для проращивания положительного контроля (К+) при 25єС в термостате на увлажненной фильтровальной бумаге в чашках Петри.

5. Остальные зараженные семена были подвергнуты обработке антагонистом в шейкере-инкубаторе при 120 об/мин и температуре 10єС в течение 2 ч. Для этого нами проводилось приготовление бактериальной суспензии в воде или фосфатном буфере, концентрация которой составила 8,1*107 КОЕ/мл (определялась путем подсчета колоний при предельных разведениях бактериальной суспензии на питательную среду).

6. Далее семена были подсушены и использованы для проращивания при 25єС в термостате на увлажненной фильтровальной бумаге в чашках Петри.

На 3-й день проращивания определялась энергия прорастания, на 8-й день - всхожесть в соответствии с ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести» [20]. После появления семядольных листьев чашки с проросшими семенами помещались в климатическую камеру, где температура составляла 25єС, а длина периода освещения - не менее 12 ч. Далее проводился подсчет проростков с симптомами сосудистого бактериоза и здоровых.

Статистическая обработка данных проводилась по общепринятым методикам с использованием программ статистического пакета Microsoft Exсel 2007. Тест Краскелла-Уоллиса (непараметрический однофакторный дисперсионный анализ) и попарное сравнение вариантов критерием Манна-Уитни проводились в программе Paleontology statistics PAST.

Результаты.

В результате изучения состава сообщества бактерий филлопланы капусты нами было изолировано большое количество штаммов различных видов бактерий. 83 штамма 25 видов бактерий были проверены на возможные антагонистические свойства к возбудителю сосудистого бактериоза (табл. 2).

Таблица 2. Результаты проверки антагонистических свойств штаммов бактерий, изолированных с образцов листьев капусты

Штамм PS11 Bacillus pumilus (рис. 1) был изолирован с образцов 3-го слоя кроющих листьев капусты белокочанной сорта Слава 1305. Изолированная нами чистая бактериальная культура была идентифицирована посредством секвенирования участка гена 16S рРНК до уровня вида. Полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в генбанк NCBI. Шифр данных в базе данных генбанка - KM434863.

Рис. 1 Фиксированный окрашенный препарат штамма PS11 Bacillus pumilus

При тестировании методом перпендикулярных штрихов PS11 показал наличие небольших зон ингибирования роста фитопатогена. Согласно данным Е. Вульфа с соавторами [19], бактерии вида Bacillus pumilus, вполне вероятно, способны к эндофитному существованию и могут играть роль в биологической борьбе с сосудистыми патогенами растений. На рис. 2 представлена фотография теста на антагонистическую активность штамма PS11 B. pumilus.

Размер зон ингибирования роста патогена может зависеть от толщины слоя агаровой среды. Для оценки антагонистического действия филлобактерий при использовании данного метода учитывали, что он дает преимущество штаммам, продуцирующим ингибиторные соединения небольшой молекулярной массы, которые быстрее диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно, дают зоны ингибирования роста тест-культуры большего размера. Существенный недостаток данного метода - продуцент антибиотического вещества и тест-организм выращивают на одной среде, хотя не всегда одна и та же питательная среда равнозначно благоприятна как для биоагента и образования им ингибирующего вещества, так и для роста тест-культуры.

Рис. 2. Тест на антагонистические свойства по отношению к Xanthomonas campestris pv. campestris штамма PS11 B. pumilus

На рис. 3 (А, Б, В) представлены фотографии проростков семян капусты после обработки возбудителем сосудистого бактериоза Xanthomonas campestris pv. campestris, а затем биоагентом Bacillus pumilus PS11.

Отрицательный контроль, семена, не обработанные патогеном и антагонистом, обладали высокой всхожестью, симптомы выявлены не были. На рис. 3А видно, что ростки семян К- имеют хорошо развитые семядольные листочки и корешки. У большинства семян, обработанных антагонистом в концентрации 106 КОЕ/мл (рис. 3Б), не поврежден корешок, хорошо развиты семядольные листья. По результатам определения всхожести было выявлено снижение данного параметра у обработанных антагонистом зараженных семян по сравнению с отрицательным контролем. Снижение всхожести, скорее всего, связано с двукратными обработками бактериальными суспензиями. Тем не менее, всхожесть обработанных семян значительно выше зараженных сосудистым бактериозом проростков. На рис. 3В представлено фото проростков зараженных семян. Практически у всех проросших семян поврежден корешок, очень много сгнивших ростков и не проросших семян.

Рис. 3. Проростки семян капусты гибрида Триумф F1: А - отрицательный контроль заражения, К-. Б - проростки зараженных семян, обработанных антагонистом Bacillus pumilus штамм PS11. В - Положительный контроль заражения, К+

Данные определения всхожести семян, обработанных различными концентрациями биоагента штамма PS11, положительного и отрицательного контролей представлены в виде графика (рис. 4).

Рис. 4. Всхожесть семян капусты гибрида Триумф F1 в зависимости от концентрации обработки антагонистом

Средняя всхожесть семян, обработанных антагонистом в концентрации 107 КОЕ/мл, составила 70±1,15%, 104 и 103 КОЕ/мл составила 68±2,96% и 61±4,70%, в то время как всхожесть семян положительного контроля заражения составила 56±6,32%, что ниже показателей вариантов обработки семян патогеном и антагонистом. Анализ данных показал положительную тенденцию влияния на всхожесть зараженных семян вариантов обработки 105 и 106 КОЕ/мл, которая при этом составила 82±2,31% и 82±1,03%. Это довольно близко к всхожести семян, не проходивших обработку патогеном и антагонистом, то есть отрицательного контроля заражения. Всхожесть данных семян составила 98,7±1,33%. Таким образом, концентрации бактерий штамма PS11 105 и 106 КОЕ/мл в некоторой степени способствуют поддержанию всхожести семян после двукратных обработок бактериальными суспензиями на уровне, приближенном к показателям всхожести ничем не обработанных семян.

Подсчет количества зараженных проростков показал статистически значимые отличия между вариантами концентраций биоагента и положительным контролем заражения. Данные представлены на рис. 5.

Процент зараженных проростков в вариантах 107, 106 и 104 КОЕ/мл составил 22±1,15%. При концентрации 105 КОЕ/мл зараженность взошедших проростков составила 23±2,52%, при 103 КОЕ/мл - 19±0,89%. При этом средняя зараженность проростков семян К+ равна 49,75±7,19%, что практически в 2 раза превышает количество зараженных ростков в других вариантах.

Рис. 5. Процент зараженных проростков при обработке семян различными концентрациями бактерий штамма PS11

Полученные данные опыта наглядно иллюстрирует рис. 6.

Рис. 6. Соотношение невзошедших, незараженных и зараженных проростков семян капусты

Так как семена К- показали практически 100%-ную всхожесть и отсутствие симптомов поражения сосудистым бактериозом, то, следовательно, семена, прошедшие двукратную обработку бактериями, могут терять всхожесть не только из-за этих обработок, но также и вследствие заражения. Использование концентраций 106 и 105 КОЕ/мл дает наиболее низкое количество невзошедших семян. Подобные отличия видны и по количеству незараженных и зараженных ростков. Таким образом, они являются наиболее оптимальными для дальнейших исследований.

В результате изучения биоразнообразия бактериального сообщества филлопланы капусты белокочанной нами было изолировано и идентифицировано 83 штамма бактерий, относящихся к 25 видам. Проверка антагонистической способности полученных чистых культур в отношении возбудителя сосудистого бактериоза капусты методом перпендикулярных штрихов показала, что только один штамм, PS11 Bacillus pumilus, подавлял развитие Xanthomonas campestris pv. campestris. Тестирование штамма PS11 Bacillus pumilus in vivo на предварительно зараженных и пророщенных семенах капусты, показало, что у обработанных данным биоагентом зараженных семян повышалась всхожесть, количество проростков с симптомами бактериоза было ниже, нежели у положительного контроля. Установлено, что оптимальным для обработки семян является инокуллюм с титром 106 и 105 КОЕ/м, Всхожесть семян, обработанных данными концентрациями, составила 82±2,31% и 82±1,03%, а положительного контроля - 56±6,32%.

Полученные данные показывают, что данный микроорганизм является перспективным в области разработки средств биологической защиты растений и требует дальнейших исследований и испытаний.

Литература

1. Hirano S.S., Upper C.D. Dynamics, spread, and persistence of a single genotype of Pseudomonas syringae relative to those of its conspecifics on populations of snap bean leaflets // Applied Environmental Microbiology. - 1993, No54. - P. 1082-91.

2. Leben C. Epiphytic Microorganisms in relation to plant disease // Annual Review of Phytopathology. - 1965, No3.- Р. 209-230.

3. Blackman J.P., Brodie I.D. Competition for nutrients between epiphytic microorganisms and germination of spores of plant pathogens on beetroot leaves // Physiological Plant Pathology. - 1977, No10. - Р. 29-42.

4. Blakeman J.P. Pathogens in the foliar environment // Plant Pathology. - 1993, No42. - P. 472-493.

5. Джалилов Ф.С., Во Тхи Нгок Ха. Защита капусты от болезней в период вегетации // Картофель и овощи. - 2014, №1. - С. 20-23.

6. Алексеева А.С., Артамонова М.Н., Потатуркина-Нестерова Н.И. Антагонистическая активность растительно-бактериальных ассоциантов // Фундаментальные исследования. - 2013, №11. - С. 929-932.

7. Adetuyi F.C., Cartwright W. Studies of the antagonistic activities of bacteria endemic to cereal seeds // Annals of Applied Biology. - 1985, No107. - P. 33-43.

8. Приходько С.И., Селицкая О.В. Исследование качественного состава эпифитных микроорганизмов некоторых культурных и сорных растений Тамбовской и Московской областей // Агрохимический вестник. - 2014, №3. - С. 12-15.

9. Bacon C.W., Hinton D.M. Endophytic and biological control potential of Bacillus mojavensis and related species // Biological Control. - 2002, No23. - Р. 274-284.

10. Leifert C., Li H., Chidburee S., et. al. Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillus subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45 // Journal of Applied Bacteriology. - 1995, No78. - P. 97-108.

11. Agarry O.O., Akinyosoye F.A., Adetuyi F.C. Antagonistic properties of microogranisms associated with cassava (Manihot esculenta, Crantz) products // African Journal of Biotechnology. - 2005, No4. - P. 627-632.

12. Захарова Н.Г., Сираева З.Ю. Эффективность биопрепарата бацизулин в защите яровой пшеницы от болезней // Ученые записки Казанского университета. Серия: естественные науки. - 2006, №3. - С. 89-98.

13. Коломиец Э.И., Кильчевская О.С., Купцов В.Н. и др. Бактерии-антагонисты как агенты биологического контроля кагатной гнили сахарной свеклы. - Минск: Сб. науч. трудов Микробные биотехнологии: Фундаментальные и прикладные аспекты. - 2007. - С. 67-68.

14. Новикова Н.И., Шенин Ю.Д. Выделение, идентификация и антигрибная активность метаболитов комплекса гамаир, образуемого штаммом Bacillus subtilis М-22 - продуцентом биопрепарата для защиты растений от микозов и бактериозов // Биотехнология. - 2011, №2. - С. 45.

15. Фатина П.Н. Применение микробиологичсеких препаратов в сельском хозяйстве // Вестник Астраханского государственного технического университета. - 2007, №4. - С. 133-136.

16. Некоторые новые методы количественного учета почвенных микроорганизмов и изучения их свойств: методические рекомендации Под ред. Ю.М.Возняковской. -Л.: ВНИИСХМ. - 1987. - 54 с.

17. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. - М.:Изд-во «Академия». - 2005. - 571 с.

18. Wulff E.G., Mguni C.M., Mansfeld-Giese K., Fels J., Lьbeck M., Hockenhull J. Biochemical and molecular characterization of Bacillus amyloliquefaciens, B. subtilis and B. pumilus isolates with distinct antagonistic potential against Xanthomonas campestris pv. Campestris // Plant Pathology. - 2002, No51. - Р. 574-584.

19. ГОСТ 12038-84 «Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения всхожести».

Размещено на Allbest.ru