Биоконверсия отходов лесопереработки ксилотрофным базидиомицетом Pleurotus Eryngii (DC.) Quél

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биоконверсия отходов лесопереработки ксилотрофным базидиомицетом Pleurotus Eryngii (DC.) Quйl

Павлов И.Н.,

Литовка Ю.А.,

Мулява В.В.,

Сафронова И.Е.,

Кулаков С.С.,

Пашенова Н.В.,

Мулява В.Е.

Аннотация

Установленная в результате многолетних исследований и опытно-производственного культивирования высокая способность штамма Р 22 Pleurotus eryngii успешно колонизировать различные растительные субстраты позволяет использовать отходы лесопереработки без тщательного разделения по породам, но с обязательным добавлением некондиционного зерна (пшеница, овес) и хвои после извлечения масел. В результате серии многофакторных дисперсионных анализов установлено значительное влияние на скорость зарастания субстратного блока и продуктивность следующих параметров: наличие в субстрате оптимального соотношения мелких и крупных фракций древесины (Р<0,001); своевременная перфорация пакетов, обеспечивающая оптимизацию концентрации СО 2 в блоке (Р<0,001); наличие в ростовом субстрате хвои сосны сибирской после экстракции масел перегретым водяным паром (Р<0,01), пихты (Р<0,001), березы (Р<0,001), осины (Р<0,001). Выполнены оптимизация ростовых субстратов (по составу и структуре) для получения плодовых тел штамма Р 22 P.eryngii в течение двух волн плодоношения, а также условий его культивирования по интенсивной технологии в условиях арочной пленочной теплицы (в контролируемых условиях) на растительных отходах лесопереработки, включающей древесину хвойных пород и хвою после экстракции масел перегретым водяным паром. Минимальная длительность зарастания субстратных блоков (23 сут.) достигнута на пихтовом субстрате и березовом с добавлением древесины пихты.

Ключевые слова: биоконверсия лигноцеллюлозных субстратов, дереворазрушающие грибы, pleurotus eryngii, оптимизация состава субстрата, биологическая эффективность

Огромное количество неиспользуемых отходов лесозаготовки и лесопереработки, наряду со снижением экономической эффективности лесного комплекса, ведет к захламлению территорий и повышению пожарной опасности. При этом все эти так называемые отходы (хвоя, мелкие и крупные ветви, опилки и пр.) обладают высоким питательным ресурсом для дереворазрушающих грибов, позволяющим при их интенсивном культивировании решить существующую проблему дефицита кормового и пищевого белка. Биоконверсия лигноцеллюлозных субстратов с использованием съедобных базидиомицетов является одним из перспективных биотехнологических направлений, позволяющих эффективно совмещать технологии утилизации растительных отходов лесопереработки и получения кормовых и пищевых продуктов. Плодовые тела съедобных грибов являются высококачественным продуктом питания, а отработанные субстратные блоки с ферментированным субстратом и мицелиальной биомассой могут быть использованы в качестве кормовой добавки и удобрений. Применение в качестве субстрата древесины из удаленных от промышленных центров районов гарантирует высокую экологическую чистоту получаемого продукта.

Основным объектом данного исследования послужил штамм Р 22 Pleurotus eryngii (DC.) Quйl., предварительно отобранный по ростовым параметрам в ходе твердофазной ферментации растительных отходов лесопереработки в лабораторных условиях. Несмотря на то, что он относится к роду Pleurotus, технология выращивания, трудоемкость и особые требования к культуре производства отличают еринги от других представителей этого рода. В то же время все трудности выращивания компенсируются особыми вкусовыми качествами и полезными свойствами гриба. К настоящему времени изучены особенности роста P.eryngii на отходах сельскохозяйственного производства и древесине лиственных пород [1-8]. Однако остается малоизученным вопрос его эффективного культивирования на отходах лесопереработки, включающих древесину хвойных пород, в том числе с использованием хвои после извлечения масел.

Для оценки продуктивности и биологической эффективности штаммов P.eryngii осуществляли их твердофазное культивирование на растительных отходах при влажности субстратов 68-70 %, температуре 22±1 оС в течение 20 суток с последующим определением ростовых характеристик. На 7, 14 и 21-е сутки эксперимента оценивали диаметр, плотность колонии и высоту мицелия для расчета среднесуточной радиальной скорости роста и ростового коэффициента [9, 10].

Проведенные исследования показали, что все изученные нами штаммы способны колонизировать растительные отходы, однако ростовые параметры существенно отличались как между штаммами P.eryngii, так и между используемыми субстратами. Максимальными показателями среднесуточной скорости роста характеризуется штамм Р 22 на всех изученных растительных субстратах. Диапазон радиальной скорости роста составил 0,6-2,3 мм/сут. Максимальный показатель отмечен на опилках осины с пшеничными отрубями (4:1); относительно высокая скорость роста - на опилках осины, березы и хвое кедра - 1,1; 1,2 и 1,5 мм/сут., соответственно.

Радиальная скорость роста не является единственным ростовым показателем при оценке способности гриба колонизировать субстрат. Не менее важной характеристикой является ростовой коэффициент (РК), который свидетельствует об адаптации штамма к конкретной питательной среде. Штаммы, имеющие ростовой коэффициент менее 50, относят к медленнорастущим, 50-100 - к среднерастущим, более 100 - к быстрорастущим [9]. Значения ростового коэффициента свидетельствуют, что штамм Р 22 P.eryngii является среднерастущим только на опилках осины с отрубями (РК = 87), на остальных субстратах - медленнорастущим (РК = 15-47), однако на опилках березы и хвое кедра этот показатель был выше (РК > 40).

Исследование роста штамма Р 22 при различных температурах позволило установить, что оптимум находится в диапазоне 23-28 оС. Культура формирует относительно плотную колонию, тогда как при увеличении температуры до 30-32 оС колония более рыхлая, скорость роста замедляется; на поверхности колонии появляется экссудат коричневого цвета.

Субстраты растительного происхождения, в частности, древесина, бедны питательными веществами, особенно азотом, что замедляет скорость колонизации субстрата мицелием, снижает урожайность плодовых тел и биологическую эффективность, увеличивая при этом продолжительность культивирования. В связи с этим на следующем этапе оценили возможность увеличения скорости роста штамма Р 22 P.eryngii на медленно колонизируемом субстрате (щепа пихты мелкая) при использовании различных концентраций аммонийных солей. Проведенное исследование показало, что применение 1%-го раствора (NH4)2SO4 увеличивает радиальную скорость роста штамма Р 22 в 2,3-3,2 раза по сравнению с контролем (необработанная щепа) в течение изучаемого периода. Добавление соли в концентрации 3% не оказало достоверного влияния на скорость роста; концентрации 5 и 10 % существенно ингибировали рост мицелия. Аналогичная тенденция отмечена при использовании растворов NH4NO3: внесение соли в 1%-ой концентрации увеличивало линейную скорость роста в 1,6-2 раза по сравнению с контролем; в 3%-ой концентрации не оказало достоверного влияния; растворы с концентрацией 5 и 10 % ингибировали ростовые процессы гриба.

Одним из перспективных направлений современного грибоводства следует считать получение посевного мицелия при глубинном культивировании исходного штамма на жидкой питательной среде. В связи с этим было проведено предварительное исследование возможности культивирования штамма Р 22 P.eryngii на жидких средах на роторной качалке с вращательным движением до 150 оборотов в минуту. В качестве питательных сред использовали синтетические среды с различным солевым составом: Норкранс (глюкоза - 10 г, (NH4)2C4H4O6 - 1 г, KH2PO4 - 1 г, MgSO4x7H2O - 0,5 г, FeC6H5O7 - 5 мг, ZnSO4x7H2O - 4,4 мг, MnSO4 - 5 мг, CaCl2 - 55,5 мг, витамин B1 - 40 мг, вода - 1 л) и среда Чапека (глюкоза - 30 г, NaNO3 - 3 г, MgSO4 - 0,5 г, FeSO4 - 0,01 г, KH2PO4 - 1 г, KCl - 0,5 г, вода - 1 л). В качестве инокулюма применяли агаровые блоки диаметром 13 мм (из расчета 5 шт. на колбу объемом 250 мл), вырезанные пробойным сверлом из краевой зоны 14-тисуточной колонии.

Установлено, что при глубинном периодическом культивировании в условиях постоянного перемешивания штамм Р 22 растёт в толще питательной среды в виде аморфных микроколоний с бахромчатым краем округлой или неправильной формы диаметром 1-7 мм. Отсутствует дифференциация мицелия на субстратный и воздушный, мицелиальная пленка не образуется. Продуктивность биомассы и скорость ее накопления была существенно выше на среде Норкранс, что, вероятно, обусловлено особенностями ее химического состава. Проведенное исследование доказывает возможность получения посевного инокулюма в глубинной культуре, однако требует дальнейшего всестороннего исследования.

Для отработки технологии получения плодовых тел P. eryngii на растительных отходах лесопереработки и оптимизации состава субстрата осуществили весь технологический цикл от инокуляции до сбора второй волны урожая в пленочных арочных теплицах (рис. 1). Теплицы находились на первом этаже производственного здания с остекленным фасадом; в них были размещены четырёхъярусные стеллажи для субстратных блоков и созданы параметры микроклимата, близкие к оптимальным для каждой фазы роста гриба. Для снижения вероятности заражения блоков осуществлялась непрерывная подача воздуха, очищенного через систему фильтрации, в теплицы с высоты 10 м над уровнем земли.

Рис. 1. Стеллажи с субстратными блоками для культивирования Pleurotus eryngii в пленочной арочной теплице

В качестве емкостей для ростового субстрата использовали цилиндрические пакеты размером 20х 40 см из полипропилена низкого давления (рис. 1, 2) и контейнеры из плотного термостойкого пластика. Основной ростовой субстрат - отходы лесопромышленного и сельскохозяйственного комплексов: березовые опилки, мелкие (Бм); березовая щепа, крупная 20Ч10Ч3 мм (Бк); осиновые опилки, мелкие (Ом); осиновая щепа, крупная 20Ч10Ч3 мм (Ок); сосновые опилки, мелкие (См); сосновая щепа, крупная 20Ч10Ч3 мм (Ск); пихтовые опилки из сухостоя в очагах усыхания (Пм); пихтовая щепа, крупная 20Ч10Ч3 мм (Пк); кедровая хвоя после экстракции масел перегретым водяным паром (Кхв); кедровая хвоя после микроволнового экстрагирования масел (Кхв мкв); пшеница (П).

Растительное сырье предварительно увлажняли при температуре воздуха 22-24 оС путем замачивания в водопроводной отфильтрованной (с удалением хлора) воде в течение 24 ч в соотношении вода:субстрат = 2:1. Влажность субстрата после отжима на центрифуге перед формированием субстратных блоков находилась в пределах 65-70 %.

Одним из важнейших параметров, определяющих скорость колонизации субстрата и урожайность грибов, является кислотность. Кислотность, близкая к оптимальной, способствует увеличению селективности субстрата, созданию физических, химических и биологических условий, способствующих развитию мицелия P.eryngii и ограничению развития конкурентных микроорганизмов. Значение рН компонентов субстрата варьировало в пределах 5,3-7,5. Стерилизации сопровождалась снижением рН на 0,4-1,0 ед.

Для оптимизации рН и создания благоприятной среды для последующей колонизации растительных субстратов культурой P.eryngii при замачивании древесины и хвои использовалась свежеприготовленная гашеная известь (1%) и молотый мел (1%). При завершении культивирования повторно была исследована кислотность субстратных блоков. В среднем значение pH составило 6,1 (5,5-6,9). При этом максимальная урожайность отмечена при pH 5,8-6,1.

Формирование блоков было выполнено на специальной установке, обеспечивающей равномерное перемешивание субстрата и его оптимальную плотность. Стерилизация субстрата осуществлялась в течение 1 часа при температуре 120 оС и давлении 1 атм.

По основным компонентам субстрата был поставлен полный факторный эксперимент, позволяющий оценить действие изолированных факторов и размеры взаимодействия между ними путем различной группировки данных [11]. Всего было сформировано 143 варианта компоновки субстратов, которые различались по количеству составляющих (двух- - пятикомпонентные формулы) и соотношению отдельных компонентов с обязательным присутствием 20% пшеничных отрубей или овса. Толщина готового блока составила в среднем 15 см; вес после замачивания - 1400-2000 г. В качестве посевного инокулюма использовали зерновой мицелий собственного производства из расчета 125 г на блок.

Оптимальная температура колонизации субстратных блоков штаммом Р 22 составила +25 оС. При остановке роста мицелия осуществлялась перфорация пакетов и установка трубок с фильтрами (рис. 2 А, Б). Высокая концентрация СО 2 способствовала подавлению роста патогенных микроорганизмов, попадающих через микротрещины пакетов. Инкубация в полипропиленовых пакетах исключает необходимость поддержании высокой влажности в помещении. Необходимость в освещении на этом этапе отсутствовала.

Рис. 2. Субстратные блоки от этапа инкубации до плодообразования штамма Р 22 Pleurotus eryngii

Условия стимулирования образования примордиев: разрезание пакета вдоль; понижение температуры до +14 - +15 оС; концентрация - СО 2 500-1000 ppm.; относительная влажность воздуха - 95-100 %; освещенность - 300-400 люкс. В большинстве случаев массовое образование примордиев происходило достаточно быстро: в течение 4-7 сут. Образующееся огромное количество примордиев (рис. 2 В) часто рекомендуют своевременно прореживать (тримминг), оставляя несколько наиболее крупных зародышей. Однако, с нашей точки зрения, кроме высокой трудоемкости, это ведет к снижению общей продуктивности и повышает вероятность инфицирования блоков. Изначально образующиеся крупные примордии сохраняют лидерство и обеспечивают формирование крупных плодовых тел (рис. 2 Г).

Условия для роста в камере плодоношения: температура - +15-+16 оС; освещенность - 200-300 люкс; относительная влажность воздуха - 85-95 %. При более высокой температуре формируются рыхлые, подверженные заболеваниям плодовые тела.

Для понимания важности освещения для формирования плодовых тел был поставлен простой эксперимент. После образования примордиев половина блока была укрыта светонепроницаемой пленкой (рис. 3 А), в результате чего процесс плодообразования не только остановился, но и не возобновился после удаления пленки (рис. 3 Б, В). С увеличением интенсивности освещенности плодовые тела приобретали более темную окраску (рис. 3 Г).

Рис. 3. Влияние интенсивности освещения на формирование плодовых тел у штамма Р 22 Pleurotus eryngii

Особое внимание на этапе плодообразования следует уделять влажности воздуха. Необходимо исключить образование конденсата на потолке культивационного помещения и попадание крупных капель воды на плодовые тела, что практически всегда вызывает развитие бактериоза. За сутки до сбора урожая необходимо понизить влажность воздуха до 80-85 %, что значительно увеличивает срок хранения урожая. Сбор плодовых тел для получения наиболее деликатесных грибов следует производить через 5-9 сут., когда шляпка начинает слегка утолщаться. Исключение тримминга позволило нам осуществлять сбор в 2-3 этапа по мере подрастания плодовых тел во время первой волны плодоношения.

Формирование второй волны плодоношения начиналось с замачивания субстратных блоков в воде в течение суток. Далее следовал этап инкубации при температуре +25 оС и относительной влажности воздуха 100% в течение 7-10 суток (рис. 4 А, Б); стимулирование образования примордиев, как и в случае первой волны, и далее - плодообразование (рис. 4 В).

Рис. 4. Инициация второй волны плодоношения штамма Р 22 Pleurotus eryngii и внешний вид отработанного субстратного блока

В результате серии многофакторных дисперсионных анализов установлено значительное влияние на продуктивность и скорость зарастания субстратного блока следующих параметров: наличие в субстрате оптимального соотношения мелких и крупных фракций древесины (Р<0,001); своевременная перфорация пакетов, обеспечивающая оптимизацию концентрации СО 2 в блоке (Р<0,001); наличие в ростовом субстрате хвои сосны сибирской после экстракции масел перегретым водяным паром (Р<0,01), пихты (Р<0,001), березы (Р<0,001), осины (Р<0,001). Минимальная длительность зарастания субстратных блоков (23 суток) отмечена на пихтовом субстрате и березовом с добавлением древесины пихты (рис. 5).

Биологическая эффективность (БЭ) является одним из основных критериев при разработке промышленной формулы ростового субстрата, особенно при использовании трудногидролизуемых древесных отходов. Максимальная биологическая эффективность была характерна для субстратов с преобладанием березовой (БЭ =70%), пихтовой (БЭ = 60%), осиновой (БЭ = 68%) древесины и добавлением хвои кедра после экстракции масел перегретым водяным паром в количестве 10-30 %.

Рис. 5. Биометрическая характеристика роста P.eryngii при интенсивном культивировании на различном ростовом субстрате

(а - блок №5, пихтовые опилки из сухостоя в очагах усыхания (Пм) 50% : пихтовая щепа, крупная (Пк) 30% : пшеница (П) 20%; б - блок №84, березовые опилки, мелкие (Бм) 30% : березовая щепа, крупная (Бк) 30% : Пм 10%: Пк 10% : П 20%; в - блок №44, Пк 20% : осиновые опилки, мелкие (Ом) 30% : кедровая хвоя после экстракции масел перегретым водяным паром (Кхв) 30% : П 20%; г - блок №30, Ом 50% : Кхв 30% : П 20%;

д - блок №55, Бм 60% : Бк 10% : Кхв 10% : П 20%;

е - блок №46, Пк 40% : Ом 10% : Кхв 30% : П 20%)

(1 - вставили трубку с фильтром диаметром 15 мм; 2 - добавили 40 мл воды; 3 - разрез вдоль пакета; 4 - замочили блок в воде, впиталось 40 мл воды; 5 - удалили с блока плёнку; 6 - зарастание блока мицелием гриба, верх, %; 7 - зарастание блока мицелием гриба, низ, %;

8 - урожайность грибов, г; 9 - вставили трубку с фильтром диаметром 100 мм) субстрат древесина хвоя

Наличие в составе мелкой фракции древесины сосны обыкновенной (30-35 %) сопровождалось удлинением периода зарастания и некоторым снижением продуктивности. При этом наличие крупной фракции сосны (щепа) до 30% не приводила к снижению продуктивности, лишь незначительно увеличивая период зарастания блока. В целом наличие крупной фракции древесины пихты, березы, осины обеспечивает оптимальную структуру субстрата. Однако чрезмерное увеличение количества щепы (более 60%) ведет к снижению урожайности грибов.

Высокое содержание СО 2 обеспечивало конкурентные преимущества для дереворазрушающих грибов (в нашем случае P.eryngii) относительно грибов Trichoderma sp. и Penicillium sp., в связи с чем не следует спешить с перфорацией пакетов. Отмечаемая в ряде случаев остановка роста своевременно устранялась установкой дополнительных трубок с фильтрами (см. рис. 2 Б) или обычной перфорацией пакета. Наиболее быстрое зарастание блоков происходило в верхней его части за счет большего количества посевного мицелия, что обеспечивало уверенную защиту всего блока от конкурентной микрофлоры.

В целом, проведенное исследование позволило подобрать наиболее благоприятные ростовые субстраты (по составу и структуре) для получения плодовых тел штамма Р 22 P.eryngii в течение двух волн плодоношения, а также условия его культивирования по интенсивной технологии в арочной пленочной теплице на растительных отходах лесопереработки, включающей древесину хвойных пород и хвою после экстракции масел перегретым водяным паром. Установленная высокая способность штамма Р 22 P.eryngii успешно произрастать на различных субстратах позволяет использовать отходы лесопереработки без тщательного разделения по породам, но с обязательным добавлением некондиционного зерна (пшеница, овес) и хвои после извлечения масел. При этом содержание древесины со смоляными ходами (сосна, ель, лиственница и др.) не должно превышать 30%. Учитывая породную структуру наших лесов, получить оптимальное соотношение при комплексной переработке древесины не представляется сложным. Хорошо развитая мицелиальная масса (рис. 4 Г) и, как следствие, достаточно высокое остаточное содержание белка в субстратном блоке после двукратного среза грибов позволяет использовать ферментированный субстрат после измельчения в качестве кормовой добавки.

Список использованных источников

1. Hwang S. G., Li Y. Y., Lin H. L. The Use of Sawdust Mixed with Ground Branches Pruned from Wax Apple or Indian Jujube as Substrate for Cultivation of King Oyster Mushroom (Pleurotus eryngii) //HortScience. - 2015. - Т. 50. - №. 8. - С. 1230-1233.

2. Kim H. S. Kim, S. C., Cheong, J. C., & Cho, S. J. Effect of the supplementation of persimmon peels on mycelial growth of Pleurotus eryngii //Journal of Mushroom. - 2014. - Т. 12. - №. 4. - С. 371-374.

3. Kirbag S., Akyьz M. Evaluation of agricultural wastes for the cultivation of Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel. var. ferulae Lanzi. African Journal of Biotechnology. - 2008, 7(20). - PP. 3660-3664.

4. Li W., Li, X., Yang, Y., Zhou, F., Liu, Y., Zhou, S., & Yu, H. Effects of different carbon sources and C/N values on nonvolatile taste components of Pleurotus eryngii //International Journal of Food Science & Technology. - 2015. - Т. 50. - N 11. - С. 2360-2366.

5. Moonmoon M., Uddin M. N., Ahmed S., Shelly N. J., Khan M. A. Cultivation of different strains of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) on saw dust and rice straw in Bangladesh. Saudi Journal of Biological Sciences. - 2010, 17(4). - PP. 341-345.

6. Ohga S., Royse D. J. Cultivation of Pleurotus eryngii on umbrella plant (Cyperus alternifolius) substrate. Journal of Wood Science. - 2004, 50(5). - PP. 466-469.

7. Xie C. et al. Effects of Different Substrates on Lignocellulosic Enzyme Expression, Enzyme Activity, Substrate Utilization and Biological Efficiency of Pleurotus eryngii //Cellular Physiology and Biochemistry. - 2016. - Т. 39. - №. 4. - С. 1479-1494.

8. Zadrazil F. The ecology and industrial production of Pleurotus ostroatus, Pleurotus florida, Pleurotus cornucopiae and Pleurotus eryngii //Proceedings of the ninth international scientific congress on the cultivation of edible fungi. - Tokyo. - 1974. - PP. 621-652.

9. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. - Киев: Наукова думка. - 1983. - 144 с.

10. Методы экспериментальной микологии / под ред. В.И. Билай. - Киев: Наукова думка. - 1982. - 550 с.

11. Любищев А.А. Дисперсионный анализ в биологии. - М.: Изд-во Моск. ун-та. - 1986. - 200 с.

Размещено на Allbest.ru