Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Эколого-функциональная роль микроорганизмов техногенно-нарушенных почвогрунтов

(на примере Дамбукинского золотоносного узла)

Специальность 03.00.16. - экология

Римкевич Ольга Вячеславовна

Благовещенск - 2006

Работа выполнена в Амурском филиале Ботанического сада - института ДВО РАН, Институте геологии и природопользования ДВО РАН (г. Благовещенск); в отделе Всероссийская коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино).

Научный руководитель: кандидат биологических наук Л.М. Павлова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, академик РАСХН В.А. Тильба

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент В.Ф. Прокопчук

Ведущая организация: Институт водных и экологический проблем ДВО РАН

Защита диссертации состоится «17» ноября 2006 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К.220.027.03 при ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет».

Адрес: 675005, Амурская область, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86

тел. 51-32-42 тел./факс (4162) 44-65-44 E-mail: dalgau@tsl.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»

Автореферат разослан 14 октября 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к. с.-х. н., доцент О.В. Щегорец

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время установлены биотические взаимоотношения между микроорганизмами и растениями, которые носят либо антагонистический характер, либо характер ассоциативного (симбиотического) сосуществования. Хорошо известны антагонистические взаимоотношения между растениями и патогенными микроскопическими грибами (Schultze, Kondorosi, 1998; Borowich, 2000), мутуалистические - между ризобиями и бобовыми растениями (Тильба, Голодяев, 1995; Игнатов, 1998; Karpati, Sik, 1992; Matthew, Kent, 2001). Микроорганизмы либо создают оптимальные условия для развития растений, либо являются фитопатогенными (Боронин, 1998; Zak et. al., 1994; Garland, 1996; Glick et. al., 1997). Практически не изучены функциональные взаимоотношения в системе «почва-микроорганизмы-растение» на техногенно-нарушенных землях, когда структурные компоненты системы (растения, микроорганизмы) находятся в экстремальных условиях существования, так как произошло нарушение их естественного местообитания. Изучение данной проблемы весьма актуально для Амурской области, на территории которой более 130 лет ведется отработка месторождений и россыпепроявлений золота, занимающих около 155 тыс. км² из 361 тыс. км² площади всей области (Доклад …, 2002). Изучение структуры микробного комплекса и функциональных взаимоотношений в системе «почва-микроорганизмы-растение» является фундаментальной основой для понимания процессов восстановления техногенно-нарушенных экосистем и создания новых технологий биорекультивации.

Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение структуры микробных комплексов почвогрунтов и прикорневой зоны пионерных растений, выявление функциональных отношений в системе «почва-микроорганизмы-растение» на примере техногенно-нарушенных земель Дамбукинского золотоносного узла.

В задачи исследования входило:

1. Изучить количественный состав эколого-функциональных групп микроорганизмов почвогрунтов и корневой зоны пионерных растений гале-эфельных отвалов россыпной добычи золота на первых этапах почвообразовательного процесса.

2. Провести таксономический анализ сапротрофного микробного комплекса на основе фенотипических признаков и молекулярно-генетических методов исследования.

3. Установить филогенетическое положение бактерий сапротрофного комплекса и количественное распределение филогенетических групп бактерий в почвогрунтах и корневой зоне пионерных растений.

4. Определить экофизиологическую роль фосфатмобилизующих бактерий, свободноживущих и ассоциированных с растениями, провести идентификацию и филогенетический анализ штаммов.

5. Установить биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий.

Научная новизна. Впервые был применен комплексный подход в исследовании функциональных отношений в системе «почва-микроорганизмы-растения» на техногенных отвалах после россыпной добычи золота.

Впервые изучено таксономическое разнообразие свободноживущих и ассоциативных бактерий в нарушенных почвогрунтах с применением современных молекулярно-генетических методов исследования. Выявлены представители редко встречающихся видов (Acinetobacter lwoffii и Planococcus aminovorans), имеющих высокую адаптивную способность к воздействию экологических факторов. Впервые установлена специфичность распространения и высокий биотехнологический потенциал бактерий, участвующих в трансформации минеральных и органических соединений фосфора и выполняющих средообразующую функцию в почвогрунтах, нарушенных в результате золотодобычи.

Практическая значимость работы. В лабораторных модельных экспериментах изучен биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий. Создана коллекция активных бактериальных штаммов, которые могут быть использованы в рекультивационных технологиях обработки нарушенных почвогрунтов. На основе выделенных штаммов рекомендовано разработать биопрепараты для обработки семян растений перед внесением в рекультивируемые грунты.

Положения, выносимые на защиту.

1. На начальных этапах почвообразования в системе «растения-микроорганизмы» устанавливаются специфические биотические отношения, определяющие селективное участие растений в формировании микробного комплекса прикорневой зоны. В состав микробного комплекса данного экотопа входят виды (Acinetobacter lwoffii, Planococcus aminovorans), обладающие высокой степенью устойчивости к воздействию неблагоприятных экологических факторов среды обитания: низкое содержание органических соединений в почвогрунтах, недостаточная обеспеченность подвижными формами фосфора.

2. Фосфатмобилизующие микроорганизмы играют ведущую роль в формировании функциональных взаимоотношений в системе «почва-микроорганизмы-растение». Специфичность распространения данной группы бактерий определяется тем, что в почвогрунтах распространены виды, использующие широкий набор минеральных субстратов для мобилизации фосфора, тогда как в прикорневой зоне пионерных растений присутствуют виды, трансформирующие органофосфатные соединения и фосфаты кальция.

Апробация работы. Основные положения работы представлены на VI Международном симпозиуме «Проблемы устойчивого развития регионов в XXI веке (Биробиджан, 2002); региональной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Будущее амурской науки» (Благовещенск, 2002); II Международной конференции «Ресурсовоспроизводящие, малоотходные и природоохранные технологии освоения недр» (Москва, 2003); Международном симпозиуме «Геотехнология: нетрадиционные способы освоения полезных ископаемых» (Москва, 2003); VI, XI и IX молодёжных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2000, 2003 и 2005); региональной конференции молодых учёных «Проблемы экологиии и рационального природопользования Дальнего Востока» (Владивосток, 2004); VII региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии (Владивосток, 2004); III региональной школе-семинаре молодых учёных, аспирантов и студентов Дальнего Востока «Территориальные исследования дальнего Востока» (Биробиджан, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы (глава 1), описание объектов и методов исследования (глава 2), результаты экспериментов (главы 3 и 4), выводы и список литературы, включающий 244 источника, из которых 139 - на иностранных языках. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, содержат 18 рисунков и 4 таблицы.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.б.н. Павловой Л.М. Автор благодарен ученому секретарю Амурского филиала БСИ ДВО РАН к.б.н. Куимовой Н.Г., а также к.б.н. Католе В.М., к.б.н. Тену О.А., д.б.н. проф. Крылову А.В., к.б.н. Газдиеву Д.О., к.х.н. Радомской В.И., к.б.н. Старченко В.М., к.б.н. Поляковой Т.А. и всем сотрудникам лаборатории микробиологии и биохимии (ИГиП ДВО РАН) за разностороннюю поддержку в выполнении исследований и ценные советы в подготовке рукописи. Особую благодарность за консультации и помощь в проведении исследовании автор выражает заведующему сектора бактерий отдела ВКМ к.б.н. Акимову В.Н (ИБиФМ им. Скрябина).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований служили микроорганизмы, выделенные из почвогрунтов отвалов россыпной добычи золота и корневой зоны пионерных растений, произрастающих на отвалах (Дамбукинский золотоносный узел, Амурская область).

Образцы почвогрунтов и корней растений отбирали с соблюдением правил асептики и помещали в стерильные пергаментные пакеты. Среднюю почвенную пробу получали смешиванием пяти почвенных образцов, отобранных по «принципу конверта» (Теппер, 2004). С площади 100 м² отбирали четыре образца в точках по углам и один - ближе к центру прямоугольника. Содержание гумуса 0.34%, азота - 1.9%, обменного калия - 155-190 мг/кг, подвижного фосфора - 27-42 мг/кг почвогрунта, рН водной вытяжки 6.6.

Выделение микроорганизмов из почвогрунтов и корневой зоны растений осуществляли методом посева почвенной суспензии на селективные питательные среды (Звягинцев, 1980). Численность микроорганизмов учитывали: утилизирующие органические формы азота (сапротрофные бактерии на МПА); утилизирующие минеральные формы азота (крахмало-аммиачный агар - КАА). Учёт олигонитрофильных видов проводили на среде Эшби, микроскопических грибов - на среде Чапека. Учёт микроорганизмов, участвующих в биотрансформации фосфатсодержащих соединений (органофосфатов кальция, железа и алюминия), проводили на специальных средах (Теппер, 2004). Активные фосфатмобилизующие бактериальные штаммы отбирали из колоний, дающих зоны растворения фосфата. Инкубацию посевов проводили при температуре 20 ⁰С в течение 4-9 суток.

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе изучения фенотипических свойств и молекулярно-генетических методов исследования с применением филогенетического анализа.

Морфологию клеток и подвижность изучали методом «висячей капли» с помощью световой микроскопии (Бабьева, Агре, 1971). Фенотипическую характеристику выделенных бактерий проводили согласно принятым методикам (Методы ….., 1983; Bergey's ….., 1984; Bergey's ….., 1994).

Молекулярно-генетические методы исследования. Выделение и очистку хромосомной ДНК проводили по стандартной методике (Marmur, 1961). Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили в соответствии с предложенной методикой (Versalovic et. al., 1994). Группирование выделенных штаммов проводили на основе рестриктазного анализа генов 16S рРНК (Savelkoul et. al., 1999). Нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК определяли на автоматическом ДНК секвенаторе CEQ2000XL («Beckman Coulter», США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом. Анализировали уровни сходства между нуклеотидными последовательностями, определёнными в работе, с последовательностями типовых штаммов наиболее близких таксонов. По ориентировочным значениям уровня сходства 97% для вида и 94-95% для рода определяли видовую принадлежность изучаемых штаммов (Stackebrandt, Goebel, 1994; Garrity et. al., 2002). Построение укорененного филогенетического дерева исследуемых микроорганизмов с использованием нуклеотидных последовательностей 16S рРНК типовых штаммов филогенетически отдалённых микроорганизмов проводили с помощью метода связывания ближайших соседей (Saitou, Nei, 1987).

В лабораторных модельных экспериментах была проведена оценка биотехнологического потенциала изучаемых штаммов фосфатмобилизующих микроорганизмов: степень мобилизации подвижных форм фосфора в почвогрунтах и в жидкой среде, влияние на прорастание семян.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Количественный анализ физиологических групп микроорганизмов. Результаты количественного учёта физиологических групп микроорганизмов в почвогрунтах показали невысокую общую численность микроорганизмов, которая составила порядка 10³-10⁵ КОЕ/г (табл. 1). По количественному соотношению доминировали олигонитрофильные микроорганизмы и бактерии, использующие минеральные формы азота в количестве 180-220 тыс. КОЕ/г. Численность сапротрофных микроорганизмов значительно меньше и составила 125 тыс. КОЕ/г. Количество микроскопических грибов на два порядка ниже численности бактерий - 9 тыс. КОЕ/г.

Таблица 1

Количественный учёт физиологических групп микроорганизмов,

(КОЕ X 10³/г)

Примечание: «Рс» - ризосфера, «Рп» - ризоплана

Согласно значениям степени обогащенности почв микрофлорой, предложенной Д.Г.Звягинцевым (1987), исследуемые почвогрунты крайне бедны микроорганизмами, а их функциональные группы в порядке убывания составили ряд: олигонитрофилы > бактерии, использующие минеральные формы азота > сапротрофы > микроскопические грибы. Данное количественное распределение характеризует почвы с малоактивными минерализационными процессами. Недостаток питательных веществ в почве, по мнению ряда авторов (Мишустин, 1956; Колешко, Зайко, 1974; Тен, 1977; Schroth, Hancock, 1982), является основным экологическим фактором, лимитирующим развитие микроорганизмов-органолитиков: сапротрофных бактерий и микроскопических грибов. В этих условиях существенную роль в процессах почвообразования играют олигонитрофилы и бактерии, использующие минеральные формы азота, способные переносить длительные периоды голодания, используя как свою эндогенную систему метаболизма, так и труднодоступные для других микроорганизмов субстраты (Слабова, 1988; Curt, Truelove, 1986).

По результатам исследования незначительный «ризосферный эффект» в отношении сапротрофных бактерий и использующих минеральные формы азота установлен у растений древесных пород, за исключением тополя. По мнению многих исследователей, почвы под многолетними растениями в сравнении с травостоем отличаются высокой ферментативной активностью, обуславливающей интенсивность гидролитических процессов и накопление минерального азота (Федорова, 1976; Тен, 1977). Вследствие этого происходит активизация микроорганизмов-органолитиков и бактерий, использующих минеральные формы азота. Также известно, что многолетние растения обладают более разветвлённой корневой системой и, следовательно, почва под ними становится богаче общим количеством органического вещества, в сравнении с однолетними растениями. Тем самым растения древесных пород с течением времени создают селективные условия в своей корневой зоне, формируя ассоциативную микрофлору, количественно и качественно отличающуюся от сообщества микроорганизмов почвогрунтов.

Отсутствие ризосферного эффекта наблюдали в отношении групп олигонитрофильных микроорганизмов, численность которых в ризосфере всех исследуемых растений ниже численности олигонитрофилов в почвогрунте. Данное обстоятельство объясняется более высоким содержанием легкодоступных азотсодержащих веществ в корневых экссудатах растений по сравнению с содержанием таковых в почвогрунте. Известно, что олигонитрофильные микроорганизмы лучше развиваются при недостатке азота, ассимилируя его из субстрата.

Таким образом, анализ количественного и качественного состава физиологических групп микроорганизмов в почвогрунтах и корневой зоне растений выявил начальный процесс формирования микробно-растительных взаимодействий, характеризующийся невысокой общей численностью микроорганизмов; отсутствием видимого «ризосферного эффекта»; преобладанием физиологических групп микроорганизмов, использующих минимальные содержания питательных веществ в субстрате и минеральные формы азота. Данное обстоятельство подтвердило существующее представление об отвалах россыпной добычи золота, как о крайне неблагоприятных субстратах для функционирования почвенной биоты. Следует отметить, что выводы, основанные на количественной оценке физиологических групп микроорганизмов, соответствуют результатам прямого электронно-микроскопическиго анализа. При изучении микроорганизмов непосредственно в почвогрунтах отвалов, нами было показано, что большая часть микробных клеток преобразовалась в L-формы (Катола и др., 2005). В свою очередь, L-трансформация соответствует состоянию «покоя» бактериальной клетки (замедлению всех метаболических реакций), функционирующей в экстремальных условиях окружающей среды, которыми являются изучаемые отвалы россыпной добычи золота.

Невысокое количество микроскопических грибов в корневой зоне растений и почвогрунте коррелирует с низким содержанием органических веществ, причём в ризоплане подорожника и тополя, а также в корневой зоне ивы микроскопические грибы практически отсутствовали.

По численному составу физиологических групп микроорганизмов в прикорневой зоне исследуемые растения в порядке убывания образовали ряд:

· сапротрофные микроорганизмы: сосна > лиственница > береза > ива > чозения > подорожник > полынь > тополь;

· микроорганизмы, использующие минеральные формы азота: сосна > чозения > ива > береза > лиственница > подорожник > полынь > тополь;

· олигонитрофильные микроорганизмы: подорожник > чозения > сосна > ива > береза > лиственница > полынь > тополь;

· микроскопические грибы: сосна > лиственница > подорожник > полынь > береза > чозения > тополь > ива.

Таким образом, показано селективное участие разных видов растений как на количественные, так и на качественные характеристики микробных сообществ прикорневой зоны, что согласуется с данными S.D. Siciliano, J.J. Germida (1998), показавшими, что, в зависимости от состава корневых выделений, в ризосфере складываются специфические комплексы микроорганизмов. растение гриб биорекультивация экосистема

В прикорневых зонах разных видов растений создаются неодинаковые физико-химические и биотические условия, формируется ризосферная микрофлора различного состава, обеспечивающая оптимальный уровень корневого питания и способствующая росту и развитию растений в неблагоприятных условиях окружающей среды, которыми являются техногенно-нарушенные почвогрунты.

2. Таксономический анализ сапротрофного бактериального комплекса. Из корневой зоны и почвогрунтов исследуемых отвалов россыпного золота выделено 236 бактериальных штаммов. Из них 57 штаммов изолированы из корневой зоны сосны, 62 штамма из корневой зоны лиственницы, 44 штамма из корневой зоны берёзы и 63 штамма непосредственно из почвогрунтов. Выбор видов растений был обусловлен их доминирующим положением в пионерном растительном сообществе, произрастающем на исследуемой территории.

Выделенные штаммы идентифицировали в процессе изучения их морфологических, культуральных, физиолого-биохимических свойств, молекулярно-генетических и филогенетических методов анализа, по результатам которого было построено филогенетическое древо, отражающее систематическое положение видов, составляющих сапротрофный бактериальный комплекс.

Таким образом, 236 бактериальных штаммов, выделенных из почвогрунтов и корневой зоны трёх видов пионерных растений, принадлежат к 14 видам из 12 родов трех классов (табл. 2).

Класс Bacilli (грамположительные бактерии с низким содержанием ГЦ пар в ДНК) представлен семью видами бактерий: Bacillus thuringiensis, Sporosarcina ureae, Sporolactobacillus inulinus, Staphylococcus saprophyticus, Bacillus vallismortis, Planococcus psychrotoleratus и Lactobacillus delbrueckii.

Класс Proteobacteria (грамотрицательные бактерии) представлен 4 видами: Acinetobacter lwoffii, Paracoccus aminovorans, Serratia ficaria и Serratia marcescens.

Класс Actinobacteria представлен 3 видами: Agrococcus jenensis, Kocuria rosea и Micrococcus luteus.

Наряду с бактериями, принадлежащими к родам, обычно широко распространенным в почвенных экосистемах (р.р. Bacillus, Paracoccus, Serratia, актинобактерии), выделены представители редко встречаемых родов бактерий, являющихся кислото- и щелочно-толерантными формами (Acinetobacter и Planococcus соответственно). Причём вид A. lwoffii явился доминантным и обнаружен во всех источниках выделения. Это может быть обусловлено тем, что малопригодные для жизнедеятельности природные субстраты являются благоприятными экологическими нишами для заселения видами, более адаптированными к условиям обитания.

Таблица 2

Таксономический состав сапротрофного бактериального комплекса

Примечание: «-» - не обнаружено

Таксономический анализ видового сообщества бактерий, ассоциированных с корневой зоной обследованных пионерных растений, позволил установить следующие закономерности. Только в корневой зоне растений семейства сосновых выявлены такие бактериальные виды как B. thuringiensis, M. luteus P. аminovorans, S. inulinus, S. ureae и S. saprophyticus. Тогда как в корневой зоне берёзы обнаружены A. jenensis, B. vallismortis, P. psychrotoleratus и S. ficaria. Почвогрунты также отличаются по видовому бактериальному составу от растений. Только в почвогрунтах обнаружены виды K. rosea, S. marcescens и L. delbrueckii. Отмеченные видовые различия могут быть связаны с созданием селективных условий среды обитания для микроорганизмов. Экологические ниши занимают наиболее приспособленные к определённым условиям бактериальные ассоциации.

Следует также отметить, что таксономическое разнообразие сапротрофных бактерий коррелирует с общей численностью и зависит от места выделения. Количественный анализ распределения филогенетических классов бактерий-сапротрофов по исследуемым объектам (почвогрунты и пионерные растения) представлен на рисунке 1. В корневой зоне всех исследуемых растений преобладающими явились бациллы и протеобактерии. Их количество в корневой зоне сосны составило 65 и 68 тыс. КОЕ/г, лиственницы - 43 и 44 тыс. КОЕ/г, берёзы - 43 и 41 тыс. КОЕ/г соответственно. В почвогрунтах доминирующей явилась группа грамотрицательных бактерии в количестве 52 тыс. КОЕ/г. Актинобактерии явились минорными компонентами исследуемого сапротрофного комплекса прокариот, что свидетельствует о невысоком их содержании в таком специфичном местообитании, каким является ризосфера пионерных растений, произрастающих на отвалах россыпного золота. В корневой зоне сосны их количество составило 27 тыс. КОЕ/г, лиственницы - 13 тыс. КОЕ/г, берёзы - 6 тыс. КОЕ/г, в почвогрунтах - 30 тыс. КОЕ/г.

По общему количественному отношению доминирующими явились бациллы (42%) и протеобактерии (38%) от общего числа изолятов. Известно, что бактерии класса Bacilli распространены повсеместно -- в почве, воздухе, водоемах, на растительных остатках и других естественных субстратах. Большинство из них отличаются способностью образовывать споры (рр. Bacillus, Sporosarcina, Sporolactobacillus, Lactobacillus) или цистоподобные покоящиеся клетки (рр. Staphylococcus, Planococcus), обладающие повышенной устойчивостью к внешним воздействиям (Головлев, 1998; Ильинская и др., 2002). Такие формы микроорганизмов остаются жизнеспособными при самых неблагоприятных условиях, выдерживая резкие колебания температуры, отсутствие влаги и воздуха, действие различных неблагоприятных экологических факторов, обычно губительно влияющих на другие организмы. Поэтому среди бесчисленного множества самых различных форм, бактерии класса Bacilli являются наиболее приспособленными к изменениям среды и участвуют во многих биологических процессах в местах своего обитания. В свою очередь, также доминирующие в количественном отношении протеобактерии (A. lwoffii, P. aminovorans, S. ficaria и S. marcescens) можно охарактеризовать как микроорганизмы с высокой степенью устойчивости и длительным сохранением активности в стрессовых условиях местообитания (отвалы россыпной добычи золота). С экофизиологической точки зрения можно прогнозировать потенциальные возможности проявления метаболической активности A. lwoffii, P. aminovorans, S. ficaria и S. marcescens в неблагоприятных природных условиях.

Бактерии актиномицетной линии составили 20% от общего числа штаммов, выделенных из разных мест обитания. По имеющимся литературным сведениям, количественное разнообразие актинобактерий в сравнении с другими бактериальными классами говорит об адаптации прокариот к неблагоприятным условиям (Добровольская, 2002; Atlas, Bartha, 1997). Об этом также свидетельствует и невысокое видовое и количественное разнообразие актинобактерий - класс Actinobacteria во всех исследуемых объектах представлен только тремя видами A. jenensis, K. rosea и M. luteus.

Таким образом, полученные результаты дают основание считать, что соотношение филогенетических групп микроорганизмов в изучаемых экосистемах можно рассматривать как сложившееся сообщество, отражающее начальный процесс восстановления нарушенного биогеоценоза.

3. Таксономический анализ фосфатмобилизующего бактериального комплекса. Второй группой бактерий, используемой нами в качестве модели для изучения и сравнения прокариотных комплексов почвогрунтов и ризосферных микроорганизмов, явилась группа фосфатмобилизующих бактерий.

Одним из малоизученных вопросов в микробиологии фосфора, является метаболический путь превращений этого биогенного элемента под воздействием бактерий. В процессе своей жизнедеятельности бактерии могут использовать два механизма трансформации фосфора: а) растворение минеральных фосфатов в результате образования кислот (литотрофная составляющая); б) ферментативное дефосфолирование органических соединений фосфора при участии ферментов-фосфатаз (гетеротрофная составляющая). Оба механизма состоят из нескольких последовательных метаболических реакций, результатом которых является высвобождение доступного фосфора в виде минеральных легкорастворимых солей фосфорной кислоты в почвенный раствор, и которые поступают далее в корни растений. У большинства бактерий в природных условиях данные механизмы протекают одновременно.

Принимая во внимание, что исследуемые нами почвогрунты имеют близкую к нейтральной реакцию среды (рН6.6), выделение фосфатмобилизующих бактерий осуществляли на селективной среде, содержащей в качестве источника минерального фосфата ортофосфат кальция. Штаммы бактерий, колонии которых образовывали зоны окисления при растворении фосфатов, считали фосфатмобилизующими. Всего в чистую культуру изолировали 11 штаммов (F1-F11). Из них четыре штамма выделили непосредственно из почвогрунтов (F1-F4), три штамма (F5-F7) - из корневой зоны сосны. По два бактериальных штамма изолировали из корневой зоны лиственницы (F8, F9) и берёзы (F10, F11).

Количественный анализ фосфатмобилизующих микроорганизмов показал, что их численность в корнеобитаемом слое исследуемых растений составляет от 3.5 до 7.9 тыс. КОЕ/г, в почвогрунте - 8.3 тыс. КОЕ/г, что составляет 5-10% от общей численности бактерий других физиологический групп, учитываемых нами. Такое соотношение позволяет сделать вывод о недостаточной обеспеченности исследуемого биогеоценоза подвижными соединениями фосфора, что подтверждается аналитическими данными агрохимического состава почвогрунтов.

Полагая, что в природных экотопах с нейтральной реакцией среды, какими являются исследуемые почвогрунты, присутствуют микроорганизмы, обладающие широким диапазоном адаптивных свойств к рН среды, определили возможность выделенных штаммов к мобилизации фосфора на средах с источниками минеральных фосфатов в виде ортофосфатов алюминия и железа. Установили, что способность к окислению этих фосфатов, проявили штаммы F2 и F4. Данные штаммы изолированы нами из свободных от влияния корневой системы почвогрунтов и в процессе окисления фосфатов используют более широкий набор минеральных субстратов в условиях широкого диапазона рН от 3.0 до 8.0.

Изучена способность выделенных штаммов к мобилизации фосфора на средах с органическими источниками фосфора. Установили, что все штаммы, за исключением штамма F2, обладают ферментативной способностью к растворению органических фосфатов.

Видовую принадлежность выделенных бактериальных штаммов установили с использованием молекулярно-генетических методов анализа.

С целью дифференциации изолятов предварительно провели сравнительный анализ фрагментов рестрикции генов их 16S рРНК. Известно, что размер амплифицированного с применением универсальных эубактериальных праймеров гена 16S рРНК у всех бактерий составляет около 1450 п.н. Тогда как нуклеотидные последовательности этого участка гена у разных видов бактерий различаются. С помощью эндонуклеаз рестрикции можно различить бактерии, относящиеся к разным видам.

Первоначально амплифицированные гены 16S рРНК 11 выявленных фосфатмобилизующих штаммов анализировали с помощью эндонуклеазы рестрикции HaeIII. Результаты сравнительного анализа полученных фрагментов позволили выявить 6 типов рестриктазных профилей амплифицированных генов 16S рРНК, следовательно, изучаемые штаммы бактерий разбиваются на 6 групп. В первую группу вошли штаммы F1 и F10. К группе III отнесли штаммы-продуценты F3 и F6. К V группе - штаммы F5, F8, F9, F11, имеющие идентичные рестриктазные профили. Группы II, IV, VI представлены единичными штаммами F2, F4 и F7 соответственно. Для окончательной дифференциации изолятов, попадающих по результатам рестриктазного анализа эндонуклеазой рестрикции HaeIII в группы I, III, V использовали фермент RsaI. Анализ результатов ферментативного расщепления гена 16S рРНК исследуемых штаммов рестриктазой RsaI подтвердил их идентичность.

Для видовой идентификации методом секвенирования было выбрано по одному штамму из каждой группы, выявленной рестриктазным анализом, и проанализированы последовательности генов их 16S рРНК (500 п.н.).

Согласно полученным данным, штамм, представляющий группу I, максимально гомологичен (98.7% сходства) с типовым штаммом Acinetobacter lwoffii DSM 2403. Штамм, представляющий группу II, образует кластер с близкородственным ему типовым штаммом Paenibacillus chitinolyticus IFO 15660 (99.3% гомологии). Ближайшим родственником штамма, представляющего группу III, явился типовой штамм Arthrobacter nitroguaiacolius CCM 4924T (99.6% сходства последовательностей генов 16S рРНК). Штамм, представляющий группу IV, образует кластер с близкородственным ему (97,7% сходства) типовым штаммом Paracoccus aminovorans JCM 7685. Уровень сходства нуклеотидной последовательности штамма, представляющего группу V, с типовым штаммом Brachybacterium rhamnosum LMG 19848 соответствовал 98.6% гомологии. Штамм, представляющий группу VI, максимально гомологичен с типовым штаммом Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (98.4% сходства).

Видовая идентификация проведена на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. По результатам анализа последовательностей гена 16S рРНК обнаруженный уровень сходства нуклеотидных последовательностей изучаемых штаммов с типовыми штаммами соответствует внутривидовому (более 97.7%). Фенотипическая характеристика изучаемых штаммов F1-F11 подтвердила их принадлежность к видам, определенным в результате молекулярно-генетического анализа.

Таким образом, на основе фенотипических признаков, молекулярно-генетических и филогенетических методов анализа установлено, что 11 фосфатмобилизующих штаммов принадлежат к шести видам бактерий, составляющих три класса: Arthrobacter nitroguaiacolius и Brachybacterium rhamnosum (класс Actinobacteria); Paenibacillus chitinolyticus и Staphylococcus saprophyticus (класс Bacilli); Paracoccus aminovorans и Acinetobacter lwoffii (альфа- и гамма-подкласс Proteobacteria соответственно).

4. Сравнительный анализ структуры сапротрофного и фосфатмобилизующего бактериальных комплексов. Сравнительная оценка видового состава сапротрофного и фосфатмобилизующего бактериальных комплексов позволила нам установить некоторые особенности. Численность бактерий-сапротрофов как в почвогрунтах, так и в прикорневой зоне растений преобладала над численностью фосфатмобилизующих бактерий (12-175 тыс. КОЕ/г и 3.5-8.3 тыс. КОЕ/г соответственно). В структуре сапротрофного бактериального комплекса было выделено 14 видов бактерий, тогда как в структуре фосфатмобилизующего - шесть видов.

В составе фосфатмобилизующего комплекса было выделено три вида бактерий A. nitroguaiacolius, B. rhamnosum и P. chitinolyticus, которые не обнаружены в составе сапротрофного комплекса. Это обстоятельство может быть обусловлено как использованием различных селективных сред для выделения данных групп микроорганизмов, так и тем, что выявленные виды являются специфичными фосфатмобилизующими микроорганизмами. Последнее предположение наиболее приемлемо к виду P. chitinolyticus (штамм F2), который характеризуется только литотрофной составляющей механизма трансформации фосфора.

Однако с практической точки зрения следует учитывать, что свойства микроорганизмов, выявленные в лабораторных условиях, в одинаковой степени проявляются не у всех штаммов, принадлежащих к одному виду. В рамках вида, наряду со сходством, существуют и штаммовые различия, обусловленные способностью микроорганизмов приспосабливаться к различным условиям среды обитания. Таким образом, виды бактерий, установленные нами как фосфатмобилизующие, могут обладать и внутривидовой штаммоспецифичностью в процессе мобилизации фосфора.

В пользу штаммоспецифичности видов A. lwoffii, P. aminovorans и S. saprophyticus, обнаруженных в составе обоих исследуемых бактериальных комплексов говорит следующее. В нашем исследовании штаммы вида A. lwoffii в составе фосфатмобилизующего комплекса были выделены из почвогрунтов и корневой зоны берёзы, тогда как в составе сапротрофного комплекса A. lwoffii был обнаружен и в почвогрунтах, и в корневой зоне всех обследованных растений. Фосфатмобилизующий штамм S. saprophyticus был изолирован из корневой зоны лиственницы, тогда как в составе сапротрофного комплекса S. saprophyticus был выделен из корневой зоны и лиственницы, и сосны. Установленный нами как фосфатмобилизующий штамм P. aminovorans был выделен из почвогрунтов, тогда как в составе сапротрофного бактериального комплекса этот вид был выделен как из почвогрунтов, так и из корневой зоны растений семейства сосновых.

При этом интересно отметить, что источники выделения бактерий P. aminovorans и S. saprophyticus в составе как фосфатмобилизующего, так и сапротрофного комплексов, в целом, совпадали. Так S. saprophyticus в составе сапротрофного комплекса изолирован из корневой зоны сосны и лиственницы; при изучении фосфатмобилизующего комплекса штамм этого вида обнаружен в корневой зоне лиственницы. Вид P. aminovorans, выделенный из почвогрунтов и корневой зоны растений семейства сосновых в составе сапротрофного комплекса как фосфатмобилизующий, был также обнаружен в почвогрунтах. Принимая во внимание неоднократную повторность процесса выделения бактерий, можно согласиться с точкой зрения многих исследователей, отмечающих селективную избирательность в отношении друг друга со стороны как видов растений, так и микроорганизмов, заселяющих их корневую систему (Самцевич, 1972; Siciliano, Germida, 1998; Pieta et. al., 1999). Результаты наших исследований количественного учета физиологических групп микроорганизмов также показали селективное участие разных видов растений как на количественные, так и качественные характеристики микробных сообществ прикорневой зоны (Римкевич и др., 2002; Римкевич, Павлова, 2003, 2004).

В настоящее время считается доказанным, что растения в процессе своего роста и развития продуцируют разнообразные химические вещества, стимулирующие или ингибирующие развитие микробных клеток не только внутри жизнедеятельных тканей, но и на некотором расстоянии от них. Можно предположить, что корневые выделения берёзы ингибируют развитие P. aminovorans и S. saprophyticus в её корневой зоне. С другой стороны, вышеперечисленные виды являются как ассоциативными с корневой системой растений семейства сосновых, так и свободноживущими обитателями почвогрунтов. С практической точки зрения, данное свойство растений необходимо учитывать в различных биотехнологических процессах создания бактериологических препаратов, интродуцируемых в почву, для стимулирования роста растений.

5. Биотехнологический потенциал фосфатмобилизующих бактерий. Следующей задачей нашего исследования стало изучение биотехнологического потенциала выделенных штаммов фосфатмобилизующих бактерий в лабораторных модельных экспериментах: степень биогенной мобилизации подвижных форм фосфора в жидкой среде и почвогрунте, способность микроорганизмов изменять кислотность среды, влияние на прорастание семян.

Оценка фосфатмобилизующей и окислительной способности изучаемых штаммов бактерий. В первой серии опытов изучили фосфатмобилизующую способность выделенных штаммов A. nitroguaiacolius, B. rhamnosum, P. chitinolyticus, S. saprophyticus, P. aminovorans и A. lwoffii в жидкой среде, содержащей в качестве источника фосфора ортофосфат кальция. При постановке опытов использовали также бактериальную ассоциацию (БА), составленную из всех шести видов. Проведённые исследования показали, что по истечении семи суток инкубации, во всех вариантах инокуляции обнаруживается увеличение растворимой формы фосфора (рис. 2).

При неизмененном уровне содержания растворимой фракции фосфора в стерильном контроле (885.2 мг/л) повышение растворимого фосфора биомассой штамма A. lwoffii составило 7.0 мг/л, биомассой штамма P. chitinolyticus - 141.5 мг/л, биомассой штамма A. nitroguaiacolius - 37.0 мг/л, биомассой штамма P. aminovorans - 107.0 мг/л, биомассой штамма B. rhamnosum - 161.5 мг/л и биомассой штамма S. saprophyticus - 12.0 мг/л. В варианте с бактериальной ассоциацией накопление растворимого фосфора составило 134.7 мг/л.

Сравнительное изучение фосфатмобилизующей способности изучаемых штаммов показало, что по степени мобилизации фосфора из жидкой среды их можно расположить в следующий ряд: B. rhamnosum (161.5 мг/л) > P. chitinolyticus (141.5 мг/л) > БА (134.7 мг/л) > P. aminovorans (107.0 мг/л) > A. nitroguaiacolius (37.0 мг/л) > S. saprophyticus (12.0 мг/л) > A. lwoffii (7.0 мг/л).

Таким образом, максимальная достоверная степень увеличения подвижного фосфора наблюдалась у штаммов видов B. rhamnosum, P. chitinolyticus, P. aminovorans и БА. Минимальная степень изменения подвижности фосфора в жидкой среде обнаружена у штаммов, относящихся к видам A. nitroguaiacolius, S. saprophyticus и A. lwoffii.

Интересно отметить тот факт, что фосфатмобилизующая способность активных штаммов в некоторой степени коррелирует с изменением ими рН среды. В своей работе Г.Ф. Рубинчик с соавторами (Рубинчик и др., 2003) показали, что уменьшение рН среды способствует наибольшей степени растворения фосфатов. В нашем случае уменьшение рН жидкой среды наблюдали как в варианте инокуляции ассоциацией всех штаммов, так и в чистых культурах B. rhamnosum, P. chitinolyticus, P. aminovorans, показавших достоверно максимальное увеличение подвижного фосфора (рис. 3). В вариантах инокуляции штаммами A. nitroguaiacolius, S. saprophyticus и A. lwoffii, показавших минимальную фосфатмобилизующую способность, установили изменение рН жидкой среды в сторону подщелачивания.

Таким образом, можно сделать вывод, что степень мобилизации фосфора изучаемыми микроорганизмами в большей степени зависит от их способности к кислотообразованию. При понижении рН среды обнаруживается достоверное увеличение подвижного фосфора.

Динамика образования изучаемыми бактериями подвижного фосфора в почвогрунте. Во второй серии опытов изучили динамику накопления растворимого фосфора в почвогрунтах под действием изучаемых штаммов фосфатмобилизующих бактерий. В качестве контроля использовали образцы стерильного почвогрунта, отобранного из отвалов россыпной добычи золота. Продолжительность опыта составила 90 суток, что соответствует среднему вегетационному периоду северных районов Амурской области, где происходит разработка россыпных месторождений. Динамика образования подвижного фосфора в почвогрунтах, обработанных различными вариантами культур, приведена на рисунке 4.

Через семь суток инкубации в вариантах инокуляции штаммами A. lwoffii, P. aminovorans, B. rhamnosum, S. saprophyticus и БА наблюдали значительное снижение количества растворимых форм фосфора в почвогрунте. Данное обстоятельство, по-видимому, можно объяснить использованием растворимых форм фосфатов быстро нарастающей биомассой бактерий за этот временной период. В дальнейшем, через 30 суток инкубации, в вариантах почти со всеми штаммами (за исключением S. saprophyticus), количество подвижного фосфора увеличивается в 1.5-2 раза.

В варианте инокуляции штаммом P. chitinolyticus, через семь суток инкубации уровень подвижного фосфора не изменился, однако по истечении 30 суток отмечали резкое возрастание его концентрации с 63.1 до 100.1 мг/кг почвы. В дальнейшем происходило уменьшение до уровня содержания подвижного фосфора в контрольном варианте.

В варианте обработки почвогрунта штаммом A. nitroguaiacolius, в отличие от остальных изучаемых фосфатмобилизующих микроорганизмов, уже на седьмые сутки наблюдалось увеличение содержания подвижного фосфора в сравнении с контролем. Но с течением времени инкубации уровень его содержания в почвенном растворе уменьшался и по окончании инкубации соответствовал контрольному. Данное обстоятельство можно объяснить разной активностью штаммов или биологическим поглощением подвижного фосфора клетками микроорганизмов в закрытой системе, соответствующей условиям лабораторного эксперимента. Возможно, что в природной среде, обеспечивающей более оптимальные условия для обмена веществ и высвобождения продуктов клеточного метаболизма, иммобилизации фосфора биомассой P. chitinolyticus или A. nitroguaiacolius не происходит.

При обработке почвы штаммом S. saprophyticus повышения подвижных форм фосфора во всех временных интервалах не установили. Вероятно, отсутствие фосфатмобилизующего эффекта у S. saprophyticus может быть связано с тем, что используемые в работе фосфаты (ортофосфат кальция и органофосфаты) не являются субстратами для данного вида.

Таким образом, результаты проведённого модельного опыта показали, что наибольший уровень мобилизации фосфора в почвогрунтах обеспечивают штаммы A. lwoffii, B. rhamnosum, P. aminovorans и P. chitinolyticus; некоторое увеличение уровня подвижного фосфора показал штамм A. nitroguaiacolius, тогда как штамм S. saprophyticus не показал достоверного увеличения подвижного фосфора в почвенном растворе. Можно предположить, что в условиях исследуемого природного субстрата в течение вегетационного периода мобилизацию фосфора из труднодоступных соединений могут осуществлять различные виды бактерий с разными скоростными характеристиками фосфатмобилизующей способности. На начальном этапе высвобождение подвижного фосфора в почвенный раствор может осуществляться бактериями (A nitroguaiacolius), способными к «быстрой» мобилизации, далее в процесс биотрансформации фосфора включаются «медленные» виды A. lwoffii, B. rhamnosum, P. aminovorans и P. chitinolyticus, обеспечивающие высокий уровень растворимого фосфора, доступного для растений.

Влияние фосфатмобилизующих бактерий на прорастание семян. В лабораторных модельных опытах изучили влияние выделенных фосфатмобилизующих штаммов A. nitroguaiacolius, B. rhamnosum, P. chitinolyticus, S. saprophyticus, P. aminovorans и A. lwoffii на прорастание семян.

При оценке влияния изучаемых штаммов на степень прорастания семян в качестве объекта использовали семена сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), произрастающей на исследуемых отвалах россыпной добычи золота и принадлежащей к группе пионерных растений. Обработку семян сосны проводили в трёх вариантах: 1) бактериальной суспензией; 2) культуральной жидкостью; 3) бактериальной биомассой. В выборе вариантов инокуляции исходили из следующих соображений. Микроорганизмы, используя субстраты питательной среды, синтезируют вещества (метаболиты), растут, размножаются и в зависимости от целей культивирования конечным продуктом использования может быть биомасса клеток или какой-либо внеклеточный метаболит. Тогда, в первом случае, отходом будет жидкая часть культуральной среды, а во втором - клетки. В растениеводстве используют как микробную массу (живые микроорганизмы), так и метаболиты микроорганизмов. В некоторых случаях культуральную жидкость не отделяют и употребляют оба компонента совместно (суспензия микроорганизмов) (Kloepper et. al., 1989; Jones, 1998). Выбор вариантов обработки растительного объекта должен осуществляться с учётом наиболее оптимального микробного воздействия на прорастание семян исследуемых растений.