Физиологические эффекты кадмия на модели виргинских устриц (crassostrea virginica)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Физиологические эффекты кадмия на модели виргинских устриц (crassostrea virginica)

03.03.01- Физиология

Иванина Анна Валерьевна

Казань - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

Гильмутдинов Рустам Якубович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Логинов Георгий Павлович

доктор биологических наук, профессор

Нигматуллина Разина Рамазановна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится « 27 » января 2012 г. в 14 ⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д-220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»: 420074, Казань, Сибирский тракт, 35, тел. (8432) 73-96-17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»

Автореферат разослан « 27 » декабря 2011 года и размещен на сайтах http: // www.mon.gov. ru/ и // www. ksavm.senet.ru/

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологический наук, профессор Мухаметгалиев Н.Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кадмий обладает разносторонними биологическими свойствами (Thevenod F., 2009; Hyun S. et al., 2006 и др.). Это достаточно «сложный» элемент; отношение к нему медицинских и ветеринарных специалистов достаточно осторожное, поскольку он хорошо известен своей токсичностью. При этом его относят как к группе «новых» микроэлементов (кадмий, ванадий, кремний, олово, фтор), так и, наряду с Pb, Sn и Rb, к условно необходимым микроэлементам и в низких концентрациях он способен стимулировать рост (Авцын А.П. и др., 1991; Скальный А.В., 2004). В последние годы возрос интерес отечественных исследователей к кадмию, рассмотрены его физиологические эффекты на сельскохозяйственных животных (Савчук С.В., 2003; Матиосов А.Д., 2004; Артемьева О.А., 2005; Кияева Е.В., 2010).

Механизмы действия кадмия охватывают большое число критических физиологических, в первую очередь клеточных, функций. Он влияет на многие процессы организма, в том числе метаболические, путем прямого и опосредованного действия на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими HS- и RS-группы, заменяя металлы в содержащих их ферментах (Виселина Т.Н., Лукьянова О.Н., 2000; Андриянова Е.Е., Куличенко И.С., 2002; Amiard J.C., et al. 2006 и др.). Полагают, что действие кадмия связано не только с его физиологической активностью, но и способностью вытеснять другие жизненно необходимые для организма микроэлементы, такие как цинк, медь, железо (Pinot F et al., 2000; Hodgson A., 2010).

Между тем, действие кадмия на морских гидробионтов, в частности устриц, которые концентрируют его в значительном количестве, изучено мало. Недостаточно сравнительных сведений, раскрывающих механизм эффектов кадмия на организменном, тканевом и клеточном уровнях. В связи с вышеизложенным, изучение особенностей физиологического действия кадмия на разных уровнях организации животного организма имеет большое теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение различных физиологических процессов у виргинских устриц (Crassostrea virginica) при воздействии кадмия.

Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. Определить распределение кадмия в значимых тканях виргинских устриц.

2. Оценить дыхательные функции виргинских устриц при воздействии кадмием.

3. Изучить состояние систем защиты первой группы (металлотионеины и П-гликопротеины) и репарации клеточных повреждений у виргинских устриц при воздействии кадмием.

4. Исследовать аэробный и анаэробный метаболизмы виргинских устриц при воздействии кадмием.

Научная новизна работы. Впервые на модели виргинских устриц показаны особенности изменения дыхательных функций различных морфо-функциональных структур животного организма при воздействии кадмием. Впервые оценено влияние кадмия на аэробный и анаэробный метаболизмы, а именно на активность некоторых ключевых ферментов, у виргинских устриц. Впервые на виргинских устрицах in vitro установлены изменения в синтезе белков при действии кадмия, а также взаимосвязь общего синтеза белка с экспрессией металлсвязывающих (металлотионеины) и репарирующих (белки теплового шока) белков. Впервые продемонстрирована возможность использования молекулярных, биохимических и физиологических биомаркеров для изучения эффектов кадмия на животный организм.

Практическая ценность работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизмов влияния кадмия на различные морфо-функциональные структуры организма. Результаты исследований могут найти применение при прогнозировании влияния кадмия на состояние водных экосистем. Показана возможность использования клеток при оценке эффектов действия кадмия.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на международных конференциях ”SEB” (Марсель, 2008); ”SEB” (Глазго, 2009); ”APS Intersociety Meeting: Global Change and Global Science: Comparative Physiology in a Changing World”, (Вестминстер, 2010); ”Physiomar 10” (Квебек, 2010); Международных научно-практических конференциях “Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность” (Казань, 2010); конференции, посвященной 80-летию факультета биотехнологии и стандартизации Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (Казань, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Распределение кадмия в клетках жабер и гепатопанкреаса в условиях in vivo и in vitro.

2. Особенности клеточного, тканевого и организменного уровней эффектов кадмия на модели устриц.

3. Изменения аэробного и анаэробного метаболизмов у виргинских устриц под влиянием кадмия.

4. Протеосинтетический ответ разных морфологических структур устриц при воздействии кадмием.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов», а также выводов, практических предложений и списка литературы. Работа содержит 8 таблиц и 18 рисунков. Список литературы включает 271 библиографических источников, в том числе - 185 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины в течение 2006-2011 гг. Экспериментальная часть проведена в лаборатории физиологии и токсикологии морских организмов Университета Северной Каролины (США).

Объектом исследования служили виргинские устрицы (Crassostrea virginica), которых помещали в хорошо аэрируемые аквариумы с искусственной морской водой при 20±1 °С и солености 30 ‰. В качестве корма использовали коммерческий препарат ”DT's Live Marine Phytoplancton” (США), содержащий Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum и Chlorella. Устриц, предварительно адаптированных в течение 12-14 суток, разделили случайным образом на две группы (контрольную и опытную, содержавшуюся в искусственной морской воде с 50 мкг/л кадмия хлорида). После измерения дыхания на целом организме, отдельных тканях и изолированных клетках, жабры и гепатопанкреас устриц замораживались в жидком азоте для дальнейших анализов. Скорость дыхания (МО₂) определяли в проточных камерах. Кислородный микросенсор TX-100 (“Pre-Sens”, Германия) калибровался в бескислородном насыщенном растворе сульфита натрия (Na₂SO₃) и насыщенной (100 %) кислородом морской воде. Калибровка и измерения проводились при 20 °С. Парциальное давление кислорода в гемолимфе (PO₂) определяли в течение 24 ч. Кислородный микросенсор внедряли в перикардиум устриц через небольшое отверстие в верхней раковине и фиксировали воском для предотвращения смещения микросенсора. Длительность активного дыхания оценивалась, как % времени, которое устрицы провели с открытой раковиной при активной вентиляции мантийной полости, к общей продолжительности измерений - 7-97 ч. При характеристике дыхания в изолированных жабрах, их небольшой фрагмент (0,1-0,14 г) переносили на пластиковую решетку с размером ячеек 1х1 мм (для максимального контакта поверхности ткани с инкубационной средой) и помещали в соответствующую камеру, где находилось 3 мл инкубационной среды с антибиотиками. Дыхание измерялось в течение 20 мин. Для определения влияния кадмия на скорость клеточного дыхания, клетки выделялись из жабер и гепатопанкреаса контрольных устриц и инкубировались в течение 24 ч с разными концентрациями (10-50 мкмоль/л) кадмия хлорида или в его отсутствии (контроль). При измерении количества кислорода, потребляемого митохондриями клеток жабер, в качестве субстрата использовали сукцинат (10-15 мМ) в присутствии 5 мкМ ротенона. Скорость максимального дыхания (State 3) оценивали в результате дополнительного добавления 200-300 нМ АДФ; State 4 определяли в митохондриях, инкубированных с АДФ. Концентрацию кадмия в изолированных клетках и тканях устриц определяли спектрометром AAnalyst 800 (“Perkin Elmer”). Для выделения мРНК использовали Tri Reagent. РНК очищалась от примеси ДНК с помощью набора DNA-Free RNA Kit (“Zymo-Research”). Для синтеза кДНК использовали стандартный протокол. Экспрессия мРНК для исследуемых генов была измерена с помощью количественного ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР). Уровень транскрипта для исследуемого гена был нормализован относительно экспрессии мРНК в-актина и внутреннего стандарта. Белок выделяли из тканей жабер и гепатопанкреаса, определяли его содержание и наносили на гель, предварительно выровняв их концентрации по методу Bredford M. (1976). Электрофорез проводили в блоках полиакриламидного геля в модифицированной системе Laemmli U.K. (1970). Денситометрический анализ осуществляли с помощью GelDoc 2000^TM System с программой Quality one 1-d Analysis (“BIO RAD”). Синтез белка и глютатиона определяли, оценивая включение в клетку радиоктивномеченного L-лейцина ([³H] Лей) или L-глицина ([³H] Гли), соответственно (Bonifacino J.S., 1999). Для измерения метаболитов ткани жабер и гепатопанкреаса размалывали в ступке пестиком в присутствии жидкого азота, добавляли 5 объемов ледяной 0,6 М перхлорной кислоты с 150 мМ ЭДТА для максимального выделения АТФ. Осажденные белки удалялись центрифугированием образцов при 20 000 g 10 мин при 4 °С. Экстракты нейтрализовали с 5 М КОН до рН 7,2-7,5, образцы хранились при -80 °С. Концентрацию метаболитов в нейтрализованных экстрактах измеряли стандартным методом (Bergmeyer H.U., 1985). Содержание гликогена определяли после его ферментативного гидролиза до D-глюкозы с помощью глюкозоамилазы (Keppler, D., Decker, K., 1984) и вычисляли как разницу в уровне D-глюкозы ткани до и после гидролиза. Для вычисления количества энергии, запасенной в виде аденилатов (АЭЗ - аденилатный энергетический заряд), использовали формулу:

АЭЗ = ,

где [АТФ], [АДФ] и [АМФ] - концентрации аденилатов (мкМ/г ткани).

Активность гликолитических (гексокиназа ЕС 2.7.1.1 и альдолаза ЕС 4.1.2.13) и митохондриальных (цитратсинтаза ЕС 2.3.3.1 и цитохром С оксидаза ЕС 1.9.3.1) ферментов определяли в гепатопанкреасе устриц стандартным спектрофотометрическим методом. Количество жиров измеряли экстрагированием их хлороформом (Iverson S.J. et al., 2001). Мембранную фракцию клеток изолировали методом Crockett E. (1999), а митохондриальную - методом Crockett E., Sidell B.D. (1993). Активность П-гп в изолированных жабрах устриц измеряли, используя модифицированный метод Smital T. et al. (2000), а в митохондриях - на State 4 по разнице поглощения флуоресцентного красителя родамина 123 (Р 123) при 20 °С в присутствии и без П-гп ингибиторов.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1 Распределение кадмия в клетках жабер и гепатопанкреаса устриц в условиях in vivo и in vitro

При содержании устриц в воде с кадмия хлоридом кадмий распределялся в жабрах и в гепатопанкреасе неравномерно. В жабрах содержание его было в 3,5 раза выше, чем в гепатопанкреасе (89,67±20,40 и 25,95±6,55 мкг/г, соответственно). В опытах же in vitro с изолированными клетками жабер и гепатопанкреаса, содержание кадмия, наоборот, было выше в клетках гепатопанкреаса. При инкубации клеток с 50 мкг/л кадмия хлорида содержание этого металла в клетках гепатопанкреаса составило 324,56±10,83 нг/10⁶ клеток; а в клетках жабер - 155,75± 10,83 нг/10⁶ клеток.

2.2.2 Аэробный и анаэробный метаболизмы виргинских устриц при воздействии кадмия хлорида

Экспозиция с кадмия хлоридом не вызывала изменений в скорости дыхания устриц (р>0,05) и относительной длительности активности (р>0,05); парциальное давление кислорода в гемолимфе возрастало (P<0,01). Изменение скорости дыхания жабер при экспозиции устриц в воде с CdCl₂ показано на рис. 1.

Рисунок 1 - Скорость потребления кислорода тканью жабер виргинских устриц при действии кадмия (n=14)

Примечание: * - различия между контролем и опытом достоверны (р<0,05)

Согласно представленной гистограмме, экспозиция устриц в воде с кадмия хлоридом увеличивает скорость потребления кислорода в изолированной ткани жабер на 46 % (р<0,01).

Общее клеточное и митохондриальное дыхание при нахождении клеток в среде с 10-50 мкмоль/л CdCl₂ увеличилось на 40 % (р<0,01). В тоже время, митохондриальный выход протонов оставался на прежнем уровне (р>0,05). Полученные данные свидетельствуют об увеличении потребности в кислороде клеток и тканей устриц при действии кадмия хлорида.

В контрольной группе устриц содержание гликогена в жабрах было выше, чем в гепатопанкреасе (р<0,01). Инкубирование в воде с CdCl₂ не изменяло концентрации гликогена в жабрах и гепатопанкреасе устриц (р>0,05), но увеличивало количество запасенных жиров в жабрах (р<0,01), при неизменности их количества в гепатопанкреасе. Содержание белков, одинаковое в жабрах и гепатопанкреасе контрольной группы устриц (р>0,05), при инкубации в воде с CdCl₂ увеличилось в жабрах (р<0,05) и оставалось неизменным в гепатопанкреасе (р>0,05).

Концентрация L-аланина в жабрах и в гепатопанкреасе при экспозиции устриц в воде с CdCl₂ снижалась (р<0,01). Содержание ацетата, одного из конечных продуктов анаэробного метаболизма в митохондриях, у устриц, содержавшихся в воде с кадмия хлоридом, уменьшилось в жабрах (р<0,01) и осталось неизменным в гепатопанкреасе (р>0,05). Концентрация сукцината имела тенденцию к увеличению в жабрах и гепатопанкреасе устриц опытной группы, но это повышение было недостоверным (р>0,05). Уровни АТФ и АДФ в жабрах и гепатопанкреасе устриц контрольной и опытной групп не отличались (р>0,05). Концентрация же АМФ в клетках жабер устриц, содержащихся в воде с кадмия хлоридом, была ниже, чем в контрольной группе (р<0,05), тогда как уровень АМФ в гепатопанкреасе не изменялся. Количество фосфо-L-аргинина жабрах и гепатопанкреасе контрольной группы устриц отличалось (р<0,01). При содержании устриц в воде с кадмия хлоридом концентрация фосфо-L-аргинина в клетках жабер и гепатопанкреаса имела тенденцию к возрастанию, но это увеличение было недостоверно (р>0,05); также не изменялась концентрация L-аргинина в клетках жабер и гепатопанкреаса (р>0,05). Кадмий не оказывал влияния и на аденилатный энергетический заряд в клетках этих органов (р>0,05). При содержании в воде с кадмия хлоридом соотношение АДФ/АТФ в клетках жабер и гепатопанкреаса устриц не изменялось (р>0,05), тогда как сумма аденилатов увеличивалась (р<0,05). Кадмий вызывал повышение активности таких ферментов гликолиза, как гексокиназа и альдолаза (р<0,01). При инкубации в воде с кадмия хлоридом возрастала активность и одного из ферментов цикла Кребса - цитратсинтазы (р<0,01). Активность цитохрома с-оксидазы в гепатопанкреасе устриц при содержании в воде с кадмия хлоридом не изменялась (р>0,05). Кадмий влиял на экспрессию мРНК генов, кодирующих ферменты гексокиназу, альдолазу, цитратсинтазу и цитохром С-оксидазу (р>0,05). Полученные данные по увеличению активности ферментов могут свидетельствовать об ориентировании метаболизма устриц опытной группы на гликолиз, в тоже время отсутствие накопления конечных продуктов метаболизма и снижение концентрации АТФ говорит об ингибировании отдельных метаболических путей.

виргинский устрица кадмий

2.2.3 Защитные механизмы клетки при воздействии кадмия

Синтез белков в изолированных клетках гепатопанкреаса был в 2 раза выше, чем в клетках жабер, при минимальной достоверности разницы (р>0,05) из-за большой вариабельности показателей. Инкубация клеток с кадмия хлоридом привела к синтезу белков de novo. Скорость синтеза глютатиона, оцененная по включению [³Н] Гли, имела тенденцию к уменьшению в клетках гепатопанкреаса при инкубации с кадмия хлоридом, и оставалась неизменной в клетках жабер (р>0,05 для обеих тканей).

Содержание устриц в воде с CdCl₂ вызывало увеличение уровня экспрессии мРНК металлотионеинов как в жабрах - в 32 раза, так и в гепатопанкреасе - в 5 раз (р<0,01 для обеих тканей). Не выявлено эффекта кадмия на мРНК экспрессию п-гликопротеина (п-гп) в жабрах и гепатопанкреасе (р>0,05).

В контрольной группе устриц уровень металлотионеина I (МT I), экспрессирующегося конститутивно, в клетках гепатопанкреаса был ниже (0,28 ± 0,08), чем в клетках жабер (1,05 ± 0,42) (р<0,05), тогда как разница в экспрессии общего пула металлотионеинов (МТ I+II) в клетках жабер и гепатопанкреаса отсутствовала (р>0,05). Экспозиция клеток с кадмия хлоридом привела к достоверному увеличению экспрессии металлотионеинов в клетках гепатопанкреаса, но не жабер. Уровень экспрессии общего пула металлотионеинов (МТ I+II) в изолированных клетках гепатопанкреаса после экспозиции с кадмия хлоридом был в 2,5 раза выше, чем в клетках жабер (р<0,05 и р>0,05, соответственно). Уровень экспрессии мРНК металлотионеинов МТ I увеличился в 3 раза при той же концентрации кадмия хлорида (р<0,05 - для гепатопанкреаса, р>0,05 - для жабер). Выявленные различия в действии кадмия in vivo и in vitro могут свидетельствовать о более низкой скорости транскрипции МТ в клетках жабер в присутствии кадмия, и связи этого процесса с замедленной биосинтетической активностью жабер.

Экспрессия П-гликопротеина на уровне белка при воздействии кадмия хлорида представлена на рис. 2.

С помощью иммуноблоттинга выявлена экспрессия П-гп в мембранной и митохондриальной фракциях жабер и гепатопанкреаса контрольной и опытной групп устриц. Уровень экспрессии, выраженный в единицах абсорбции, был одинаков в обеих фракциях.

Рисунок 2 - Экспрессия П-гп на уровне белка в клетках жабер и гепатопанкреаса при воздействии кадмия хлорида (n=5)

Примечание: ** - различия между контролем и опытом достоверны (р<0,01)

В мембранной фракции жабер контрольных устриц уровень экспрессии П-гп был в два раза выше, в сравнении с гепатопанкреасом (р<0,01), тогда как в митохондриальной фракции уровень экспрессии П-гп исследованных тканей не отличался (р>0,05). Содержание устриц в воде с кадмия хлоридом увеличивало экспрессию П-гп в мембранной фракции жабер и гепатопанкреаса (р<0,01), но не влияло на уровень экспрессии в их митохондриальной фракции (р>0,05). Данные о влиянии кадмия на активность П-гп представлены в таблице 1. У устриц, содержавшихся в воде с кадмия хлоридом, общая скорость переноса флуоресцентного красителя родамина Б (РБ) и активность П-гп в переносе РБ были выше, в сравнении с контрольной группой. В контрольной группе от 27 (при использовании верапамила и JS-2190, в качестве ингибиторов) до 51 % (при использовании циклоспорина А) РБ переносилось из клетки во внешнюю среду в результате активности П-гп. В жабрах устриц, содержащихся в воде с кадмия хлоридом, 71-83 % РБ было перенесено в результате активности П-гп. Скорость переноса РБ, не связанная с активностью П-гп, была одинаковой в контрольной и опытной группах (28-42 пмоль РБ /г ткани/ мин и 22-39 пмоль РБ /г ткани/ мин, соответственно). В то же время, П-гп - зависимый перенос РБ, был в 3,5-7 раз выше в жабрах устриц, содержавшихся в воде с кадмия хлоридом, в сравнении с контролем (р<0,05 для всех использованных ингибиторов).

Таблица 1 - Влияние ингибиторов П-гп на его активность (пмоль /г ткани/ мин) в изолированных жабрах и митохондриях при воздействии кадмия (n=7)

Примечание: * - различия между контролем и опытом достоверны (р<0,05)

Скорость поглощения флуоресцентного красителя родамина 123 (Р 123) была выше в изолированных митохондриях устриц, экспонированных с кадмия хлоридом, в сравнении с контролем, но повышение скорости не было достоверным (р>0,05). Ингибиторы также не оказывали влияния на скорость поглощения Р 123 митохондриями (р>0,05). В то же время, при инкубации с ингибиторами изолированных митохондрий из клеток жабер устриц, содержавшихся в воде с кадмия хлоридом, количество Р 123 уменьшалось (р<0,05 - для верапамила и р<0,05 - для JS-2190), тогда как в митохондриях контрольной группы устриц этот эффект не обнаружен (р>0,05). Таким образом, подученные данные по активности П-гп в митохондриях устриц опытной группы показывают перенос субстрата (в качестве чего выступает кадмия связанный с глютатионом) из митохондрий в цитозоль для защиты этих органелл от действия кадмия.

Экспрессия белков теплового шока (БТШ) в жабрах и гепатопанкреасе виргинских устриц представлена в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние кадмия на экспрессию БТШ (единицы абсорбции) в жабрах и гепатопанкреасе устриц (n=5)

Примечание: **- различия между контролем и опытом достоверны (р < 0,01)

Уровень митохондриального БТШ 60 в жабрах и гепатопанкреасе устриц контрольной группы не отличался (р>0,05) и кадмий не влиял на экспрессию БТШ 60 в них (р>0,05). Отсутствующая экспрессия БТШ 69 (индуцибельная форма семейства БТШ 70) в жабрах и гепатопанкреасе контрольных устриц, индуцировалась кадмием в обеих исследуемых тканях (р<0,01). Экспрессия конститутивных форм БТШ 72-28 семейства БТШ 70 была одинаковой в жабрах и гепатопанкреасе контрольных устриц (р>0,05), и не изменялась при содержании устриц в воде с кадмия хлоридом (р>0,05). Экспрессия цитозольного БТШ 90 была одинаковой в обеих тканях контрольной группы устриц (р>0,05) и увеличивалась в гепатопанкреасе устриц, экспонированных с кадмия хлоридом (р<0,01), в то время как уровень экспрессии БТШ 90 в жабрах от контроля не отличался (р>0,05). Наличие экспрессии БТШ 70 доказывает повреждение кадмием цитозольных белков в исследуемых тканях.

Анализ экспрессии БТШ 60, 70 и 90 с помощью вестерн блотта показал влияние кадмия in vitro на увеличение экспрессии исследуемых белков. Экспрессия митохондриального БТШ 60 увеличивалась при инкубации изолированных клеток жабер с кадмия хлоридом (р<0,01) и оставалась неизменной в клетках гепатопанкреаса (р>0,05). Экспрессия общего пула БТШ 70 при действии кадмия достоверно увеличивалась в изолированных клетках жабер (р<0,01) и не изменялась в клетках гепатопанкреаса (р>0,05). Уровень экспрессии цитозольного БТШ 90 при добавлении кадмия хлорида оставался неизменным в изолированных клетках как жабер, так и гепатопанкреаса (эффект Cd: р>0,05 и эффект ткани: р<0,01). Экспрессия БТШ в клетках жабер говорит о повреждении их кадмием.

ВЫВОДЫ

1. Клеточные эффекты кадмия в условиях in vivo и in vitro принципиально отличаются. Повышенное содержание кадмия в изолированных клетках гепатопанкреаса в сравнении с клетками жабер «противоречит» данным, полученным in vivo, когда кадмия было больше в жабрах. В первом случае распределение кадмия определяется способностью собственно клеток поглощать и удерживать его, тогда как в экспериментах in vivo этот металл концентрируется в органе, который соприкасается с более высокими его уровнями.

2. Интенсивность дыхательных процессов устриц при экспозиции устриц с 50 мкг/л CdCl₂ может меняться разнонаправлено (т.е. либо возрастать, либо падать), тогда как дыхательные процессы в тканях и клетках однозначно активизируются. Скорость потребления кислорода в жабрах увеличивается в 1,5 раза, а клеток - в 1,4 раза. Инкубация клеток с кадмия хлоридом увеличивает как общую (от 1,29±0,15 до 1,75±0,18 мкмоль О₂/ мин 10⁶ клеток), так и митохондриальную (от 1,20 ±0,11 до 1,69±0,24 мкмоль О₂/ мин 10⁶ клеток) скорость дыхания.

3. Анаэробный и аэробный варианты метаболизма при контакте с кадмия хлоридом устриц активизируются. Возрастает активность гексокиназы, альдолазы и цитратсинтазы, но снижается или не изменяется концентрация конечных продуктов метаболизма (L-аланина - от 10,4 до 5,12 мкмоль/г в жабрах и от 9,6 до 6,2 мкмоль/г в гепатопанкреасе; ацетата - от 1,48 до 0,84 мкмоль/г в жабрах; концентрация сукцината сохраняется на том же уровне в обеих тканях), что свидетельствует об ингибировании отдельных метаболических путей.

4. У устриц опытной группы общее количество аденилатов в жабрах снизилось в результате уменьшения концентрации АТФ (от 3,42±0,16 до 2,39±0,18 мкмоль/г), тогда как в гепатопанкреасе опытной группы, наоборот, увеличилось, за счет увеличения концентрации АТФ (от 2,43±0,12 до 3,85±0,78). Эти данные свидетельствуют о наличии разных механизмов регуляции метаболизма в жабрах и гепатопанкреасе устриц.

5. Эффект кадмия на протеосинтетический ответ жабер и гепатопанкреаса на клеточном и тканевом уровнях имеет особенности. В обоих органах кадмий вызывал увеличение экспрессии металлотионеинов (в жабрах экспрессия возрастала от 0,49 до 16,4, в гепатопанкреасе - от 3,66 до 20,64) и белков теплового шока (БТШ 69 - в 9 раз в обеих тканях), свидетельствующее о повреждении внутриклеточных белков. В изолированных же клетках увеличивалась экспрессии либо металлотионеинов (гепатопанкреас - в 2,5-7,8 раза), либо белков теплового шока (жабры - 1,24-1,73 раза).

6. При воздействии кадмия хлорида в условиях in vivo увеличивается активность П-гликопротеина в митохондриях (в 3,27 раз) и мембранах клеток (в 2,32 раза), тогда как увеличение экспрессии этого белка отмечается только на уровне мембран (в 1,38 и 2,38 раз жабер и гепатопанкреаса соответственно).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕЛОЖЕНИЯ

Полученные данные могут служить научно-методической основой для использования молекулярных, биохимических и физиологических биомаркеров (экспрессия металлотионеинов, БТШ, активность П-гп, накопление кадмия, скорость дыхания) с целью определения эффектов воздействия кадмия на животный организм.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ivanina, A.V. Effects of cadmium on cellular protein and glutathione synthesis and expression of stress proteins in eastern oysters, Crassostrea virginica Gmelin / A.V. Ivanina, A.S. Cherkasov, I.M. Sokolova // Journal of Experimental Biology. - 2008. - v. 211. - P. 577-586.

2. Ivanina, A.V. Effects of cadmium exposure on expression and activity of P-glycoprotein in eastern oysters, Crassostrea virginica Gmelin / A.V. Ivanina, I.M. Sokolova // Aquatic Toxicology. - 2008. - v. 88. - P. 19-28.

3. Ivanina, A.V. Effects of cadmium exposure and intermittent anoxia on nitric oxide metabolism in eastern oysters Crassostrea virginica / A.V. Ivanina, S. Eilers, I.O. Kurochkin, et al. // Journal of Experimental Biology. - 2010. - v. 213. - P. 433-444.

4. Kurochkin, I.O. Cadmium affects metabolic responses to prolonged anoxia and reoxygenation in eastern oysters (Crassostrea virginica) / I.O. Kurochkin, A.V. Ivanina, S. Eilers, C.A. Downs, L.A. May, I.M. Sokolova // American Journal of Physiology Regul. Integr. Comp. Physiol. - 2009. - v. 297. - № 5. - P. R1262-R1272.

5. Иванина, А.В. Влияния кадмия на энергообеспеченность различных тканей животного организма на модели виргинской устрицы (Crassostrea virginica) / А.В. Иванина, И.М. Соколова, Р.Я. Гильмутдинов // Ветеринарный врач. - 2011. - № 6.

6. Иванина, А.В. Биологические эффекты кадмия in vivo и in vitro на животную клетку / А.В. Иванина / Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - Казань, 2012.

Размещено на Allbest.ru