Стрессовая чувствительность и физиологические особенности адаптации кур в условиях промышленного содержания

Размещено на http://www.allbest.ru/

СТРЕССОВАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ КУР В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Мифтахутдинов Алевтин Викторович

Казань 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская государственная академия ветеринарной медицины»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Кузнецов Александр Иванович

Официальные оппоненты: Каримова Руфия Габдельхаевна, доктор биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», доцент кафедры физиологии

Любин Николай Александрович, доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», заведующий кафедрой морфологии, физиологии и фармакологии

Котомцев Вячеслав Владимирович, доктор биологических наук, профессор, старший научный сотрудник лаборатории иммунофизиологии и иммунофармакологии Уральского отделения РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия», г. Чебоксары

Защита состоится 13 декабря 2013 года, в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.034.02 при ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» по адресу: 420029, г. Казань, Сибирский тракт, 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».

Автореферат разослан «____»_____________2013 года и размещён на сайтах http://www.vak.ed.gov.ru/ и http://www.ksavm.senet.ru/

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Р.Я. Гильмутдинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Промышленное птицеводство - технологически оснащенная отрасль сельского хозяйства, характеризующаяся использованием высокопродуктивных кроссов, системы сбалансированного питания и условий содержания птиц, способствующих наиболее полной реализации их генетического потенциала (Фисинин В.И., 2012). Несмотря на это, важной проблемой птицеводства является несоответствие важнейших производственных характеристик кур с биологическими потребностями, способствующими выживанию во внешней среде, проявляющиеся особенно остро при действии на организм птиц факторов, вызывающих стрессы (Фисинин В.И. с соавт., 1975-1979, 2009; Гордеева Т.Г., 2012; Tauson R., 1997 и др.).

Методы профилактики стрессов и их последствий включают несколько направлений, наиболее значимыми из которых являются - фармакокоррекция стрессовых состояний, селекция кур по степени устойчивости к стрессам и технологические приемы, направленные на формирование социально-устойчивых производственных групп. По данным зарубежных исследователей P. Hocking et al. (2004), E. Ellen et al. (2008) и др., агрессию кур и хронический социальный стресс можно устранить путем глубокого изучения этологии и подбора соответствующих групп на основании тщательного генетического отбора, в том числе и по степени устойчивости к стрессам.

Одним из подходов, способствующим профилактике стрессового состояния кур, может быть отбор по степени чувствительности к стрессам. Формирование стресс-устойчивых промышленных стад и внедрение методов селекционно-племенной работы с учетом уровня чувствительности к стрессам позволит, наряду с существующим прогрессом в генетике, направленным на рост продуктивности, решить важнейшую задачу - повышение однородности и социальной устойчивости промышленных стад.

Линии, отобранные по признакам лучшей адаптированности к стрессам, обладают более высокой выживаемостью, продуктивностью и резистентностью (Кичеева Т.Г. с соавт., 2008; Gross W., Siegel H., 1983; Cheng H. et al., 2004 и др.). Разработанные методы оценки стрессовой чувствительности и состояния стресса у кур имеют высокую ценность для понимания индивидуальных особенностей адаптации организма, однако использование их в практической работе осложняется трудоемкостью, а также сложностью интерпретации результатов эндокринологических и иммунологических исследований. В связи с этим, наиболее целесообразным может быть прогностический принцип оценки стрессовой устойчивости стада кур путем группового отбора, отражающий особенности адаптации в условиях производственной среды обитания.

Несмотря на высокую актуальность изучения обозначенных проблем, в птицеводстве отсутствует единый подход к диагностике стрессов и стрессовой чувствительности, не развиты методологические принципы селекции и комплектования промышленных стад кур в зависимости от стрессовой устойчивости к стрессам (Забудский Ю.И., 2002; Dawkins M.S., 2003).

Всё вышеизложенное определяет актуальность исследования феномена стрессовой устойчивости птиц, разработки методов диагностики стрессовой чувствительности и состояния стресса у кур в условиях производственной среды обитания.

Степень разработанности проблемы. Теоретической основой исследований служили работы И.П. Павлова (1912-1913), П.К. Анохина (1975), Г. Селье (1956), Л.Е. Панина (1978-1983), Ф.3. Меерсона, М.Г. Пшенниковой (1988), Л.X. Гаркави с соавт. (1998), А.Б. Мулик (2001) и др. Для изучения феномена стрессовой чувствительности у сельскохозяйственных животных использовались работы отечественных и зарубежных ученых А.И. Кузнецова (1991-2012), Т.Г. Кичеевой (2001), W. Gross, H. Siegel (1973-1983), H. Cheng (2002-2009) и др. Для исследования особенностей адаптации кур в условиях промышленного содержания использованы методологические принципы, представленные в трудах В.И. Фисинина (1975-2013), П.Ф. Сурай (2009-2013), Ю.И. Забудского (1988-2012) и др. Для изучения целесообразности использования лития цитрата в качестве антистрессового препарата для снижения проявления общего адаптационного синдрома при тестировании кур на стрессовую чувствительность использовались работы С.Н. Преображенского с соавт. (1988-2006).

Отбор и подбор родительских форм по признаку стрессовой чувствительности способствует более полному использованию биологических возможностей продуктивных животных, в проанализированных работах, посвященных изучению этого вопроса, не представлены исследования, затрагивающие физиологические особенности адаптации кур с разным уровнем стрессовой чувствительности в условиях производственной среды обитания. Так же отсутствуют единые методические подходы, позволяющие оценивать уровень стрессовой чувствительности и специфические маркерные признаки устойчивости к стрессам в условиях промышленного содержания кур.

Работа является частью комплексных исследований кафедры физиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» - «Разработка и внедрение здоровьесберегающих технологий в животноводстве и птицеводстве» номер государственной регистрации №0120.0801292.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось изучение стрессовой чувствительности, как физиологической характеристики, обуславливающей особенности проявления адаптационных реакций и оказывающей влияние на хозяйственно-биологические качества кур в условиях производственной среды обитания.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать метод определения стрессовой чувствительности у кур мясного направления продуктивности.

2. Определить степень распространения стрессовой чувствительности кур в условиях промышленного птицеводства.

3. Изучить неспецифические адаптационные реакции у кур с разным уровнем стрессовой чувствительности.

4. Дать сравнительную характеристику физиологических особенностей кур с разной стрессовой чувствительностью.

5. Изучить особенности липидного обмена, активности прооксидантной и антиоксидантной систем организма кур с разной стрессовой чувствительностью.

6. Определить взаимосвязь хозяйственно-биологических качеств кур с уровнем их стрессовой чувствительности.

7. Разработать способы определения стрессового состояния кур в условиях промышленного содержания.

8. Установить индикативные признаки стрессовой чувствительности у кур. куры стрессовый чувствительность липидный

Научная новизна. В работе обоснована гипотеза о том, что стрессовая чувствительность является важной физиологической характеристикой кур в промышленной среде обитания, обуславливающая неодинаковый уровень общей неспецифической реактивности и влияющая на поведение, продуктивные и воспроизводительные качества птиц. Экспериментальным путем разработан метод определения стрессовой чувствительности кур мясного направления продуктивности и обоснована его эффективность при тестировании родительского стада и цыплят-бройлеров (патент РФ на изобретение №2454861). Изучено соотношение особей с неодинаковой чувствительностью к стрессам в промышленных стадах кур кросса ISA-15 и петухах M99. Выявлены особенности проявления неспецифических адаптационных реакций у кур с разной стрессовой чувствительностью на уровне эндокринной и лейкоцитарной систем, липидного обмена, прооксидантных и антиоксидантных процессов в организме. Изучена зависимость хозяйственно-биологических качеств кур от уровня их стрессовой чувствительности. Обнаружены закономерности в соотношении времени тонической неподвижности и уровня стрессовой чувствительности кур. Впервые для оценки адаптационных реакций у кур предложен показатель - окислительная модификация белков. Изучено воздействие лития цитрата на формирование локального адаптационного синдрома и обосновано его применение при тестировании кур на стрессовую чувствительность. Разработан новый методологический подход к неинвазивной оценке стрессового состояния кур (патент РФ на изобретение №2473215). Результаты исследований использованы в монографии «Стрессы и стрессовая чувствительность кур в мясном птицеводстве. Диагностика и профилактика» / В.И. Фисинин, П.Ф. Сурай, А.И. Кузнецов, А.В. Мифтахутдинов, А.А. Терман (Троицк, 2013).

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют имеющиеся представления об адаптационных процессах у кур, связанных с индивидуальной чувствительностью к стрессам в условиях промышленного содержания. Сформулированы представления и дано определение стрессовой чувствительности и устойчивости сельскохозяйственных птиц. Разработанный метод определения стрессовой чувствительности кур рекомендуется использовать в племенных репродукторах и селекционно-племенных центрах. Разработанный метод оценки стрессового состояния кур предлагается использовать при оценке целесообразности применения схем антистрессовой терапии, для определения оптимальной плотности комплектования птицей производственных площадей, для анализа степени воздействия на организм кур производственных факторов и ветеринарных обработок. Для моделирования стресса у кур предлагается использование внутрикожного введения 0,1 мл 70 % скипидара в область бородки. При изучении индивидуальных адаптационных особенностей птиц предлагается использование трех хронологических периодов после действия дозированного раздражителя. При изучении оксидативного стресса у кур рекомендуется определять дополнительно показатель окислительной модификации белков в период 30-90 минут после воздействия фактора вызывающего серию адаптационных реакций организма.

На основании результатов исследования составлены методические рекомендации, предназначенные для практикующих ветеринарных врачей, зоотехников, сотрудников научно-исследовательских и учебных институтов ветеринарного и биологического профиля «Определение стрессовой чувствительности кур мясного направления продуктивности» и «Определение стрессового состояния у кур мясного направления продуктивности» (утверждены главным управлением ветеринарии и отделом животноводства Министерства сельского хозяйства Челябинской области - 2011 г.).

Методология и методы исследования. Предметом исследования служили адаптационные реакции организма кур с разной стрессовой чувствительностью. Объектом исследования служили куры родительского стада и цыплята мясного направления продуктивности кросса Hubbard F15.

В работе использованы различные методы исследования: изучение экстерьера, продуктивных и воспроизводительных качеств кур, оценка продолжительности тонической неподвижности родительских особей, иммуноферментные исследования плазмы крови на содержание катехоламинов и глюкокортикоидных гормонов, иммуноферментные исследования уровня кортикостерона в экстрактах помета кур, изучение лейкограмм, биохимические исследования плазмы крови включали изучение показателей липидного обмена, перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма, окислительной модификации белков. Для выделения специфических маркерных признаков устойчивости к стрессам использованы методы математического моделирования.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Моделирование локального адаптационного синдрома путем внутрикожного инъецирования 70 % раствора скипидара позволяет с высокой точностью проводить разделение кур и цыплят по степени чувствительности к стрессам.

2. Адаптационные процессы у стресс-чувствительных кур по сравнению со стресс-устойчивыми, характеризуются большим уровнем реактивности в ответ на действие раздражителя.

3. Хозяйственно-полезные признаки кур родительского стада в условиях напольной технологии содержания взаимосвязаны со стрессовой чувствительностью.

4. Применение лития цитрата при тестировании кур на стрессовую чувствительность позволяет предотвратить развитие стрессовой реакции и не оказывает влияния на формирование воспалительной реакции в месте введения раствора скипидара.

5. Кортикостерон в концентрации более 50 нмоль/л в экстрактированных пробах помета служит индикатором стрессового состояния кур мясного направления продуктивности.

Апробация результатов исследований. Основные материалы экспериментальных исследований доложены, обсуждены и одобрены на: Междунар. научно-практ. конф. «Современные проблемы, перспективы и инновационные тенденции развития аграрной науки», посвященной 85-летию со дня рождения чл.-корр. РАСХН, профессора М.М. Джамбулатова (Махачкала, 2010); Междунар. научно-практ. конф. «Современные проблемы и инновационные тенденции развития аграрной науки» (Якутск, 2010); Междунар. научно-практ. конф. «Научные исследования - основа модернизации сельскохозяйственного производства» (Тюмень, 2011); Научно-практ. конф. второй специализированной агропромышленной выставки «САРАТОВ-АГРО - 2011» (Саратов, 2011); Междунар. научно-практ. конф. «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2011); III Всероссийской научно-практ. конф. молодых ученых «Развитие научной, творческой и инновационной деятельности молодежи» (Курган, 2011); Междунар. научно-практ. конф., посвященной 90-летию со дня рождения М.И. Рабиновича, «Научное обеспечение инновационного развития в ветеринарной медицине» (Троицк, 2012); Междунар. научно-практ. конф. аспирантов и молодых ученых «Развитие АПК в свете инновационных идей молодых ученых» (СПБ, 2012); Междунар. научно-практ. конф. «Комплексное развитие сельских территорий и инновационные технологии в агропромышленном комплексе», посвященной 20-летию образования ИЗОП НГАУ, (Новосибирск, 2012); Междунар. научно-практ. конф. «Экологические проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском хозяйстве» (Екатеринбург, 2012); VII Междунар. научно-практ. конф. «Аграрная наука - сельскому хозяйству» (Барнаул, 2012); Всероссийской молодежной научной школе в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (Уфа, 2012); Первой междунар. научно-практ. конф. «Проблемы ветеринарной медицины зооэкологии Российского и Азиатско-Тихоакеанского регионов» (Благовещенск, 2012); VIII Междунар. научно-практ. конф. молодых ученых «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки», посвященной 75-летию профессора А.Т. Фарниева, (Владикавказ, 2012); Междунар. научно-практ. конф. «Инновационные технологии в ветеринарии, биологии и экологии», (Троицк, 2013); III Междунар. научно-практ. конф., посвященной 70-летию Алтайского ГАУ (Барнаул, 2013); Междунар. научно-практ. конф. молодых ученых «Молодежь и инновации - 2013» (Горки, Республика Беларусь, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 43 научные работы, в т.ч. 16 в изданиях рекомендованных ВАК РФ, 1 монография. Получено 2 патента РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав, содержащих обзор литературы, методики исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, а также выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, включающего 476 источников литературы, в том числе 294 иностранных, приложений.

Диссертация изложена на 344 страницах, иллюстрирована 45 таблицами и 41 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена в 2007-2013 годах, на кафедре физиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» - «Разработка и внедрение здоровьесберегающих технологий в животноводстве и птицеводстве» номер №0120.0801292. Эксперименты проводили в условиях Аргаяшской птицефабрики ЗАО «Уралбройлер» и вивария ФГБОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины», на курах кросса Hubbard F15 и петухах M99. Исследования проведены в условиях напольной системы содержания родительского стада и клеточной технологии содержания цыплят-бройлеров. Всего в экспериментах использовано 5660 кур родительского стада и 428 цыплят-бройлеров.

В первой серии экспериментальной работы было проведено изучение метода оценки стрессовой чувствительности цыплят и кур мясного направления продуктивности. Исследования включали изучение раздражителя, места его инъецирования, выбор оптимальной концентрации и дозы скипидара, оценку методики определения стрессовой чувствительности на цыплятах и гистологическое исследование тканей в месте введения раздражающих веществ. Объектом исследования служили 460 кур родительского стада, в возрасте от 32 до 54 недель и 100 цыплят-бройлеров, в возрасте 38 суток.

Вторая серия экспериментов включала комплексное изучение адаптационных реакций организма, оценку времени тонической неподвижности и состояния оперения у кур и цыплят, изучение хозяйственно-биологических признаков и биохимических особенностей адаптации кур с разной стрессовой чувствительностью. В экспериментах использовали 1600 кур родительского стада возрастом от 48 до 56 недель.

В качестве раздражителя для изучения адаптационных реакций организма использовали внутрикожное введение 0,1 мл 70 % раствора скипидара в область бородки, которое согласно результатам исследований вызывает у кур активацию стресс-реализующих механизмов и одновременно является основным методическим приемом при диагностике стрессовой чувствительности. Исследования проводили в разных функциональных статусах организма - до проведения скипидарного теста, через 30 минут и сутки после действия раздражителя, что отражает соответствующие физиологические состояния: относительного покоя; активации краткосрочных адаптационных процессов (Moneva P. at al., 2009) и период развития компенсаторных механизмов долговременной адаптации. О степени активации стресс-реализующих механизмов судили по концентрации адреналина и кортикостерона в плазме крови, путем изучения лейкограмм, исследованием процессов активации ПОЛ и АО системы защиты организма кур.

Изучение хозяйственно-биологических признаков кур проводили в три этапа. На первом этапе, в возрасте 48 недель проводили взвешивание, промеры и вычисление индексов телосложения опытных птиц. На втором и третьем этапах работы с целью изучения хозяйственно-биологических качеств при раздельном содержании кур с неодинаковой чувствительностью к стрессам проводили аналогичные исследования через 28 и 56 суток после формирования двух групп, состоящих из стресс-чувствительных и стресс-устойчивых кур. В процессе наблюдения осуществляли мониторинг продуктивности, учитывали следующие основные показатели: количество снесенных яиц, количество яиц с деформацией, средний вес яйца. Инкубационные показатели яиц изучали путем закладки в инкубатор 495 яиц от каждой группы каждые 7 суток.

Исследование адреналина и кортикостерона в плазме крови кур проводили с помощью ИФА (иммуноферментного анализа), используя стандартные наборы «DRG Corticosterone ELISA KIT» и «DRG Adrenaline ELISA KIT». Оценку времени тонической неподвижности проводили по методике описанной J. Maser, G. Gallup (1974) при 15 секундной фиксации птиц. Оценку состояния оперения проводили согласно бальному методу R. Tauson et al. (2004). Для оценки состояния перекисного окисления липидов организма проводили оценку первичных, вторичных (промежуточных) и конечных продуктов перекисного окисления в плазме крови с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта по И.А. Волчегорскому с соавт., 1989. Показатели ПОЛ выражали в виде единиц индексов окисления, которые отражают относительный уровень первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов соответственно: Е232/Е220 - относительное содержание диеновых конъюгатов, Е278/220 - уровень кетодиенов и сопряженных триенов, Е 400/220 -- основания Шиффа. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности супероксиддисмутазы по методу С. Чевари с соавт. (1985), каталазы по методу М.А. Королюк с соавт. (1988). Определение церулоплазмина в плазме крови проводили по модифицированному методу Ревина (Бестужева С. В., Колб В. Г., 1976). Окислительную модификацию белков определяли по методу Е.Е. Дубининой с соавт. (1995).

Целью третьей серии экспериментов было изучение целесообразности использования лития цитрата в качестве антистрессового фармакологического средства для купирования признаков общего адаптационного синдрома, формирующегося при тестировании кур на стрессовую чувствительность. Для этого был поставлен опыт на цыплятах возрастом 28 суток, которых разделили на 2 группы. Лития цитрат назначали согласно рекомендациям, разработанным С.Н. Преображенским (2006); Е.Ю. Пеньшиной (2007). Первой группе цыплят выпаивали раствор лития цитрата в дозе 35 мг/кг массы тела за двое суток до проведения скипидарного теста в день тестирования и в период оценки результатов реакции. Исследование по указанной схеме проводили трижды, повторное тестирование приводили на следующий день после оценки результатов предыдущего тестирования. Вторая группа служила контролем, препарат не использовали. Для изучения влияния терапевтических доз лития цитрата на эффективность скипидарной пробы при тестировании кур родительского стада был проведен опыт на курах в возрасте 48 недель, из числа которых были сформированы две группы. Каждая группа состояла из 100 куриц. Постановка эксперимента проводилась по аналогии с предыдущим и включала двукратные исследования птиц. Для оценки основных показателей продуктивности и воспроизводительных качеств кур родительского стада после проведения скипидарной пробы на фоне применения лития цитрата в условиях напольной технологии содержания кур были сформированы 4 группы по 330 голов в каждой возрастом 48 недель, всего в каждой группе по 300 куриц и 30 петухов. Первой и второй группе кур за 2 суток до проведения скипидарной пробы, в день пробы и в течение 2 суток после проведения пробы выпаивали водный раствор лития цитрата в дозе 35 мг на 1 кг массы тела, куры третьей и четвертой группы служили контролем, им препарат не применяли. Учитывая низкую кумулятивную способность лития цитрата, по данным И.А. Евтинова (2006) коэффициент кумуляции для цыплят равен 5 и анализируя многочисленные данные о непродолжительном периоде действия солей лития при использовании в течение кратковременного периода, время наблюдение за подопытной птицей составляло 14 суток, период был разделен на 2 равных по продолжительности условных этапа. Учитывая относительно непродолжительное воздействие лития цитрата при кратковременном применении, деление на этапы позволит на первой неделе проследить воздействие лития после активации стресс-реализующих механизмов организма кур и на второй неделе оценить показатели в состоянии относительного покоя.

В четвертой серии экспериментов для анализа влияния стрессовой чувствительности и пола на реализацию основных производственных показателей была проведена оценка стрессовой чувствительности 2000 голов птиц родительского стада в возрасте 39 недель. Через 24 часа после воздействия, во время читки реакции, кур и петухов делили на 4 группы по 50 голов в каждой - 1 группа сформирована из стресс-чувствительных птиц, 2 группа из стресс-устойчивых, 3 группа из стресс-чувствительных кур в сочетании со стресс-устойчивыми петухами, 4 группа из стресс-устойчивых кур в сочетании со стресс-чувствительными петухами, птиц с сомнительным результатом реакции в опытные группы не включали. Наблюдение за курами осуществляли в течение 7 недель, по аналогии с предыдущими исследованиями изучали продуктивные и воспроизводительные качества, в состоянии относительного покоя и при действии дозированного раздражителя в виде внутрикожного введения раствора скипидара изучали показатели липидного обмена, суточную динамику ОМБ (окислительной модификации белков) и показатели ПОЛ (перекисного окисления липидов) и АО (антиоксидантной системы защиты организма).

Исследования в рамках разработки способа определения стрессового состояния кур (5 серия экспериментальной работы) проводили в два этапа. На первом этапе проводили исследования на курах возрастом 48 недель, разделив их на 3 группы: куры первой группы были интактны, у кур второй и третьей групп вызывали активацию неспецифических адаптационных реакций путем внутрикожного введения в бородку 70 % раствора скипидара. Отбор проб помета осуществляли через 1 час, 3 часа, 8 часов и 24 часа после воздействия, что соответствует 9 часам, 12 часам, 17 часам и 9 часам дня. Взятие проб осуществляли с пола, пробы с насестов не отбирали, вследствие значительных колебаний уровня кортикостерона перед снесением яйца. Экстракцию кортикостерона проводили согласно методикам, описанным Е.Ю. Ткачевой, О.Б. Лифановой (2005), К.А. Роговиным с соавт. (2006), K.Wasser et al. (2000), F. Schwarzenberger (2007), определение концентрации кортикостерона проводили с помощью ИФА, используя стандартные наборы «DRG Corticosterone ELISA KIT». На втором этапе для оценки эффективности метода на птицах, находящихся "на пике" продуктивности, были использованы куры возрастом 33 недели. Для проведения исследований кур разделили на 2 группы по 100 голов в каждой. Куры первой группы были интактны, у кур второй группы вызывали стресс с помощью внутрикожного введения в бородку 70 % раствора скипидара. Отбор проб помета осуществляли через 1 и 3 часа после воздействия, что соответствует 9 и 12 часам. От каждой группы отбирали по 5 проб. Пробы высушивали сразу же после отбора и исследовали вышеописанным методом.

Статистический анализ экспериментальных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.1. Данные в работе представлены в виде медиан и квартилей, отмечаемых в скобках, отдельные результаты исследований, имеющие нормальное распределение представлены средней с указанием стандартной ошибки. Статистическую достоверность в работе рассчитывали при использовании средних значений и нормального распределения данных с помощью t-критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа. В случае представления данных в виде медиан использовали непараметрические критерии - для анализа статистической разницы между номинальными межгрупповыми признаками использовали U-Критерий Манна-Уитни, для анализа показателей, полученных от одной и той же группы критерий Вилкоксона, для анализа различий между несколькими группами критерий Краскела-Уоллиса. Уровень значимости был принят равным 0,05; для преодоления проблемы множественных сравнений, в случае многократного сравнения данных, полученных от одних и тех же групп, уровень значимости равнялся 0,01.

Для решения задачи по выбору показателей являющихся специфическими маркерными признаками стрессовой чувствительности или устойчивости кур, в рамках шестой серии работы разработана математическая модель, позволяющая прогнозировать процесс адаптации с использованием метода коррелятивного и дискриминантного анализа на основе объединенных в единый спектр показателей физиологических и биохимических исследований. Оценка дискриминации показателей, использованных в работе, разделена на пять групп в зависимости от однородности условий проведения экспериментальной работы и возможности построения математической модели.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для разработки способа, позволяющего оценивать стрессовую чувствительность у кур мясного направления продуктивности, были проведены исследования на кроссе Hubbard F15. За основу брали методологический принцип, основанный на моделировании локального адаптационного синдрома, описанный в оригинальной методике А.И. Кузнецова, Ф.А. Сунагатуллина (1991). В качестве раздражающего средства использовали скипидар и сок каланхоэ (Т.Г. Кичеева, 2001). Введение раздражающих веществ осуществляли в производные кожи - гребешок и бородку, а так же в область с наименьшим оперением в районе груди и область крестца. Степень реакции тканей на введение раздражающих веществ оценивали по признакам, развивающейся воспалительной реакции в виде утолщения, покраснения, болезненности и повышения температуры участка кожи в месте введения раздражающих веществ. Оценивали реакцию каждые 3 часа после инъекции в крестах, соответствующих степени выраженности воспалительной реакции: 0 - полное отсутствие реакции; + - небольшое утолщение кожи на 0,1-0,2 см, без выраженного покраснения, болезненности и повышения местной температуры; ++ - утолщение бородки на 0,3-0,4 см, наличие красноты, отсутствие выраженной болезненности и повышения местной температуры; +++ - реакция сильно выражена, утолщение на 0,3-0,4 см, протекает с выраженной болезненностью, краснотой и повышением температуры на месте инъекции.

В результате наблюдений инъецирование тестируемого препарата в бородку оказалось наиболее информативным и безопасным, к тому же бородка является парным производным кожи, что дает возможность использовать интактную бородку в качестве контроля.

При оценке степени воздействия скипидара в разных концентрациях можно отметить, что внутрикожное введение скипидара в высоких концентрациях (90-100 %) вызывает ярко выраженную реакцию как правило, с последующим некрозом бородки. Большая раздражающая сила скипидара, ограничивает возможность его использования в качестве тест-препарата. Для смягчения его раздражающих свойств скипидар использовали в виде раствора с вазелиновым маслом. Раствор скипидара в концентрациях 30-60 % вызывает воспалительную реакцию, но её характер в большинстве случаев слабо выражен и не может быть достоверно оценен. При этом признаки воспаления развиваются в течение 3 часов в виде незначительно покраснения бородки и через 6-9 часов они полностью исчезают. В концентрациях 10-20 % препарат не оказывает выраженного воздействия на ткани бородки и не целесообразен для использования.

В качестве раздражителя для дальнейшего изучения был выбран 60, 70 и 80 % раствор скипидара и сок каланхоэ, используемый в методике разработанной Т.Г. Кичеевой (2001). Исследования были проведены двукратно на одном и том же поголовье с интервалом в 14 суток.

Согласно полученным результатам наиболее высокой точностью обладает тестирование с помощью 70 и 60 % раствора скипидара. При этом отклонения по выявлению положительно реагирующих особей составляют 1 и 3 головы соответственно, использование 80 % концентрации скипидара не может быть объективным тестом, так как отклонение составляет 14 голов (3,5 %). При использовании сока каланхоэ наблюдается наивысшее отклонение, которое составляет 27 голов (6,75 %), характер реакции слабо-выражен, что осложняет тестирование и замедляет скорость отбора.

Использование 60-70 % концентрации скипидара требует уточнения дозы и времени читки реакции. В этих целях проведены испытания четырех доз тест-препарата 0,05, 0,10, 0,15 и 0,20 мл. В опыте использовали 200 кур, с известной стрессовой чувствительностью в возрасте 32 недели. Для оценки оптимального времени учета реакции проводили оценку основных признаков реакции через каждые 3 часа в течение 24 часов, каждые 6 часов в период 24-48 часов после реакции и каждые 12 часов на протяжении 7 суток с момента введения препарата.

Введение раствора скипидара в бородку в дозе 0,05 мл характеризовалось небольшим утолщением бородки в течение 3 часов, без выраженного покраснения, болезненности и повышения температуры, к 6 часам после пробы признаки реакции отсутствовали у кур, как с положительным, так и отрицательным типом реакции. Отсутствие реакции связано с тем, что доза 0,05 мл не обеспечивает проникновение раздражающего вещества в бородку, вследствие невозможности формирования пробивающей струи создаваемой безигольным инъектором. Введение раствора скипидара в дозе 0,10 и 0,15 мл характеризуется развитием сходных признаков в одинаковые промежутки времени. В период 3-6 часов после введения препарата на месте инъекции происходило постепенное развитие признаков воспаления, которое к 12 часам у всех кур характеризовалось утолщением бородки до 0,3-0,4 см, наличием красноты, отсутствием выраженной болезненности и повышением температуры бородки. Через 15 часов после пробы у отрицательно реагирующих кур утолщение бородки становилось ниже и через 21 час после пробы реакция на введения раздражителя отсутствовала, в отличие от положительно реагирующих кур, у которых признаки воспаления становились более выражены. Пик развития реакции наблюдался в период с 21 до 36 часов после введения скипидара и к 42 часам признаки воспаления становятся менее заметными, исчезая у большинства кур к 4 суткам после постановки пробы, у отдельных особей (16-20 %) признаки воспаления исчезали только на 6-7 сутки. При введении раствора скипидара в дозе 0,20 мл у 25-30 % кур происходит значительное повреждение тканей бородки, признаки воспаления постепенно достигают пика к 18 часам после пробы и ярко выражены у кур как с отрицательным типом реакции, так и с положительной реакцией. Через 30 часов с момента введения препарата происходит постепенное снижение признаков воспаления у кур с отрицательным типом реакции, а к 60 часам признаки реакции у них исчезают совсем. У кур с положительным типом реакции признаки воспаления исчезают только на 6-7 сутки после введения препарата. К 30 часам после проведения пробы происходит подсыхание поврежденных тканей и образование струпа.

В результате экспериментальной работы по разработке способа, позволяющего оценивать стрессовую чувствительность у кур, определено, что наиболее эффективным раздражителем является 60-70 % раствор скипидара в дозе 0,10-0,15 мл, вводимый в бородку с помощью безигольного инъектора. Наиболее оптимальным временем для учета реакции является период через 21-36 часов после введения скипидара курам. Реакция на стрессовую чувствительность считается положительной при наличии всех признаков воспаления: утолщение бородки от 0,4 см и более или в два и более раза по сравнению с интактной, наличие повышенной местной температуры на 2⁰С и более по сравнению с интактной, покраснение и болезненность при пальпации. В случае отсутствия этих признаков, реакция считается отрицательной, а куры относятся к стресс-устойчивым. При утолщении бородки менее 0,4 см, отсутствии красноты, болезненности или повышения локальной температуры менее 2⁰ С реакция считается сомнительной. Трехкратные исследования стабильности проявления реакции на цыплятах и двукратные испытания на курах родительского стада показали, что обнаруженные отклонения укладываются в величину статистической ошибки, что свидетельствует о высокой прогностической точности предлагаемого метода для оценки уровня стрессовой чувствительности цыплят и взрослых кур.

Гистологические исследования бородок протестированных стресс-устойчивых и стресс-чувствительных кур, показали что, несмотря на схожий характер реагирования тканей на действие скипидара, степень выраженности воспалительной реакции у кур с разной стрессовой чувствительностью отличается. Известно, что воспалительная реакция протекает под контролем нервной системы и включает в себя элементы нервной и гуморальной регуляции, иммунологической и ноцицептивной реактивности, что указывает на целесообразность ее использования в качестве маркера повышенной чувствительности организма птиц к внешним воздействиям.

Исследования, представленные в работе, включают тестирования на стрессовую чувствительность 5660 кур родительского стада и 428 цыплят-бройлеров. Из общего числа протестированных цыплят стресс-чувствительных было 21,5 %, стресс-устойчивых 64,8 % и стресс-сомнительных 13,7 %. Из общего числа кур родительского стада стресс-чувствительных было 22,8 %, стресс-устойчивых 64,5 % и стресс-сомнительных 12,7 %.

Изучение неспецифических адаптационных реакций у кур с разной стрессовой чувствительностью, требует использования метода, позволяющего моделировать состояние стресса у птиц. В качестве такого метода применено внутрикожное введение 70 % раствора скипидара в дозе 0,1 мл в бородку, которое согласно результатам представленных ниже исследований позволяет моделировать стрессовое состояние у кур в стадии тревоги (по Г.Селье) или в стадии ориентировки стресса (по Л.Х. Гаркави).

В состоянии относительного покоя количество адреналина и кортикостерона в плазме кур с разной стрессовой чувствительностью не имеет статистически достоверных отличий. Через 30 минут после внутрикожного введения 70 % раствора скипидара происходит резкое повышение уровня концентрации указанных гормонов. У стресс-чувствительных кур уровень содержания адреналина в плазме крови возрастает в 14,5 раз с 9,35 (8,71-10,00) нг/мл в состоянии относительного покоя до 135,67 (83,75-238,06) нг/мл через 30 минут после проведения скипидарной пробы, у стресс-устойчивых в 4,2 раз соответственно с 13,16 (7,13-14,72) нг/мл до 57,60 (47,86-76,50) нг/мл. Аналогичные изменения наблюдаются при анализе плазменных концентраций кортикостерона. Так, у стресс-устойчивых кур концентрация кортикостерона возрастает с 32,01(31,08-38,67) нмоль/л в состоянии покоя, до 64,52 (55,28-93,85) нмоль/л через 30 минут после проведения скипидарной пробы и у стресс-чувствительных соответственно с 35,49 (27,56-152,59) нмоль/л, до 131,96 (99,27-177,05) нмоль/л т.е. в 2 и 3,7 раза. Статистическая разница показателей концентрации адреналина в плазме крови кур с разной стрессовой чувствительностью, полученной через 30 минут после проведения скипидарного теста статистически достоверна. Плазменная концентрация адреналина выше у стресс-чувствительных кур в 2,4 раз по сравнению со стресс-устойчивыми курами (Р=0,002), концентрация кортикостерона так же выше у стресс-чувствительных кур в 2 раза (Р=0,019) по сравнению с показателем стресс-устойчивых кур.

Неспецифические адаптационные реакции организма, в том числе и стресс, сопровождаются характерными изменениями в лейкограмме. Анализ показал, что в состоянии относительного покоя лейкоцитарная формула у кур с разной стрессовой чувствительностью не имеет отличий. Через 30 минут после проведения скипидарного теста в лейкограмме произошли выраженные изменения, характеризующиеся у стресс-чувствительных кур отсутствием базофилов, меньшим содержанием лимфоцитов на 15,3 %, увеличением гетерофилов на 34,2 % по сравнению с стресс-устойчивыми курами. Показатель отношения Г/Л выше у стресс-чувствительных кур и составляет 0,6, у стресс-устойчивых равен 0,36, разница средних значений этого показателя составляет 49,2 %. Согласно классификации W. Gross, H. Siegel (1983), данные значения соответствуют среднему уровню стрессированности кур. Согласно классификации неспецифических адаптационных реакций организма (Л.Х. Гаркави) обнаруженные изменения соотношения лейкоцитов после внутрикожного введения 70 % раствора скипидара соответствуют стадии ориентировки стресса. Лейкоцитарная реакция организма кур проявляется в виде снижения содержания лимфоцитов и увеличения количества гетерофилов. Наиболее яркие изменения установлены у стресс-чувствительных кур по сравнению со стресс-устойчивыми, что указывает на более интенсивное развитие адаптационных реакций на действие раздражителя одинаковой силы. Отличия неспецифических адаптационных реакций между стресс-устойивыми и стресс-чувствительными курам вписывается в понятие теории Л.Х. Гаркави с соавт. относительно разного типа реактивности, так стресс-устойчивым курам присуща более низкая реактивность, по сравнению со стресс-чувствительными, для которых характерно течение адаптационных реакций на более высоком уровне реактивности или реакции более низких «этажей».

Одним из компонентов стресса у кур является страх. Страх оказывает влияние, а иногда определяет ту или иную стратегию поведения. Физиологическим индикатором страха является продолжительность тонической неподвижности (Jones B., 2006). Стресс-чувствительные куры входят в состояние тонической неподвижности в среднем с 1,1 раза, для стресс-устойчивых кур требовалось в среднем 1,45 попыток, что может свидетельствовать о более сильном типе высшей нервной деятельности у стресс-устойчивых кур. Средняя продолжительность тонической неподвижности стресс-чувствительных кур составила 139,7 (109,8-169,5) с., против 50,4 (36,8-64,0) с. в группе стресс-устойчивых кур, что в 2,8 раз выше, статистическая разница высокодостоверна (Р<0,001). Увеличение продолжительности тонической неподвижности подтверждает большую напряженность функциональных систем, реализующих адаптационные процессы у стресс-чувствительных кур, предположительно выражающиеся изменением времени охранительного торможения и увеличением времени состояния ориентировки, предшествующей развитию стрессовой реакции. Коэффициент корреляции между качественным признаком - стрессовая чувствительность и количественным показателем продолжительность тонической неподвижности составляет 0,71 (Р<0,05), что указывает на средний уровень статистической взаимосвязи показателя тонической неподвижности, использующегося для изучения взаимосвязи со стрессовой чувствительностью кур. Доказанная в эксперименте прямая зависимость стрессовой чувствительности птиц с реакцией страха, даёт возможность отбирать для родительского стада стресс-устойчивое поголовье, отличающееся меньшей склонностью к "девиантному" поведению, что способствует формированию правильной в производственном отношении иерархии соподчинения в стаде.

Уровень стрессовой чувствительности обуславливает отличия в массе тела у стресс-устойчивых и стресс-чувствительных кур. В начале эксперимента масса тела стресс чувствительных птиц в возрасте 48 недель была меньше на 10,4 % массы кур устойчивых к стрессу. Различия массы тела кур с разной стресс чувствительностью могут быть обусловлены с одной стороны особенностями обмена веществ, с другой стороны их социальным поведением. Особенности поведения прямым образом влияют на живую массу птиц, особи с разной чувствительностью к стрессам будут занимать разный уровень в иерархической лестнице, что будет обуславливать их преимущества или недостатки при доступе к корму и воде. Подтверждение этих данных можно найти при анализе показателей массы тела в процессе эксперимента. Так, после разделения кур в разные группы по степени их чувствительности масса тела и основные промеры тела начали постепенно выравниваться, разница в массе тела сократилось до 8,7 %, что может являться следствием снижения влияния социального фактора и на этом фоне реализации генетически обусловленного потенциала роста при высоком уровне продуктивности. Высокое генетическое сродство между курами с разной степенью стресс чувствительности подтверждается так же равенством индексов телосложения, несмотря на различия в скорости роста. К концу эксперимента куры выравнивались по массе за счет более высокого прироста массы тела стресс-чувствительных кур.

Яичная продуктивность у стресс-устойчивых кур в течение 28 суток экспериментальных исследований оказалась выше продуктивности стресс-чувствительных птиц в абсолютном выражении на 13,3 %. Через 28 суток раздельного содержания кур с разной стрессовой чувствительностью показатели выравниваются (табл. 1).

Таблица 1

Продуктивность и воспроизводительные качества кур

Примечание: СТЧ - стресс-чувствительные, СТУ - стресс-устойчивые

За весь период эксперимента средний вес яйца, полученного от кур с разной стрессовой чувствительностью, достоверно не отличался. Показатели, характеризующие воспроизводительные качества кур родительского стада (табл. 1), такие как оплодотворенность яиц, выводимость яиц и вывод цыплят из яиц на первом этапе эксперимента были существенно выше у стресс-устойчивых птиц, разница величины показателей статистически достоверна и составляла в абсолютном выражении 10,3; 3,4 и 11,7 %. На втором этапе эксперимента показатель выводимости яиц у кур с разной стрессовой чувствительностью становится равным, однако оплодотворенность яиц и вывод цыплят из яиц имеют статистические различия и были выше у стресс-устойчивых кур на 12,1 и 11,7 % соответственно. Анализируя величины показателей оплодотворяемости яиц и вывода цыплят из яиц следует отметить, что в первой и второй сериях опытов они коррелируют с уровнем стрессовой чувствительности r?0,75 (Р<0,01).

При анализе влияния пола на взаимосвязь основных продуктивных характеристик кур и уровня их стрессовой чувствительности обнаружены следующие закономерности (табл. 2).

Таблица 2

Продуктивные и воспроизводительные качества кур в связи с уровнем стрессовой чувствительности куриц и петухов

Примечание: СТЧ - стресс-чувствительные, СТУ - стресс-устойчивые; П-петухи, К - курицы

Наивысшая яичная продуктивность - 64 % за период наблюдений отмечается в группе, состоящей из стресс-устойчивых кур в сочетании со стресс-устойчивыми петухами, наименьшая продуктивность - 52 % отмечается в группе, состоящей из стресс-устойчивых кур в сочетании со стресс-чувствительными петухами. Межгрупповые различия медиан составляют 18,8 %. В динамике, так же прослеживается более низкие значения яйценоскости в группе, состоящей из стресс-чувствительных петухов и стресс-устойчивых кур на всем периоде наблюдений. Обнаруженные межгрупповые отличия указывают на высокую зависимость яйценоскости кур родительского стада от стрессовой чувствительности петухов при формировании групп со стресс-устойчивыми курами. Более высокая оплодотворенность яиц отмечается в группе, сформированной из стресс-устойчивых куриц и петухов. Наименьший показатель в группе, состоящей из стресс-устойчивых кур в сочетании со стресс-чувствительными петухами. Межгрупповые отличия составляют для показателя оплодотворенности яиц 35,2 %, для вывода цыплят из яиц 31,5 %.

Обнаруженные закономерности свидетельствует о влиянии уровня стрессовой чувствительности при реализации продуктивного потенциала куриц и петухов в условиях напольного промышленного содержания. При сравнении показателей между группой, сформированной из стресс-устойчивых кур и группой состоящей из стресс-чувствительных куриц в сочетании со стресс-устойчивыми петухами, отмечается статистическое равенство показателей оплодотворенности яиц и вывода цыплят из яиц, что указывает на определяющее влияние стрессовой чувствительности петухов при формировании воспроизводительных качеств родительского стада кур. Согласно исследованиям А.И. Кузнецова (1991) уровень стрессовой чувствительности связан с типологией высшей нервной деятельности, что подтверждаются исследованиями А.Б. Мулик (2002), который отмечает четкую избирательность при спаривании лабораторных животных с разными типами высшей нервной деятельности.

Учитывая отсутствие в доступной литературе методических подходов к оценке стратегии оборонительного и репродуктивного поведения у петухов в условиях промышленного содержания для оценки потенциальной склонности к агрессии и девиантному поведению петухов использовали продолжительность тонической неподвижности (рис. 1).

Рисунок 1 Продолжительность тонической неподвижности петухов с разной стрессовой чувствительностью, секунд

Согласно результатам исследований у стресс-чувствительных петухов показатель выше в 2,4 раза в 40 недельном возрасте, в 43 недельном возрасте выше в 1,9 раз и в 46 недельном возрасте выше в 2,1 раз, что согласуется с данным полученными в предыдущих экспериментах, где продолжительность тонической неподвижности у стресс-чувствительных куриц так же было выше в 2,8 раз. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что склонность к агрессивному поведению выше у стресс-чувствительных петухов. При формировании родительского стада в условиях технологии напольного промышленного содержания они могут быть инициаторами расклева и девиантного поведения.