Размещено на http://www.allbest.ru/

РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

ИЦ «ФитоИнженерия»

Российский университет дружбы народов

Воздействие бактериального симбионта Cardinium на репродуктивные свойства обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae)

Коноплёв Н.Д., Попов С.Я., Игнатов А.Н.

Аннотация

клещ зараженный популяция симбионт

Один из наиболее значимых сельскохозяйственных вредителей, обыкновенный паутинный клещ (Tetranychus urticae), может выступать в качестве носителя эндосимбиотической бактерии “Candidatus Cardinium hertigii”. Проведена оценка репродуктивных отклонений при скрещивании особей двух линий T. urticae: зараженной бактерией и незараженной (освобожденной от симбионта с помощью ампициллина; проведена проверка при помощи ПЦР). Найдена связь заражения Cardinium c изменением демографической структуры популяции хозяина: появление части самок, неспособных откладывать яйца, смещение соотношения полов в потомстве заражённых самок в сторону самок, что при недостатке самцов может привести к снижению численности популяции, а также снижение плодовитости клещей в варианте с зараженной самкой и незараженным самцом.

Ключевые слова: tetranychidae, tetranychus urticae, cardinium, симбионт, репродуктивные отклонения

Введение

В последние 20 лет большой интерес вызывают экологические связи фитофагов - членистоногих с внутриклеточными бактериями. В частности, известно о существовании эндосимбиотических бактерий, оказывающих воздействие на репродукцию, демографическую структуру, пищевую избирательность, поведение и устойчивость к стрессовым факторам хозяев [1-5].

Одними из наиболее значимых вредителей сельскохозяйственных растений являются паутинные клещи, и среди них - массовый вид, распространенный повсеместно, - обыкновенный паутинный клещ (Tetranychus urticae Koch, 1836). На данный момент известно о возможности заражения паутинных клещей рода Tetranychus такими распространёнными симбионтами членистоногих, как “Candidatus Cardinium hertigii” (чаще упоминается как Cardinium) и Wolbachia pipientis (чаще упоминается как Wolbachia) - внутриклеточными бактериями, наследуемыми с цитоплазмой с материнской стороны, которые могут нарушать нормальный ход репродукции их хозяев, вызывая цитоплазматическую несовместимость, смертность самцов, явления партеногенеза и феминизации и за счет этого изменять демографическую структуру хозяев [6; 7].

Было отмечено, что цитоплазматическая несовместимость позволяет бактериям Cardinium и Wolbachia заселять и сохраняться в популяциях паутинных клещей, вызывая репродуктивную изоляцию между популяциями, что приводит к снижению общей численности хозяев и усилению внутривидовой дифференциации [3; 8; 9].

Ранее нами был проведён скрининг массовых видов паутинных клещей рода Tetranychus на наличие экологических связей с рядом бактериальных симбионтов, показавший присутствие бактерий Cardinium в особях пяти из семи исследуемых популяций [10]. При этом на культивируемых нами паутинных клещах были выявлены также представители других родов бактерий: Erwinia amylovora (фитопатоген), Ralstonia pickettii (условно-патогенная для человека бактерия), Serratia proteamaculans (факультативный патоген человека и растений), Yersinia aldovae (свободноживущая бактерия), Haemophilus paraphrohaemolyticus (патоген человека) и Pseudomonas fragi (сапрофит). В связи с этим была поставлена цель: оценить воздействие бактерий Cardinium на репродуктивные свойства паутинных клещей на примере одной из популяций T. urticae.

Объекты и методы

В качестве объекта исследования служил обыкновенный паутинный клещ Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae). Популяция была первоначально отобрана с кирказона (Aristolochia sp.) в двух километрах от г. Новоаннинского Волгоградской области, на опушке леса по левой стороне реки Бузулук, и культивировалась на кафедре защиты растений РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева. Маточная колония содержалась на срезанных листьях фасоли обыкновенной, помещенных на ватные колобки в кюветах с водой при температуре 20-22 °C, относительной влажности 70±10 % и фотопериоде (L:D) - 16:8 ч.

Наличие связи клещей этой популяции с симбионтами рода Cardinium было установлено при помощи ПЦР анализа с использованием родоспецифичных для симбионта праймеров, секвенированием полученных продуктов и последующим филогенетическим анализом [10].

Получение свободных от симбионтов особей паутинных клещей

Освобождение паутинных клещей от симбионтов проводилось в пластиковых ванночках: небольшие высечки (7 см2) из листьев фасоли помещались на ватные колобки, пропитанные раствором ампициллина (0,1%, ОАО «Биохимик», Россия). По прошествии суток нимфы и молодые имаго помещались на листовые высечки. Замена листовых высечек проводилась по мере необходимости. Клещи размножались в присутствии антибиотика в течение одного поколения, затем были перенесены на листовые высечки без антибиотика, где культивировались в течение одного поколения [3; 11]. По прошествии этого времени потомство обработанных клещей отбиралось для проверки на наличие заражения бактериями Cardinium при помощи ПЦР анализа.

Оценка воздействия Cardinium на репродуктивные свойства хозяев путём скрещивания

Подготовительный этап включал получение необходимого количества особей клещей необходимых возрастов для реципрокного скрещивания. Для получения большого количества самцов на плавающие диски-высечки земляники (диаметр 3 см) помещали самок на стадии телиохризалиды (чтобы избежать оплодотворения). Для получения в потомстве самок на диски переносили взрослых самок имаго из маточной популяции с достаточным количеством самцов. При достижении стадии телиохризалиды необходимым количеством самок начинали скрещивание.

Одну самку на стадии телиохризалиды и два половозрелых самца соответствующего варианта помещали на плавающий диск-высечку земляники диаметром 2 см в 20-тикратной повторности. Диски-высечки в бюксах с водой выставляли в термостат с фиксированной температурой 25±0,5 єС для откладки яиц самками. Учёт наличия самки и самцов на диске производили 2 раза в сутки вплоть до начала откладки яиц во избежание появления вариантов с неоплодотворёнными самками.

Далее каждая самка откладывала яйца в течение 5 суток (стандартная продолжительность для подобных экспериментов [3; 12; 13]), после чего самок и самцов удаляли, а потомство выводили до имаго в термостате при той же температуре. При откладке яиц фиксировали плодовитость через каждые 24 час в течение 5 суток. При выведении потомства отмечали количество живых особей и погибших на пищевой арене, а также соотношение полов [3; 14]. Обработка полученных данных велась при помощи программы MS Excel 2010 с надстройкой «Пакет анализа».

Варианты скрещивания:

1. 1+ незараженная Ч 2? незараженных (-/-)

2. 1+ незараженная Ч 2? зараженных (-/+)

3. 1+ зараженная Ч 2? зараженных (+/+)

4. 1+ зараженная Ч 2? незараженных (+/-)

Результаты

Как уже указывалось, с целью оценки воздействия бактерий Cardinium на репродуктивные свойства хозяина особи одной из заражённых популяций были обработаны ампициллином для получения свободной от заражения линии. После обработки была проведена контрольная амплификация с родоспецифичными праймерами на бактерии Cardinium (Рис. 1) по ранее опубликованной методике [10].

До обработки антибиотиком мы получили ожидаемые продукты длиной 450 п.о. и секвенировали их, подтвердив наличие ДНК бактерий Cardinium в пробах [10]. После обработки ампициллином продуктов не было ни в одном варианте, при этом амплификация в положительном контроле прошла успешно. Следовательно, обработка антибиотиком ампициллином действительно освободила линию паутинных клещей от заражения Cardinium.

Рис. 1. Проверка на наличие заражения Cardinium линий T. urticae до (1-4) и после (5-8) обработки антибиотиком M - маркер Thermo Scientific GeneRuler DNA Ladder Mix (SM0331)

Матрица:

· 1-3, 5-6 - T. urticae на кирказоне, г. Новоаннинский;

· 4, 7 - отрицательный контроль;

· 8 - положительный контроль (ранее полученные продукты ПЦР с теми же праймерами).

Были проведены скрещивания особей линий T. urticae, как показано ранее в разделе «Объекты и методы». Результаты скрещиваний приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты скрещиваний двух линий паутинного клеща T. urticae, заражённых и свободных от Cardinium

В первых двух вариантах скрещивания незараженных бактериями Cardinium самок T. urticae все они отложили яйца. В вариантах, где самки были заражены, часть половозрелых самок не начала откладывать яйца вплоть до 5 суток с начала массовой откладки яиц другими самками. В частности, в варианте с зараженными самками и самцами доля неяйцекладущих самок составила 25%, в варианте скрещивания зараженной самки с незараженным самцом - 20%. При этом самки, которые не смогли начать откладку яиц, отличались от нормальных (яйцекладущих) несколько увеличенными размерами тела, оранжевым оттенком, большей прозрачностью тела, а также более блестящей поверхностью тела. Позже небольшое число таких самок было обнаружено в потомстве на высечках, где присутствовали заражённые Cardinium особи. Это свидетельствует о возможном влиянии Cardinium на откладку яиц. Учитывая увеличенные размеры тела этих самок, можно предположить, что этот патоген влияет не столько на формирование фолликулов, сколько на аберрации во время овуляции или невозможность собственно осуществить откладку созревших яиц.

Отметим также факт смертности яйцекладущих самок в вариантах 1 (незараженные особи) и 3 (зараженные особи) (табл. 1). Зафиксированная здесь смертность не может быть однозначно интерпретирована из-за малого объёма выборки. Вместе с тем нельзя пройти мимо того факта, что в варианте скрещивания зараженных бактериями Cardinium самки и самцов смертность оказалась значительно выше (15%), чем в остальных вариантах.

Было отмечено изменение численности популяции: по количеству отложенных яиц на самку, наблюдалось существенное различие в вариантах. Наименьшая плодовитость зафиксирована у варианта +/- (30 яиц), в то время как в остальных вариантах среднее число яиц на 1 самку варьирует в пределах 39,9-45,4 шт. Вероятно, скрещивание заражённой Cardinium самки с незаражённым самцом ведёт к снижению плодовитости.

Выживаемость потомства после выхода из яиц варьировала между вариантами весьма слабо (95,5-97,6 %), имея лишь один выделяющийся показатель - у варианта +/+ (95,5%, минимальный). Тем не менее, учитывая вариацию признака внутри варианта, подобных показателей недостаточно для утверждения о существенном отклонении.

Демографическая структура T. urticae зависела от наличия заражения Cardinium, в частности, наблюдалось существенное различие в соотношении полов между группами вариантов с зараженной самкой и незараженной. В частности, доля самок в потомстве лежала в двух интервалах: 67,9-70,4 % для вариантов со свободными от заражения самками и 77,4-78,7 % для вариантов с заражёнными самками. Из этого следует, что соотношение полов в потомстве у заражённых Cardinium самок несколько смещено в пользу самок по сравнению с альтернативной группой.

Заключение

Оценено воздействие симбиотических бактерий рода Cardinium на популяцию обыкновенного паутинного клеща T. urticae. Показано, что наличие заражения Cardinium обусловливает изменение демографической структуры популяции их хозяина, в частности, появление части самок, неспособных откладывать яйца, некоторое снижение плодовитости клещей и смещение соотношения полов в потомстве в сторону самок, что при остром недостатке самцов может привести к снижению численности популяции. Тем самым обозначены механизмы, управляющие изменением численности и демографической структуры хозяев при воздействии бактерии Cardinium.

Негативное воздействие Cardinium на представителей рода Tetranychus может вызывать затруднения при работе с популяциями паутинных клещей (оценке биологических параметров и динамики численности, создания маточных колоний для последующего разведения хищников и др.), в связи с чем имеет значение превентивный скрининг на наличие заражения Cardinium и, при необходимости, обработка особей паутинных клещей ампициллином для оздоровления таких популяций.

Список использованных источников

1. Kikuchi Y. Endosymbiotic Bacteria in Insects: Their Diversity and Culturability // Microbes and Environments. - 2009, vol. 24, № 3. - P. 195-204.

2. Breeuwer J.A., Jacobs G. Wolbachia: intracellular manipulators of mite reproduction // Experimental & applied acarology. - 1996, vol. 20, № 8. - P. 421-434.

3. Gotoh T., Noda H., Ito S. Cardinium symbionts cause cytoplasmic incompatibility in spider mites // Heredity. - 2007, vol. 98, № 1. - P. 13-20.

4. Weinert L.A., Araujo-Jnr E.V., Ahmed M.Z., Welch J.J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods // Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. - 2015, vol. 282, № 1807.

5. Коноплёв Н.Д., Игнатов А.Н., Попов С.Я. Эволюционный путь и разнообразие бактериальных симбионтов насекомых и клещей // Агрохимия. - 2016, № 3. - С. 69-80.

6. Stouthamer R., Breeuwer J.A., Hurst G.D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction // Annual review of microbiology. - 1999, vol. 53. - P. 71-102.

7. Zchori-Fein E., Perlman S.J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods // Molecular ecology. - 2004, vol. 13, № 7. - P. 2009-2016.

8. Zhang Y.K., Zhang K.J., Sun J.T., Yang X.M., Ge C., Hong X.Y. Diversity of Wolbachia in natural populations of spider mites (genus Tetranychus): evidence for complex infection history and disequilibrium distribution // Microbial ecology. - 2013, vol. 65, № 3. - P. 731-739.

9. Werren J.H. Wolbachia and speciation. - 1998. - P. 245-260.

10. Коноплёв Н.Д., Игнатов А.Н., Попов С.Я. Скрининг паутинных клещей рода Tetranychus (Acari: Tetranychidae) на наличие бактериальных симбионтов // Известия ТСХА. - 2016, № 4. - С. 41-52.

11. Morimoto S., Kurtti T.J., Noda H. In Vitro Cultivation and Antibiotic Susceptibility of a Cytophaga-Like Intracellular Symbiote Isolated from the Tick Ixodes scapularis // Current Microbiology. - 2006, vol. 52, № 4. - P. 324-329.

12. Zhao D.-X., Zhang X.-F., Hong X.-Y. Host-symbiont interactions in spider mite Tetranychus truncates doubly infected with Wolbachia and Cardinium // Environmental entomology. - 2013, vol. 42, № 3. - P. 445-452.

13. Zhu L.Y., Zhang K.J., Zhang Y.K., Ge C., Gotoh T., Hong X.Y. Wolbachia strengthens cardinium-induced cytoplasmic incompatibility in the spider mite Tetranychus piercei McGregor // Current microbiology. - 2012, vol. 65, № 5. - P. 516-523.

14. Попов С.Я. Таксономический статус ряда видов паутинных клещей рода Tetranychus (Acari, Tetranychidae) и репродуктивные барьеры при скрещивании морфологически близких и отдаленных видов // Экологические аспекты ограничения вредоносности популяций насекомых и клещей. - М.: Изд-во РГАУ-МСХА. - 2013. - С. 135-160.

Цитирование

Коноплёв Н.Д., Попов С.Я., Игнатов А.Н. Воздействие бактериального симбионта Cardinium на репродуктивные свойства обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) // АгроЭкоИнфо. - 2017, №1. http://agroecoinfo.narod.ru/journal/STATYI/2017/1/st_112.doc.

Размещено на Allbest.ru