Изучение фармакологической активности производных пирроло[1,2-а]бензимидазола, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРРОЛО[1, 2-а]БЕНЗИМИДАЗОЛА, ПРОЯВЛЯЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Ельцова Лариса Витальевна

Волгоград - 2010



Работа выполнена в НИИ фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент Косолапов Вадим Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Хоронько Владимир Владиленович;

доктор биологических наук Перфилова Валентина Николаевна

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Защита диссертации состоится апреля 2010 г. на заседании диссертационного совета Д 208.008.02 по защитам диссертаций при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава».

Автореферат разослан марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор А.Р. Бабаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Свободно-радикальное окисление является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [Владимиров, 2000; Клебанов, 2006; Меньщикова, 2006, 2008]. Неконтролируемая генерация активных форм кислорода, кислородных метаболитов и сбой в функционировании антиоксидантной системы вызывают окислительное повреждение биомолекул, что приводит к дисфункции клеток и тканей организма [Шанин, 2003; Halliwell, 2005]. Окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе многих патологических состояний: гипоксических и ишемических повреждениях органов [Лукьянова, 2000; Гусев, 2001; Мирзоян, 2003; Atahan, 2007]; интоксикациях химическими агентами [Сейдахметова, 2005] и заболеваниях печени [Warner 2004; Fukai, 2005]; сахарном диабете и его осложнениях [Балаболкин, 2005; Дедов, 2006]; при интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, старении [Гусев, 1997; Анисимов, 2007; Harman, 2006]. Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные стабилизировать структуру и функции клеточных мембран и поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Gutterjdge, 2000; Арзамасцева, 2006]. Антиоксидантные препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободно-радикальных патологий [Сторожок, 2002; Pryor, 2006].

Однако, несмотря на широкий спектр веществ с антиоксидантным и антирадикальным действием в эксперименте, эффективных лекарственных средств, внедренных в клиническую практику, - незначительное количество. Кроме того, существующие препараты имеют ряд недостатков, связанных с особенностями биологического эффекта и его величиной, либо с токсичностью [Шанин, 2003; Бурлакова, 2006]. Поэтому поиск новых высокоэффективных антиоксидантных средств остается актуальным. Перспективным является поиск и разработка новых высокоэффективных антиоксидантных средств в ряду производных бензимидазола [Панченко, 1990; Островский, 1995; Анисимова, 2002; Косолапов, 2007]. Молекулу бензимидазола можно отнести к так называемым «привилегированным химическим структурам» [DeSimone, 2004]. Конденсированные производные бензимидазола - пирроло[1,2-б]бензимидазолы - соединения со сложной р-электронноизбыточной системой, обладающие более высоким антиоксидантным потенциалом действия [Анисимова, 1996; Спасов, 2001]. Все вышеперечисленное делает актуальным поиск и изучение высокоактивных веществ с антиоксидантным и антирадикальным спектром действия среди производных ряда пирроло[1,2-б]бензимидазолов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 01200116045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 01200609434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета.

Цель исследования. Поиск и исследование механизмов действия на процессы пероксидации новых высокоэффективных антиоксидантных веществ среди производных пирроло[1,2-б]бензимидазола; выбор наиболее активных соединений и доклиническое изучение их специфической активности на экспериментальных моделях свободно-радикальных патологий.

Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от 31.10.2003 г.). пероксидация бензимидазол антиоксидантный производный

Задачи исследования

Изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства новых производных пирроло[1,2-б]бензимидазола и препаратов сравнения на моделях in vitro.

Исследовать показатели острой токсичности наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения специфической фармакологической активности.

Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств.

Изучить защитные свойства наиболее активных антиоксидантов и препаратов сравнения на различных моделях с активацией процессов пероксидации при гипоксических и ишемических повреждениях головного мозга.

Исследовать влияние соединений, проявляющих наибольшую антиоксидантную и антирадикальную активность, на показатели перекисного окисления, поведенческую активность и неврологический статус у крыс при двухсосудистой ишемии головного мозга.

Изучить действия веществ с высокими антиоксидантными и антирадикальными свойствами на процессы перекисного окисления липидов у крыс при тотальном ишемическом повреждении головного мозга с реперфузией.

Исследовать влияние веществ с наибольшими антиоксидантной и антирадикальной активностью на показатели процессов пероксидации, биохимические процессы, реологические параметры крови и основные функциональные характеристики печени у крыс с токсическим тетрахлорметановым гепатитом.

Научная новизна. Впервые были получены данные о влиянии 25 оригинальных производных пирроло[1,2-б]бензимидазола на свободно-радикальные процессы (СРП). Впервые была установлена взаимосвязь между структурой новых соединений и их антиоксидантной активностью (АОА). Были изучены механизмы действия наиболее активных веществ 8,9-дифенил-N1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазола, 8-метокси-9-фенил-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бенз-имидазола и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазола на различные звенья СРП in vitro и in vivo. Установлено, что антиоксидантная и антирадикальная активности (АРА) изученных соединений определяются физико-химическими свойствами их молекулы, показано, что АОА определяется стерическими параметрами молекулы, а АРА - также электронными и липофильными характеристиками молекулы. Получены данные о влиянии соединений пирроло[1,2-б]бензимидазола на процессы пероксидации при гипоксических состояниях, ишемических поражениях мозга, токсическом повреждении печени.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов ПОЛ, проявляющих антиоксидантные и антирадикальные свойства, среди производных пирроло[1,2-б]бензимидазола. На основании выявленной зависимости АОА и АРА соединений от их структуры была выведена математическая зависимость, описываемые двумя регрессионными уравнениями, с помощью которых можно прогнозировать с высокой степенью достоверности тот или иной тип активности у новых соединений. Отработана методология поиска и изучения новых АО веществ с использованием современных методов исследования, даны рекомендации по направленному синтезу гетероциклических соединений. Получены данные о наличии у соединения РУ-792 противогипоксических, противоишемических свойств, а также выявлена способность повышать детоксицирующую функцию печени, снижать образование продуктов перекисного окисления липидов крови и тканей печени на фоне тетрахлорметанового гепатита. Выявленные антиоксидантные и антирадикальные эффекты вещества РУ-792, превосходившего по активности препарат сравнения, определяют перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований соединения с целью создания на его основе нового антиоксидантного средства.

Реализация результатов исследования. Выявленные закономерности между химической структурой и способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов у замещенных производных пирроло[1,2-б]бензимидазола учитываются при синтезе новых веществ в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту

Пирроло[1,2-б]бензимидазолы - перспективный класс соединений для поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов.

Наиболее выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства выявлены для вещества под лабораторным шифром РУ-792, влияющего преимущественно на активность липопероксильного радикала и ABTS-радикала.

Соединение РУ-792 по эффективности при острой гипобарической гипоксии, двухсосудистой ишемии головного мозга, тотальной ишемии-реперфузии головного мозга, а также при остром поражении печени четыреххлористым углеродом превосходит препарат сравнения мексидол.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались: на IX - XIII Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2004 - 2008 гг.); 62 - 66-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2004 - 2009 гг.); Международной научно-практической конференции молодых ученых «Вченi майнбутнего» (Одесса, 2004); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ (из них две в журналах, рецензируемых ВАК).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ___ страницах машинописного текста, иллюстрирована 44 рисунками и 47 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2 - 4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего ___ отечественных и __ зарубежных источника, и приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Объектами исследования являлись соединения, синтезированные в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета Выражаем искреннюю благодарность к.х.н., ведущему научному сотруднику Вере Алексеевне Анисимовой за синтез и предоставление субстанции веществ.. В работе исследовались 34 соединения, под лабораторным шифром «РУ», из них 25 относятся к N1-замещенным пирроло[1,2-б]бензимидазолам (ПБ) и 9 - к N9-замещенным имидазо[1,2-б]бензимидазолам (ИМБИ). В качестве препаратов сравнения были выбраны: тролокс (Fluka, Швейцария), бутилированный гидрокситолуол (дибунол) (Merck, Германия), мексидол (НИИ фармакологии РАМН, Россия).

Исследования проводились на 152 половозрелых нелинейных белых крысах обоего пола, массой 250-400 г. и 87 белых неинбредных мышах обоего пола массой 18-32 г., содержавшихся в условиях вивария на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997).

Методы исследования. Методы изучения перекисного окисления липидов и механизмов антиоксидантного и антирадикального действия веществ. Скрининг антиоксидантных свойств новых веществ проводили на модели аскорбат-индуцируемого перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Ланкин, 1975]. Скорость перекисных процессов оценивали по накоплению продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Fluka, Швейцария). Антирадикальная активность изучалась по способности веществ инактивировать свободный стабильный радикал 2,2-дифенил-l-пикрил-гидразил (ДФПГ*) (Sigma, США) [Glavind, 1963]. Измерение хемилюминесценции проводилось на хемилюминомере «ХЛ-003» (Уфа, Россия). Фиксировался суммарный показатель светимости, который выражался в условных единицах. Для изучения АОА веществ использовали метод Fe2+-индуцированной хемилюминесценции желточных липопротеидов (ЖЛП) [Фархутдинов, 1995]. Для исследования АРА соединений применялся метод люминол-зависимой хемилюминесценции [Семешко, 2002], а также модель окисления 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS*) [Rice-Evans, 1994]. Диеновые конъюгаты (ДК) в тканях органов оценивали спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия) в тесте [Камышников, 2004]. Малоновый диальдегид (МДА) в крови и органах определяли в реакции с ТБК с использованием бутанольных экстрактов [Гаврилов, 1987; Андреева, 1988].

Определение активности антиоксидантных ферментов. Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по реакции окисления кверцетина (Sigma, США) [Костюк, 1990]. Глутатионпероксидазу (ГП) определяли по методу В.М. Моина (1986) с использованием дитионитробензойной кислоты (реактив Эллмана) (MP Biochemedicals, США).

Методы изучения гемореологических показателей крови. Измерение вязкости крови проводилось на анализаторе крови реологическом АКР-2 (МП «Комед» и НИИ физико-химической медицины, Россия). Вязкость крови изучалась при скоростях сдвига 300, 200, 100, 50, 10 (с-1), моделирующих различную интенсивность кровотока в сосудах [Добровольский, 1998]. Влияние веществ на агрегацию эритроцитов [Дегтярев, 2001] и агрегацию тромбоцитов [Born, 1962; Габбасова, 1989] исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации (модель 220 LA) (НПФ «Биола», Россия).

Острая гипобарическая гипоксия моделировалась в барокамере проточного типа. Животные помещались в условия, соответствующие подъему на «высоту» 11 тыс. м над уровнем моря. Оценивали время жизни «на высоте» до появления признаков терминальной стадии [Лукьянова, 1990]. Ишемию головного мозга моделировали [Мирзоян, 2000] лигированием общих сонных артерий (наркоз кетамин, 80 мг/кг, в/бр). На 1, 2 и 3-и сутки после окклюзии регистрировали выживаемость животных, изучали неврологический статус, локомоторную активность, характер поведения крыс в тесте «открытое поле». При оценке неврологического статуса у крыс оценивалось сохранение рефлексов [Буреш, 1991]. Показатели локомоторной активности регистрировали с помощью актометра («Ugo Basile», Италия). Через трое суток в крови и тканях мозга крыс определяли содержание МДА и ДК, активность ГП. Тотальную ишемию головного мозга с реперфузией создавали путем наложения окклюзоров на общие сонные артерии в течение 30 минут (наркоз хлоралгидрат, 400 мг/кг, в/бр) с последующей 30-минутной реперфузией путем снятия лигатур; операция проводилась под контролем артериального давления (80/60 мм. рт. ст.) [Мирзоян, 2006]. Через 0,5 и 24 часа регистрировали выживаемость животных, в крови и тканях мозга определяли концентрацию МДА, активность СОД и ГП. Острый токсический гепатит моделировали однократным введением 50% масляного раствора тетрахлорметана (ТХМ) (0,5 мл/кг, в/бр) [Хабриев, 2005]. Спустя 24 часа у животных исследовали детоксицирующую (тест «гексеналового сна») и поглотительно-выделительную функции печени по бромсульфалеиновой пробе [Хабриев, 2005]. Оценивали активность основных печеночных ферментов - аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), белково-образовательную функцию печени по содержанию общего белка сыворотки крови и липидный профиль сыворотки крови. Изучали уровень ПОЛ по концентрации МДА и состояние антиоксидантного статуса, определяя активность СОД и ГП; измеряли гемореологические показатели (вязкость крови и АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и алциан-индуцированную агрегацию эритроцитов).

Изучение зависимости антиоксидантной активности от физико-химических свойств веществ. Для расчета физико-химических свойств производных бензимидазола использовали квантово-химические методы Выражаем глубокую признательность докторанту кафедры фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета к. б. н. Павлу Михайловичу Васильеву за содействие при исполнении данной работы.. Рассчитывались липофильные [Vellarkad, 1989], стерические [Arup, 1987] и электронные [Кларк, 1990] показатели изучаемых соединений и с помощью программ Microsoft® Excell 2007 и Statistica 6.0 использовались для построения классической регрессионной модели [Голендер, 1978].

Острую токсичность соединений изучали на мышах при внутрибрюшинном введении. Показатель LD50 рассчитывали по методу Личфилда-Вилкоксона. Для расчета показателя условной широты терапевтического действия выводили условный терапевтический индекс (УТИ).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6,0 (StatSoft, США) и Excel 2007 (MS Office 2007, США) с применением парного критерия Стьюдента (t) и точного метода Фишера.

Результаты экспериментов и их обсуждение

В результате проведенного скрининга 34 соединений производных бензимидазола было установлено, что наибольшее количество веществ с высокой АОА (56%) обнаружено в ряду производных ПБ, тогда как в ряду производных ИМБИ активных веществ оказалось меньше - 22%. Также среди замещенных ПБ найдено 36% соединений с выраженными антирадикальными свойствами, тогда как среди ИМБИ таковых веществ было лишь 11%. Т.е. присутствие сопряженного пиррольного кольца в структуре молекулы вещества обуславливало наличие у последних более высоких как антиоксидантных (АО), так и антирадикальных (АР) свойств. Следует отметить, что наибольшие АО и АР эффекты проявили соединения, содержащие в структуре фенильные заместители. Возможно, это объясняется увеличением донорно-акцепторных свойств веществ и некоторой стабилизацией термодинамических и кинетических характеристик молекулы за счет введения замещенного фенильного фрагмента.

При изучении зависимости антиоксидантной и антирадикальной активностей от основных физико-химических свойств веществ было выведено два регрессионных уравнения: по антиоксидантной (1) и антирадикальной активности (2), с помощью которых можно прогнозировать тот или иной вид активности новых соединений в ряду пирроло[1,2-б]бензимидазолов.

Lg(1/IC50) = 4,925 + 7,766*10-4 MRR12 + 3,588*10-3 MRR3, (1)

0,0025 0,0368

R = 0,810, S = 0,0563, F(2,12) = 1,42, p = 0,00167,

ДArad(10-6) = - 2686,3 + 3,426 log2P0 + 1918,8 У/E/C+R1 - 22,83MRC - (2)

0,000015 0,00616 0,00224

- 12,23 log2PC - 11,46 log2PR2 + 0,2062 MRC2 - 12,91 log2PR3 -

0,000404 0,000745 0,003442 0,000899

- 276,1(У /E/C+R1)2 + 28,28 У/E/R3,

0,00145 0,0269

R = 0,866, S = 11,27, F(9,17) = 5,64, p = 0,00112,

где ИК50 - концентрация, в которой вещество ингибирует реакцию перекисного окисления липидов на 50%; ДArad(10-6) - процент ингибирования свободно-радикальной реакции веществом в концентрации 1 мкмоль/л; MRR12 - квадрат молекулярной рефракции радикала R1 у 1-го атома азота; MRR3 - молекулярная рефракция радикала R3 у 8-го атома углерода; log2P0 - показатель липофильности молекулы в виде основания; log2PC - показатель липофильности цикла молекулы; log2PR2 - квадрат показателя липофильности радикала R2;

log2PR3 - квадрат показателя липофильности радикала R3; У/E/C+R1 - сумма положительных зарядов цикла и радикала у первого или девятого атомов азота; (У /E/C+R1)2 - квадрат суммы положительных зарядов цикла и радикала у первого или девятого атомов азота; У/E/R3 - сумма положительных зарядов радикала R3; MRC - молекулярная рефракция цикла молекулы; MRC2 - квадрат молекулярной рефракции цикла молекулы; R - коэффициент множественной корреляции; S - стандартная ошибка; F - значимость уравнения по точному критерию Фишера; р - статистическая значимость данного уравнения по t-критерию Стьюдента; под каждой переменной указана статистическая значимость этого параметра.

Было обнаружено, что наиболее значимыми показателями для адекватного прогнозирования антиоксидантной активности являются стерические характеристики, а показатели липофильности и заряда на радикалах и молекуле в целом для прогнозирования данного вида активности будут второстепенны. При выведении зависимостей между антирадикальной активностью и физико-химическими свойствами было установлено, что следует учитывать влияние всех расчетных параметров - электронных, липофильных показателей и стерических характеристик молекулы вещества. С помощью полученных зависимостей, на основании структурной формулы, можно производить приблизительную расчетную оценку уровня как антирадикальной, так и антиоксидантной активностей новых, а также только планируемых к синтезу производных пирроло[1,2-б]бензимидазолов с целью оптимизации поиска высокоактивных веществ в этом ряду.

В результате проведенного скрининга, учитывая совокупность показателей АОА и АРА, а также острой токсичности и условного терапевтического индекса (УТИ), были отобраны для дальнейшего исследования три соединения, относящиеся к производным ПБ: РУ-756, РУ-757 и РУ-792 (таблица 1).

Таблица 1 - Показатели УТИ, LD50 и АО и АР активности наиболее эффективных соединений.

Шифр вещества	LD50, мг/кг	АОА, ИК50, мкмоль/л	УТИ по АОА	АРА, ИК50, мкмоль/л	УТИ по АРА
РУ-792	794	1,14	1198,4	2,17	153,3
РУ-757	775	1,12	1126,8	1,70	583,4
РУ-756	475	1,32	715,3	8,93	554,9
РУ-791	390	1,05	610,9	11,20	57,11
РУ-543	265	0,82	868,2	-*	-*
Дибунол	400	3,60	572,2	5,05	572,8
Мексидол	475	480,00	4,1	20,94	59,4
* - для соединения РУ-543 показатель УТИ не рассчитывался в связи с его низкой АРА.

Изучая возможные молекулярные механизмы действия отобранных веществ на свободно-радикальные процессы, было установлено, что вещества оказывают неодинаковую АОА и АРА на моделях с различным генезом свободно-радикальных реакций. Так, соединения, содержащие в структуре морфолиноэтильную группировку, были более активны в отношении гидроксильного радикала (РУ-757), влияя на люминол-зависимую хемилюминесценцию; или радикала ABTS* (РУ-792) - в методе окисления ABTS*, тогда как вещество, имеющее в структуре диэтиламиноэтильный заместитель (РУ-756), обладало наибольшей эффективностью в отношении липопероксильного радикала LOO*, подавляя хемилюминесценцию ЖЛП (рис. 1).

Рисунок 1 - Активности изучаемых веществ РУ-756 (А), РУ-757 (Б) и РУ-792 (В) (% ингибирования) на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств;

* - статистическая значимость относительно контроля, р?0,05

При изучении антигипоксических свойств исследуемых веществ на модели острой гипобарической гипоксии установлено, что соединение РУ-792 показало наиболее выраженный противогипоксический эффект, увеличивая продолжительность жизни мышей при гипобарии на 127% в изоантиоксидантной дозе 8,2 мг/кг, и повышая данный показатель в 1,3 1,4 и 1,9 раза при двух-, пяти- и десятикратном увеличении дозы соответственно. Препарат сравнения мексидол оказался не столь эффективным - 71%, как и другие изучаемые соединения (рис. 2).



Рисунок 2 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола на время жизни мышей относительно контроля при острой гипобарической гипоксии, * - данные статистически значимы (t) по отношению к контрольной группе животных, p?0,05

При изучении противоишемических свойств веществ на модели билатеральной окклюзии сонных артерий было установлено, что исследуемые вещества имели тенденцию к продлению жизни животных при ишемическом повреждении мозга; однако соединение РУ-792 проявило наиболее выраженный антиишемический эффект, увеличивая выживаемость животных через 12, 24, 48 и 72 часа после операции, и продемонстрировало наиболее позитивные характеристики, статистически значимо повышая количество выживших животных на 33% через 72 часа. При сравнении эффективности противоишемического действия изучаемых веществ с мексидолом, все вещества превосходили препарат сравнения по данному показателю на всех временных точках (рис. 3). Таким образом, в ходе исследований было показано, что вещество РУ-792 оказалось наиболее эффективным из изученных субстанций в плане развития долгосрочных противоишемических эффектов. Это свойство данного соединения является достаточно важным, так как известно, что истощение антиоксидантных систем и активное накопление продуктов перекисного окисления липидов происходит при длительной ишемии мозга.



Рисунок 3 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола в изоантиоксидантных дозах на выживаемость крыс при двухсосудистой ишемии; * - данные статистически значимы по отношению к контрольной группе животных; # - данные статистически значимы по отношению к группе животных с ишемией, (точный метод Фишера, p?0,05)

При оценке показателей неврологического статуса и локомоторной активности в позднем послеоперационном периоде было выявлено, что все изучаемые соединения способствовали улучшению данных показателей (таблица 2). Наиболее значимо на эти характеристики влияло вещество РУ-792, нормализуя двигательную активность животных к третьим суткам полностью, не уступая контрольной ложнооперированной группе и даже превосходя ее на 11% (p?0,05), а также превышая группу с мексидолом. При анализе показателей неврологического статуса в послеоперационном периоде было установлено, что соединение РУ-792 практически полностью восстанавливало неврологические повреждения у животных с ишемией до 10,5 баллов на третьи сутки (р?0,05), в то время как вещества РУ-756, РУ-757 и мексидол проявляли это в меньшей степени, неврологический дефицит был более выраженным и нарастал во времени (7,5, 9 и 6,5 баллов (р?0,05) соответственно).



Таблица 2 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола в изоантиоксидантных дозах на двигательную активность и неврологический статус крыс в восстановительном периоде после двусторонней окклюзии общих сонных артерий (M±m)

Группа	Двигательная активность, условные единицы	Неврологический статус, баллы
Контроль	68,8±14,6	10,8±0,7
Ишемия	13,2±3,3*	5,2±0,7*
Ишемия + РУ-756	66,3±21,4	7,5±0,3*#
Ишемия + РУ-757	38,7±14,4	9,0±0,6#
Ишемия + РУ-792	76,7±6,0#	10,5±0,3#
Ишемия + Мексидол	32,8±17,9	6,5±0,6*
Примечание: * - данные статистически значимы (t) по отношению к контрольной группе животных (p?0,05); # - данные статистически значимы (t) по отношению к группе животных с ишемией (p?0,05).

Исследование у экспериментальных животных поведения в тесте «открытое поле» показало, что все соединения достоверно увеличивали у животных с ишемией относительно группы контроль-ишемия уровни горизонтальной и вертикальной активности и норкового рефлекса, уменьшая латентное время нахождения в центральном квадрате, и превосходили по данным показателям препарат мексидол.

О состоянии процессов липопероксидации у ишемизированных крыс судили по содержанию в крови и гомогенатах тканей головного мозга МДА, а также ДК. Вещества неоднозначно влияли на данные показатели. Вещество РУ-792 проявило более выраженные антиоксидантные свойства, подавляя образование МДА, и тем самым, уменьшая перекисные процессы у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга, в сыворотке - на 37% (р?0,05) и мозге - на 40%, концентрация ДК уменьшилась на 44% (р?0,05). Следует отметить, что все изучаемые вещества превосходи по выраженности эффектов препарат сравнения.



Рисунок 4 - Влияние веществ РУ-756, РУ-757, РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) на содержание МДА и ДК в сыворотке крови и тканях мозга при двухсосудистой ишемии головного мозга (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (t) относительно группы контроля;# - данные статистически значимы (t) относительно группы ишемизированных животных, р?0,05

Нарастание перекисного окисления липидов при ишемии головного мозга также сопровождалось значимым подавлением активности одного из антиоксидантных ферментов - ГП. Изучаемые вещества имели тенденцию к увеличению активности фермента в сыворотке крови по сравнению с группой ишемизированных животных, РУ-756 в 1,9 раза, соединение РУ-792 - в 4 раз (p?0,05), практически полностью восстанавливалась активность глутатионпероксидазы под влиянием РУ-757. Препарат сравнения действовал менее эффективно - активность фермента возрастала в 2 раза.

Установлено, что соединение РУ-792 имело тенденцию к увеличению выживаемости крыс с тотальной ишемией при 30-ти минутной реперфузии на 23%, через 24 часа после реперфузии данный показатель был чуть ниже - 20%, и по данным показателям вещество немного превосходило препарат сравнения. Мексидол способствовал повышению количества выживших животных через 30 минут после реперфузии на 14%, через сутки - на 10%.

У крыс, которые получали исследуемое соединение РУ-792, концентрация МДА статистически значимо снижалась по отношению к ишемизированным животным в сыворотке крови и в мозге при 30-ти минутной реперфузии и через 24 часа, однако препарат сравнения мексидол был более активен (рис. 5). 

Рисунок 5 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола на концентрацию МДА в сыворотке крови и мозге при ишемии-реперфузии головного мозга у крыс (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (t) относительно группы контроля; # - данные статистически значимы (t) относительно группы ишемизированных животных, р?0,05

У крыс с ишемией, которым вводили соединение РУ-792, активность фермента ГП повышалась по сравнению с ишемизированным контролем как в сыворотке на 144 и 86%, так и в мозге на 170 и 41% соответственно через полчаса и 24 часа после реперфузии (р?0,05). Тогда как мексидол действовал лишь на ГП в мозге крыс, увеличивая ее активность на 59 и 28% в те же временные интервалы.

Изучаемое антиоксидантное вещество РУ-792 при профилактическом введении оказывало нормализующее действие на показатели ПОЛ в крови и тканях мозга в постишемический период и стабилизировало активность ГП, в большей степени влияя на данный фермент в крови.

В ходе исследования влияния соединения РУ-792 при остром тетрахлорметановом поражении печени было установлено, что соединение приводило к повышению угнетенной при токсическом поражении печени детоксикационной функции гепатоцитов. Соединение РУ-792 в тесте гексеналового сна достоверно снижало длительность как первой фазы сна (на 44%), так и общую продолжительность сна (на 38%) сравнительно с контрольными крысами с гепатитом, однако уступало по данному параметру препарату сравнения мексидолу, проявившему активность - 43 и 50% соответственно (таблица 3). 

Таблица 3 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) при остром тетрахлорметановом гепатите на длительность гексеналового сна (мин) (M±m)

Группа животных	Латентный период, мин	Первая фаза сна, мин	Общая длительность сна, мин
Контроль	2,80±0,457	40,98±6,47	84,28±10,33
Гепатит	1,95±0,12	70,82±10,88*	177,18±26,80*
Гепатит+РУ-792	2,38±0,09#	39,76±2,70#	109,64±7,37#
Гепатит+мексидол	2,77±0,38#	40,64±4,44#	89,35±12,12#
Примечание: * - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных; # - данные статистически значимы (t) относительно группы животных с гепатитом, р?0,05.

Вещество РУ-792 снижало клиренс БСФ на 45 минуте в 1,3 раза по сравнению с контрольными животными с гепатитом, не получавшими препарат (p?0,05) и было сопоставимо по эффекту с мексидолом (1,38 раз), тем самым, соединения улучшали поглотительно-выделительную функцию печени. Повышение в крови активности АлАТ, АсАТ и ЛДГ - ферментов, специфичных для гепатоцита - рассматривается как проявление цитолитического синдрома. Соединение РУ-792 и мексидол несколько уменьшали гиперферментемию - имея тенденцию к снижению активности АлАТ и АсАТ. Однако, ни изучаемое соединение РУ-792, ни препарат сравнения мексидол не оказывали значимого действия на активность данных ферментов в сыворотке крови. У животных при гепатите изменялась активность ЩФ, возраставшая на 78% (p?0,05), что свидетельствовало о нарастании холестаза у контрольных животных с гепатитом. При этом РУ-792 вызывал уменьшение холестаза на 36%, сравнимое с эффектом мексидола (35%).

Развитие гепатита сопровождалось у крыс достоверным уменьшением общего белка в крови на 18%. Под влиянием вещества РУ-792 белок плазмы практически нормализовался, возрастая на 20% (р?0,05), в то же время мексидол влиял на этот показатель менее выражено (10%) (р?0,05).

Установленное в ходе исследований увеличение массового коэффициента печени при гепатите (на 25%) свидетельствовало о гемодинамических нарушениях в этом органе, и, следовательно, развитии отека. Соединение РУ-792 тормозило развитие отека по сравнению с крысами контрольной группы с гепатитом на 10% (р?0,05), тогда как мексидол снижал этот показатель менее выражено (6%) (р?0,05).

У крыс с экспериментальным гепатитом наблюдалась выраженная активация ПОЛ. Отмечалось повышенное накопление конечного продукта - МДА как в печени, так и в крови, а также снижении активности СОД в тканях печени и плазме. У крыс с гепатитом, получавшим соединение РУ-792, уровень МДА снизился в 1,9 раз в печени и практически полностью нормализовался в плазме крови (р?0,05). Мексидол по данному параметру уступал изучаемому соединению (рис. 6). Так же действие вещества РУ-792 приводило к восстановлению активности фермента плазме (на 43%), в печени эффект был менее выражен (24%) сравнительно животных, не получавших лечение, эффект был сопоставим показателям мексидола.

Рисунок 6 - Влияние вещества РУ-792 и мексидола (в изоантиоксидантных дозах) на содержание МДА в крови и печени при остром тетрахлорметановом гепатите (дельта % к контролю); * - данные статистически значимы (t) относительно группы контроля; # - данные статистически значимы (t) относительно группы животных с гепатитом, р?0,05

Изучение защитного действия соединения РУ-792 при интоксикации ТХМ показало, что данное вещество повышает продолжительность жизни, улучшает в основном показатели детоксицирующей функции и имеет тенденцию по влиянию на выделительно-поглотительную функцию гепатоцитов. Уменьшает холестатические, подавляя активность ЩФ, и мезенхимально-воспалительные процессы, уменьшая отек печени, но мало влияет на проявления цитолитического синдрома, т.е. на гиперактивность ферментов АсАТ, АлАТ и ЛДГ, а также проявляет незначительный эффект на гемореологические параметры крови. Достоверно снижает количество продуктов свободно-радикальных процессов, а также имеет тенденцию к увеличению активности антиоксидантных ферментов (рис. 7).

Рисунок 7 - Влияние соединения РУ-792 и мексидола на основные функциональные, биохимические и реологические показатели, на выраженность перекисных процессов при остром токсическом поражении печени (баллы) (каждому эффекту, исходя из его выраженности, присваивались баллы - от 0 до 3); # - данные статистически значимы (t) относительно группы контрольных животных, р?0,05

Таким образом, на основании проведенного скрининга было установлено, что соединения, содержащие в структуре сопряженный электроно-избыточный пирролобензимидазольный цикл, обладают ярко выраженными антиоксидантными и антирадикальными свойствами, способны к перехвату активных форм кислорода, в частности липопероксильный радикал и гидроксильный радикал, а также радикалы ДФПГ и ABTS. При исследовании фармакологического действия изучаемых веществ 8,9-дифенил-N1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазола (РУ-756), 8-метокси-9-фенил-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазола (РУ-757) и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазола (РУ-792) было установлено, что соединение РУ-792, содержащее замещенные фенильные радикалы в структуре, оказывает достаточное противогипоксическое действие, превышая показатели других изучаемых веществ, в том числе и препарата сравнения мексидола. Та же закономерность отмечалась и при изучении противоишемических свойств на моделях ишемических и реперфузионных поражениях мозга. При этом соединение РУ-792 имело более эффективное защитное действие при ишемии головного мозга, нормализуя неврологический статус, локомоторную активность и поведенческие показатели, а также уменьшая выраженность процессов ПОЛ. Изучение защитного действия соединения РУ-792 при токсическом поражении печени тетрахлорметаном показало, что данное вещество улучшает детоксикационную функцию пораженной печени, способствует уменьшению проявления холестатического повреждения, подавляя активность ЩФ, снижает количество продуктов ПОЛ - МДА - как в тканях поврежденной печени, так и крови, а также повышает активность СОД в печени и сыворотке крови.

Учитывая высокую эффективность вещества РУ-792 при различных патологических состояниях, можно считать перспективным дальнейшее изучение у данного соединения фармакологических и токсикологических свойств.



ВЫВОДЫ

В результате проведенного скрининга 34 конденсированных производных бензимидазола было обнаружено 16 (56%) соединений с высокой антиоксидантной и 9 (36%) веществ - с высокой антирадикальной активностью среди производных пирроло[1,2-б]бензимидазола, превосходящими таковые у дибунола, тролокса и мексидола.

Наибольшую АОА и АРА проявили соединения ряда пирроло[1,2-б]бензимидазолов, имеющие в качестве заместителей фенильные, метокси- и диметоксифенильные радикалы, и по уровню токсичности их можно отнести к классу умеренно токсичных веществ. Вещества 8,9-дифенил-N1-диэтиламиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазол (РУ-756), 8-метокси-9-фенил-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазол (РУ-757) и 8-фенил-9-(3,5-ди-метокси-фенил)-N1-морфолиноэтил-пирроло[1,2-б]бензимидазол (РУ-792)с условным терапевтическим индексом 715,3, 1126,8 и 1198,4 соответственно превосходили по данному параметру препараты сравнения дибунол и мексидол.

Наличие в структуре изучаемых веществ пиррольного кольца, сопряженного с молекулой бензимидазола, обуславливает у изучаемых соединений высокие антиоксидантные и антирадикальные свойства. АОА в основном, определяется стерическими характеристиками молекулы, а АРА - также электронными и липофильными параметрами соединения.

Вещества РУ-756 и РУ-792 при гипоксическом повреждении головного мозга (в изоантиоксидантных дозах 5,4 и 8,2 мг/кг соответственно) оказывали противогипоксическое действие, увеличивая время жизни животных (75 и 127% соответственно), превосходя по активности мексидол (122,4 мг/кг) - 71%.

Соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных при билатеральной окклюзии сонных артерий на 33%, превосходя по противоишемическому эффекту вещества РУ-756 и РУ-757 и препарат сравнения мексидол. Вещество РУ-792 улучшало поведенческие характеристики в тесте «открытое поле» и актометре, значимо сокращая неврологический дефицит у животных; снижало выраженность процессов ПОЛ, статистически значимо уменьшало концентрацию МДА как в сыворотке крови, так и в мозге - на 37 и 40% соответственно - и ДК в мозге на 44%.

У животных при тотальной ишемии-реперфузии мозга соединение РУ-792 (8,2 мг/кг) повышало выживаемость животных на 20%, мексидол (122,4 мг/кг) - на 10%. Вещество РУ-792 нормализовало показатели перекисных процессов, снижая концентрацию МДА при отдаленных сроках реперфузионного повреждения в сыворотке (на 33%) и в мозге (на 32%); восстанавливало активность ГП в крови (на 86%) и мозге (на 41%).

Вещество РУ-792 (доза 8,2 мг/кг) уменьшало токсическое действие CCl4 на печень. Оно улучшало детоксикационную функцию печени, укорачивая длительность «гексеналового сна» на 38%, уменьшало процессы холестаза, снижая активность ЩФ на 36%, тормозило мезенхимально-воспалительные реакции, сокращая отек печени на 10%, нормализовало белковый обмен и было сопоставимо с эффектами мексидола. Вещество РУ-792 снижало концентрацию МДА в сыворотке крови до нормы и в тканях печени в 1,9 раза, тем самым, уменьшая процессы пероксидации в поврежденном органе.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ельцова, Л.В. Изучение антиоксидантной активности производных пирроло[1,2-б]бензимидазола на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 62-й итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2004 - С. 96-97;

2. Ельцова, Л.В. Антиоксидантная и антирадикальная активность новых производных в ряду пирроло[1,2-б]бензимдазола // Мiжнародна науково-практична конференцiя молодих вчених «Вченi майбутнього». Тези доповiдей. 14-16 жовтня 2004 року - Одеса: Одеський державний медичний укнiверситет, 2004. - С. 30-31;

3. Ельцова, Л.В. Скрининг в ряду веществ, производных пирроло[1,2-б]бензимидазола, проявляющих антиоксидантную и антирадикальную активность на моделях in vito // Материалы IX региональной конференции молодых исследователей Волгоградской обл., 9-12 ноября 2004 года - Волгоград, 2005 - С. 39-41;

4. Анисимова, В.А. Синтез и биологическая активность 9-диалкиламиноэтил-2-окси(диокси)фенилимидазоло-[1,2а]бензимидазола / А.А. Спасов, В.А. Косолапов, М.В. Черников, А.Ю. Стуковина, Л.В. Ельцова, Н.П. Ларионов, Р.Е. Либинзон, О.Е. Ватолкина // Хим.-фарм. журнал. - 2006 -Т.40, №10. - С. 3-10;

5. Ельцова, Л.В. Изучение антигипоксического действия новых производных пирролобензимидазола / Л.В. Ельцова, В.А. Косолапов // Материалы 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам». 13-16 марта 2006 г. д/о «Подмосковье». Москва: ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. 2006 - С. 28 [русский], С. 98 [английский];

6. Ельцова, Л.В. Изучение антигипоксических свойств новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 64-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2006 - С. 134;

7. Ельцова, Л.В. Изучение антигипоксической активности новых производных пирролобензимидазола // Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты: Всероссийская конференция молодых ученых и II школа им. академика Эммануэля. Доклады и тезисы. - М.: Изд-во РУДН, 2006 - С. 168-170;

8. Ельцова, Л.В. Изучение нового производного пирролобензимидазола на модели тотальной ишемии головного мозга крыс / Л.В. Ельцова, А.А. Орлова // Материалы XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 8-10 ноября 2006 года - Волгоград, 2006 - С. 10-11;

9. Ельцова, Л.В. Изучение зависимости «структура-активность» в ряду производных пирроло[1, 2-а]бензимидазола / Л.В. Ельцова, М.С. Срослов // Материалы XI региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 8-10 ноября 2006 года. - Волгоград, 2006 - С. 33;.

10. Ельцова, Л.В. Противоишемические свойства новых производных пирроло[1,2-а]бензимидазола, проявляющих высокую антиоксидантную активность // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 65-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2007. - С. 148;

11. Васильев, П.М. Экспериментальная проверка точности компьютерного прогноза антиоксидантной активности новых гетероциклических соединений / П.М. Васильев, В.А. Косолапов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, А.А. Орлова, В.А. Анисимова // Фармакология - практическому здравоохранению: Материалы III съезда фармакологов России / Психофармакол. биол. наркол. - 2007 - Т. 7, спец. вып. (сентябрь). - Ч. 1. - С. 1743;

12. Косолапов, В.А. Антиоксиданты как средства коррекции ишемических нарушений головного мозга / В.А. Косолапов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, В.А. Анисимова // Фармакология - практическому здравоохранению: Материалы III съезда фармакологов России / Психофармакол. биол. наркол. - 2007 -Т. 7, спец. вып. (сентябрь). - Ч. 1. - С. 1743-1744;

13. Косолапов, В.А. Антиоксидантные вещества - как основа для создания средств коррекции ишемии головного мозга / В.А. Косолапов, А.А. Спасов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, В.А. Анисимова // Лекарственные средства и биологически активные соединения: Материалы конф. / Международная научная конференция, посвященная 40-летию НПЦ «Институт фармакологии и биохимии НАН Беларуси». Гродно, 2007. - С. 82-83;

14. Ельцова, Л.В. Гепатопротекторные свойства нового производного бензимидазола РУ-792 при токсическом поражении печени у крыс // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 66-й открытой итоговой научной конференции молодых ученых и студентов / Под общей ред. акад. В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. - С. 158-159;

15. Ельцова, Л.В. Противогипоксическая активность некоторых производных пирроло[1,2-б]бензимидазола с высокой антиоксидантной активностью / Л.В. Ельцова, В.А. Косолапов, А.А. Спасов // Пятая Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» / Патогенез. - 2008. - Т. 6, № 3 - С. 59;

16. Ельцова, Л.В. Гепатопротекторная активность нового производного бензимидазола РУ-792 при токсическом поражении печении у крыс // Материалы XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 11-14 ноября 2008 года. - Волгоград, 2008 - С. 15-21;

17. Косолапов, В.А. Поиск новых веществ с антиоксидантными и церебропротекторными свойствами среди привилегированных молекул / В.А. Косолапов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, А.А. Спасов, В.А. Анисимова // Сборник научных трудов «Современная инновационная медицина - населению Волгоградской области» / Под ред. акад. РАМН В.И. Петрова. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ, 2008. - С. 147-148;

18. Косолапов, В.А. Отбор антиоксидантных веществ с церебропротектор-ными свойствами среди привилегированных молекул / В.А. Косолапов, А.А. Спасов, Л.В. Ельцова, Е.В. Тибирькова, В.А. Анисимова // Тезисы докладов V международной Крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии». - Судак, Крым, Украина, 21-30 сентября 2009. - С. 33;

19. Анисимова, В.А. Синтез и фармакологическая активность дигидрохло-ридов 3-(2,2,2-трихлор-1-гидроксиэтил)имидазо[1,2-а]бензимидазола / В.А. Анисимова, А.А. Спасов, В.А. Косолапов, И.Е. Толпыгин, В.И. Поротиков, А.Ф. Кучерявенко, В.А. Сысоева, Е.В. Тибирькова, Л.В. Ельцова // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - Т. 43, № 9. - С. 9-12.

Размещено на Allbest.ru

...