Дигидроксиацетон – способ получения

Оценка возможности получения диоксиацетона - ысокореактивной кетотриозы, применяемой в разных областях промышленности путём биотрансформации глицерина неразмножающимися клетками ацетобактерии Gluconobacter oxydans. Оптимальные условия ее культивирования.

Рубрика Биология и естествознание
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 23.06.2018
Размер файла 34,3 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Дигидроксиацетон - способ получения

Н.А. Кустова

Н.Ю. Чупахина

Исследована возможность получения диоксиацетона (ДОА) - высокореактивной кетотриозы, широко применяемой в различных областях промышленности путём биотрансформации глицерина неразмножающимися клетками ацетобактерии Gluconobacter oxydans. Подобраны оптимальные условия культивирования Gluconobacter oxydans, определены влияние кислорода и содержания глицерина в среде для биотрансформации на скорость биосинтеза ДОА. Показана возможность организации непрерывного процесса получения ДОА свободными неразмножающимися клетками с применением микрофильтрации.

диоксиацетон, неразмножающиеся клетки, Gluconobacter oxydans, ферментация

диоксиацетон культивирование ацетобактерия gluconobacter

Gluconobacter oxydans - грамотрицательная бактерия, принадлежащая к роду Acetobacter. Форма клеток эллипсоидальная с размером 0.5-0.8 х 0.9-4.2 мкм, расположенны по одной или парами, редко собранны в цепочки. G. oxydans - облигатные аэробы со строго окислительным типом метаболизма и кислородом в качестве конечного акцептора электронов.

Ферменты Gluconobacter oxydans делятся на две группы с учётом их локализации и функционирования. Одна из групп связана с бактериальной мембраной и сопряжена с цитохромной системой. Примерами могут служить - D-глюкозодегидрогеназа, D-глюконатдегидрогеназа, глицеролдегидрогеназа и D-сорбитолдегидрогеназа. Эти ферменты являются флавопротеинами и катализируют реакции, в которых субстрат, в основном, является внеклеточным. Ферменты второй группы катализируют внутриклеточный метаболизм и, соответственно, сосредоточены во внутриклеточном пространстве.

Известно, что окисление глицерина осуществляется дегидрогеназами двух типов: мембранно-связанная действует в кислой среде и не требует для своей активности пиридиннуклеотидов, а растворимая - в щелочной и зависит от НАД.

Gluconobacter - важная промышленная культура, используемая для получения L-сорбозы из D-сорбитола, D-глюконовой кислоты, 5-кето- и 2-кетоглюконовой кислот из D-глюкозы и дигидроксиацетона из глицерина [1].

Диоксиацетон (ДОА) используется в ряде отраслей промышленности в качестве:

- инициатора реакций получения искусственных смол и полимеров, а также компонента искусственных красителей;

- консерванта крови; лекарственным средством против ряда заболеваний;

- красителя натуральных тканей и мехов, а также средством против сминаемости и усадки тканей.

Наиболее известно применение ДОА в косметической промышленности в качестве добавки в крема типа «автобронзат» для придания коже устойчивого коричневого оттенка, сходного с эффектом загара.

Дигидроксиацетон представляет собой окисленный продукт глицерина.

Схема ферментативной реакции окисления глицерина представлена ниже:

Глицеролдегидрогеназа + кислород

Глицерин > Дигидроксиацетон

В промышленности применяют штамм G. oxydans ATCC 621 (Arun Gurpa 2001).

Известные микробиологические способы получения ДОА используют глицеролдегидрогеназную активность культуры Gluconobacter oxydans, развивающейся в полноценной питательной среде. При этом основной углеродный субстрат среды расходуется чаще всего на прирост биомассы клеток микроорганизмов, а не на использование их ферментативной активности на процесс биотрансформации глицерина в ацетон [2].

В рассматриваемой нами технологии, разработанной на кафедре биотехники Московского государственного университета инженерной экологии, процесс складывается из двух основных стадий. Сначала используется традиционный процесс ферментации для наращивания биомассы клеток микроорганизмов. Затем происходит разделение микроорганизмов и среды с остатками ростовых факторов. Сгущённые микроорганизмы помещают в специальную облегчённую среду, не содержащую ростовых факторов, в которой и осуществляется процесс биотрансформации глицерина в дигидроксиацетон. Скорость трансформации глицерина неразмножающейся культурой в среде, не содержащей источников азота и витаминов, сравнима или даже превосходит скорость трансформации, осуществляемой растущими бактериями.

Преимущество процессов с использованием неразмножающихся клеток заключается в:

- применении более простой по составу среды;

- снижении себестоимости продукта;

- уменьшении количества отходов;

- упрощении выделения конечного продукта [1].

Целью исследования послужило изучение условий трансформации глицерина в ДОА свободными неразмножающимися клетками Gluconobacter oxydans, обеспечивающих максимальную продуктивность процесса и операционную стабильность клеток бактерий.

Объект и методы

Объектом исследования являлся штамм уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans штамма 621 ( коллекция СПбГУ). Бактериальная культура поддерживалась на агаризованной среде постоянного состава, содержащей 6% глицерина, 0,2% KH2PO4 и 0,3% (по сухим веществам) дрожжевой воды. При выращивании бактерий в питательную среду вносили глицерин и субстрат конструктивного обмена (СКО), в состав которого входили азотсодержащие вещества, витамины и стимуляторы роста. В качестве СКО использовали дрожжевую воду. Среда для трансформации не содержала дрожжевой воды. Концентрация глицерина в этой среде в разных экспериментах варьировала от 8 до 15%. Культуру выращивали в колбах на качалках, бактерии отделяли центрифугированием, промывали водой и средой для трансформации. Эксперимент выполнялся в биореакторах объёмом 1 и 250 л. Уровень аэрации варьировали путём изменения числа оборотов мешалки и добавлением чистого кислорода к аэрирующему воздуху. Интенсивность аэрации выражали величиной сульфитного числа. Количество растворённого кислорода определяли с помощью мембранного датчика гальванического типа. Значение рН в ферментёре контролировали с помощью рН-метра.

Посевным материалом для биотрансформации служили клетки, находящиеся в фазе замедления роста. Объём посевного материала составлял 4-5% рабочего объёма. Количество биомассы определяли нефелометрическим методом со светофильтром 550 нм, а диоксиацетон - фотоколометрическим [3] методом с применением хлористого трифенилтетразоля и использованием аналогичного светофильтра. Измерения концентрации сухих веществ в питательных средах проводили рефрактометрическим методом. Жизнеспособность бактерий определяли прямым методом высева на плотную среду и подсчётом выросших колоний.

Результаты эксперимента

Влияние дрожжевой воды. Результаты исследования влияния дрожжевой воды (субстрата конструктивного обмена (СКО)) на удельную скорость роста биомассы Gluconobacter oxydans и удельную скорость образования ДОА (рис.1) позволяют говорить о том, что рост биомассы стимулируется с повышением концентрации СКО, а биотрансформация ДОА - ингибируется. Рост клеток при предварительном наращивании биомассы бактерий показал, что концентрация биомассы значительно возрастала при увеличении количества дрожжевой воды от 0,15 до 1,5% по сухим веществам, при этом урожай клеток составил 1,9 - 2,2 г/л. Такая зависимость характерна для дискордантных факторов по классификации В.В.Бирюкова [4] и свидетельствует о том, что процесс биотрансформации следует проводить при более низкой концентрации СКО, а концентрацию субстрата конструктивного обмена в ходе процесса ферментации следует снижать по определённой программе.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис.1. Влияние концентрации дрожжевой воды на накопление биомассы Gluconobacter oxydans (1), удельную скорость роста (2) и удельную скорость образования ДОА (3)

Влияние ингибитора белкового синтеза. Проведены эксперименты по изучению влияния ингибитора белкового синтеза - левомицетина - на биотрансформацию глицерина. Показано, что левомицетин в концентрации 25 мг/л увеличивал удельную скорость образования ДОА в 1,5 раза, а в концентрации 50 мг/л - в 2,5 раза при замедлении роста бактерий. Действие ингибитора окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенола в концентрации 30, 50 и 100 мкг/л снижало урожай бактерий в 1,5, 2 и 3,5 раза соответственно, но увеличивало удельную скорость образования ДОА от 3,3 до 14 г ДОА/г СБ . ч.

Влияние аэрации. Исследование влияния интенсивности аэрации, равной 1,1 и 2.0 г 02 /л . ч, показало, что коэффициент скорости роста в обоих вариантах был одинаковым и составлял 0,12 ч-1 , а удельная скорость образования продукта была в 1,7 раза выше при большей интенсивности аэрации (2,1 и 3,5 г ДОА/г СБ . ч) (рис.2). Удельная скорость образования диоксиацетона неразмножающимися клетками при увеличении интенсивности аэрации от 0,5 до 8,4 г 02 /л . ч увеличивалась в 10 раз. Дальнейшее увеличение интенсивности аэрации существенного влияния на исследуемый процесс не оказывало.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 2. Зависимость удельной скорости образования ДОА от концентрации растворённого кислорода

Также было установлено, что при концентрации кислорода в среде 0,94 мг/л достигается максимальная окислительная активность клеток при исходной концентрации глицерина 60 г/л и плотности бактериальной суспензии - 2 г/л. Экспериментальное соотношение между концентрацией кислорода и удельной скоростью образования ДОА удовлетворяет уравнению Михаэлиса - Ментен, а константа Кs по кислороду равна 0,5 мг 02 /л.

При обогащении воздуха, используемого для аэрации, кислородом было установлено, что увеличение концентрации О2 сказывалось на процессе трансформации двояким образом. Увеличение концентрации кислорода до 1,8 мг О2/л в опытах с меньшей концентрацией биомассы повышало удельную скорость образования ДОА, а в опытах с большей плотностью клеток увеличивало продуктивность.

Во всех случаях улучшение снабжения микроорганизмов кислородом давало положительный эффект.

Коэффициент поддержания жизнедеятельности по кислороду для неразмножающихся клеток составил 0,7 - 0,9 г О2/г СБ . ч.

Влияние величины рН. Для определения оптимальной величины рН при трансформации глицерина в ДОА неразмножающимися клетками в зависимости от количества реакционных циклов были поставлены опыты в ферментёре объёмом 250 л. Общая картина зависимости удельной скорости образования ДОА от величины рН при многократном использовании биомассы подтверждала наличие двух глицеролдегидрогеназ. При центрифугировании и промывании биомассы растворимая фракция глицеролдегидрогеназы вымывалась и быстро теряла свою активность в рабочем растворе и основное влияние на удельную скорость образования ДОА начинала оказывать «кислая» дегидрогеназа. В связи с чем, уже с третьего цикла окисления оптимум рН сдвигался в кислую зону (рис.3). При этом оптимальное значение рН снизилось с 7,5 до 6,0.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис.3. Влияние рН на удельную скорость образования ДНА (qp)

при трансформации глицерина неразмножающимися клетками в последовательных циклах окисления (1, 2, 3)

Влияние концентрации глицерина. Для определения зависимости скорости образования ДОА от концентрации глицерина была проведена серия опытов в лабораторном ферментёре объёмом 1 л при концентрации глицерина от 5,0 до 150 г/л. Было показано, что зависимость удельной скорости образования ДОА от начальной концентрации глицерина в среде представляла собой гиперболу. Следовательно, можно предположить, что процесс трансформации глицерина в ДНА подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Результаты экспериментов подтвердили это предположение и позволили определить Кs по глицерину, которая равнялась 28,6 г/л.

Результаты опытов по добавлению ДОА в количестве от 5,0 до 50,0 г/л в обычную среду для трансформации обнаруживали ингибирование скорости трансформации конечным продуктом.

Изменение концентрации глицерина от 6 до 20% не влияло на рост биомассы при содержании в среде дрожжевой воды, уже начиная с 0,15%. При содержании в среде дрожжевой воды в количестве 0,5% увеличение концентрации глицерина с 2 до 10% повышало конечный урожай бактерий с 1 до 1,5 г/л.

Организация непрерывного биосинтеза ДОА неразмножающимися клетками. Исследовалась возможность осуществления непрерывного процесса биосинтеза ДОА неразмножающимися клетками. Полунепрерывный процесс осу-ществлялся таким образом, что при окислении 80-50% заданного количества субстрата часть суспензии отбирали, а бактерии отделяли от раствора и возвращали в биореактор с новой порцией среды для окисления. При концентрации глицерина в среде 60 г/л было проведено 17 циклов с возвратом биомассы. При этом условии коэффициент разбавления составил 0,44 ч-1, удельная скорость образования ДОА - 6,8 г ДОА/г СБ . ч, а продуктивность - 16,2 г ДОА/л . ч. При концентрации глицерина 80 г/л коэффициент разбавления составил 0,29 ч-1, удельная скорость образования ДОА - 13,6 г ДОА/г СБ . ч, а продуктивность - 18,4 г ДОА/л. ч. Для изучения непрерывного процесса синтеза ДОА с удержанием биомассы в биореакторе опыты проводились в системе с микрофильтрационной ячейкой, содержащей полупроницаемую ядерную мембрану из лавсанового волокна с диаметром пор 0,5 ± 0,03 мкм. Основные технологические показатели непрерывного синтеза ДОА неразмножающимися клетками (таблица) позволяют сделать вывод о возможности осуществления непрерывного способа получения ДОА.

Таблица 1

Основные технологические показатели непрерывного процесса получения ДОА с применением микрофильтрации для удержания клеток биомассы в ферментёре

Начальная концентрация глицерина в среде, г/л

40

60

80

100

120

200

Средняя продуктивность,

г ДНА/л.ч

8,3

14,2

17,5

19,6

10,3

7,5

Выход ДНА, %

89,8

78,5

81,0

65,9

61,0

70,0

При этом в периодическом процессе ферментации с параллельной биотрансформацией глицерина в ДОА продуктивность процесса была ниже на 20 - 30%, а выход глицерина - на 30 - 40%

Выводы

1. Подобраны условия культивирования Gluconobacter oxydans, обеспечивающие максимальный урожай клеток и скорость роста.

2. Определены: кинетическая константа Кs для кислорода, равная 0,898 мг/л и коэффициент поддержания жизнедеятельности по кислороду, равный 0,84±0,17г 02 /г СБ . ч.

3. Подтверждено положительное влияние повышенного содержания кислорода в воздухе, используемом для аэрации, на скорость биосинтеза ДОА.

4. Показано, что кинетика процесса трансформации глицерина неразмножающимися клетками подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Определена константа Кs, равная 28,6 г/л.

5. Показана возможность организации непрерывного процесса получения ДНА свободными неразмножающимися клетками с применением микрофильтрации.

Список литературы

Arun Gurpa, Vinay K. Singh, G.N. Qazi, Anil Kumar. Gluconobacter oxydans: Its Biotechnological Applications. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2001) 3 (3): P. 445 - 456.

Кустова Н.А. Трансформация глицерина в диоксиацетон неразмножающимися клетками Gluconobacter oxydans: автореф. …канд. биол. наук / Н.А. Кустова. - М.: Изд-во МИХМ, 1994. - 19 с.

Чупахина Г.Н.. Система аскорбиновой кислоты растений: монография / Г.Н. Чупахина. - Калининград.: Изд-во КГУ, 1997. - 118 с.

Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. - М.: КолосС, 2004. - 296 с.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • История получения белка с помощью микроорганизмов. использование высших базидиальных грибов для получения белка кормового, пищевого назначения. Получение белка путем глубинного культивирования на питательных средах. Сохранение и усиление грибного аромата.

    реферат [28,9 K], добавлен 13.03.2019

  • Гидролиз пектиновых веществ и целлюлозы, оптимальные условия их действия. Гидролиз крахмала, осуществляемый амилолитическими ферментами. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты. Преимущества ферментативного способа получения белковых гидролизатов.

    реферат [3,4 M], добавлен 29.10.2014

  • Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.

    реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009

  • Оснвные способы получения генетически модифицированных растений и животных. Трансгенные микроорганизмы в медицине, химической промышленности, сельском хозяйстве. Неблагоприятные эффекты генно-инженерных организмов: токсичность, аллергия, онкология.

    курсовая работа [1,0 M], добавлен 11.11.2014

  • Проблема очистки масло- жиросодержащих сточных вод предприятий пищевой промышленности. Иммобилизованные биокатализаторы на основе активного ила. Получение биокатализатора на основе клеток Penicillium roqueforti. Недостатки дрожжей Yarrowia lipolytica.

    презентация [1,2 M], добавлен 03.12.2014

  • Генная инженерия как метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Этапы процесса получения рекомбинантных плазмид. Конструирование клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.

    презентация [819,2 K], добавлен 20.11.2011

  • Изучение метода получения моноклональных антител путем слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами. Основные среды, употребляемые при получении гибридов. Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Процесс клонирования гибридом.

    контрольная работа [40,6 K], добавлен 22.01.2015

  • Характеристики, методы получения и использования глутамата натрия, который применяют для усиления природных вкусовых свойств пищевых продуктов. Состав питательной среды и условия биосинтеза. Активаторы и ингибиторы процесса. Возможности генной инженерии.

    курсовая работа [1,6 M], добавлен 09.11.2010

  • Основные способы заражения куриных эмбрионов вирусом. Этапы получения субкультур: снятие клеточного слоя, отделение и посев клеток, методика заражения клеточных культур вирусом, учет результатов. Полуперевиваемые культуры клеток человека и животных.

    презентация [4,2 M], добавлен 29.01.2015

  • Изучение методов получения и выделения внеклеточных и внутриклеточных ферментов. Описание процессов осаждения органическими растворителями и высаливания ферментов. Понятие коагуляции и флокуляции. Принцип работы центрифуг с роторами трубчатого типа.

    курсовая работа [59,2 K], добавлен 30.11.2010

  • Обзор анаэробного метаболического распада молекул питательных веществ без окисления. Возбудитель уксуснокислого брожения. Развитие уксуснокислых бактерий в напитках. Способ получения столового уксуса. Промышленное получение и применение лимонной кислоты.

    реферат [110,3 K], добавлен 01.03.2014

  • История исследования возможности получения потомков с точной генетической копией организма. Описание методов трансплантации ядер, генетического перепрограммирования клеток кожи и SLIC (sequence and ligation-independent cloning) способа клонирования.

    реферат [113,1 K], добавлен 15.06.2010

  • Генная инженерия и трансгеноз. Методология получения трансгенных мышей. Использование ретровирусных векторов. Использование метода микроинъекций ДНК. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Использование трансгенных мышей.

    реферат [32,2 K], добавлен 18.09.2015

  • Понятие и биологическое значение мембран в клетках организма, функции: структурные и барьерные. Их значение во взаимодействия между клетками. Десмосома как один из типов контакта клеток, обеспечивающие их взаимодействие и прочное соединение между собой.

    реферат [20,2 K], добавлен 03.06.2014

  • Значение влажности среды при выращивании ферментов на сыпучих средах. Влияние степени аэрирования культур микроскопических грибов. Воздействие состава среды и длительности культивирования на биосинтез липазы. Способы обработки и выращивания культуры.

    презентация [734,7 K], добавлен 19.03.2015

  • Анализ проблемы изучения структуры и функции ДНК, а также возможности ее искусственного изменения и создания организмов с заданными наследственными свойствами. Описание экспериментального получения Ad-вектора на основе генома аденовируса птиц CELO.

    курсовая работа [9,1 M], добавлен 04.12.2010

  • Липид-транспортирующие белки растений в диагностике и терапии аллергических заболеваний. Создание гипоаллергенных аналогов LTP, перспективы вакцинации. Химическая трансформация клеток E.coli. Расщепление гибридного белка, масс-спектрометрический анализ.

    дипломная работа [1,8 M], добавлен 16.07.2013

  • Метанотрофы и метилобактерии в биотехнологии. Использование метанола в газовой промышленности. Выбор штаммов микроорганизмов. Биопрепараты и их получение. Оценка возможности применения метанолутилизирующего препарата в морской воде и засоленной почве.

    дипломная работа [575,7 K], добавлен 05.07.2017

  • Оптимальный поиск физиологически активных компонентов питательной среды (нутриентов) и условий культивирования, необходимых разнообразным живым системам для интенсивного роста и синтеза биологически активных соединений: ферментов, антигенов, антибиотиков.

    научная работа [379,9 K], добавлен 21.03.2012

  • Математическое моделирование межвидовых взаимодействий в экосистемах. Минимальный и максимальный предельные значения начальных параметров экосистемы типа "хищник-жертва". Условия природопользования с целью получения максимальной прибыли в экосистемах.

    лабораторная работа [546,5 K], добавлен 19.05.2008

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.