Микроэкологические особенности компонентов биопленки репродуктивного тракта женщин

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.02.08 - экология (биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КОМПОНЕНТОВ БИОПЛЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОГО ТРАКТА ЖЕНЩИН

Даньшина Анастасия Владимировна

Ульяновск - 2012

Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Романова Елена Михайловна доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой экологии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный технический университет» Тихомирова Елена Ивановна

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»)

Защита диссертации состоится «18» мая 2012 года на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, Набережная реки Свияги, 106, корп. 1, ауд. 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, с авторефератом - на сайте ВУЗа - www.uni.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии Министерства образования и науки Российской Федерации - http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент С.В. Пантелеев



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема взаимоотношений микробной популяции и человека продолжает оставаться одной из важнейших на современном этапе существования человеческого общества. Особую значимость приобретает вопрос о влиянии микроорганизмов на макроорганизм в условиях экологической системы (Акопова, 2010).

Представление о способах взаимодействия паразита и хозяина в последние годы претерпело значительные изменения. Показано, что бактерии для своего выживания широко используют преимущества, которые дает коллективное поведение (Lewis K., 2005). Одним из основных открытий в этой области следует считать установление факта существования бактерий в составе сообществ, получивших название «биопленка» (Тец, 2007). Биопленки образуются в естественных условиях существования бактерий, в том числе, в организме человека на поверхности кожи и слизистых (Белова и соавт., 2004).

Образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в организме хозяина благодаря благоприятной среде в пределах покрывающей их пленки. Способность бактерий существовать в составе биопленок значительно повышает устойчивость бактерий к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с планктонными формами микроорганизмов (Ильина, 2004).

Известно, что биопленки - это полимикробные фиксированные сообщества, окруженные защитным полимерным матриксом, где формируется своеобразная экологическая система, способствующая сохранению жизнеспособности микробных популяций. (Семенов, 2009). В настоящее время природа и свойства матрикса установлены, в то время как микробный компонент биопленки репродуктивного тракта женщин остается мало изучен.

Целью исследования явилась экологическая оценка структуры биопленки репродуктивного тракта женщин и выявление изменений биоэкологических характеристик ее компонентов в условиях дисбактериоза данного биотопа.

Для достижения цели были сформулированы следующие задачи:

Определить видовую структуру биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивного тракта.

Дать экологическую характеристику компонентов микробоценоза изученных биотопов.

Выявить изменения биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных бактерий-ассоциантов на примере представителей рода Staphylococcus. биопленка вагинальный цервикальный дисбактериоз

Научная новизна работы. Впервые дана экологическая характеристика структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов здоровых женщин, а также при дисбактериозе репродуктивной системы. Показаны глубокие изменения микробоценоза репродуктого тракта на уровне экосистемы, сопровождающиеся сменой ценотипа и иерархии микробных таксонов биопленки при нарушении микроэкологии репродуктивного тракта.

Анализ видового состава микробных ассоциаций изученных биотопов при дисбактериозе, по сравнению со здоровыми женщинами, выявил значительные нарушения биоценотических связей в биопленке, проявлявшиеся снижением доминирования основных симбионтов на фоне роста представителей добавочной и транзиторной микробиоты.

На примере представителей рода Staphylococcus показано, что выявленные нарушения структуры биопленки сопровождаются изменением биоэкологических свойств микробов-ассоциантов, проявлявшихся в повышении их патогенного потенциала. Показана значительная активизация продуцирования ферментов агрессии этими микроорганизмами и усиление летального эффекта в опытах in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе данные дают представление о различиях структуры биопленки репродуктивного тракта здоровых женщин и при дисбактериозе данного биотопа. Анализ экологических показателей видового состава биопленки расширяют представление о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микробоценоза репродуктивной системы женщин.

Выявленные изменения экологических характеристик биопленки способствуют реализации вирулентного потенциала ее компонентов, в результате чего усиливается их способность оказывать патологическое действие на макроорганизм. Учитывая широкую распространенность дисбактериоза органов репродуктивного тракта женщин, необходимо учитывать изменения патогенных свойств компонентов биопленки данного биотопа и возможность возникновения эндогенной инфекции в результате трансформации нормоценоза. В связи с этим для оптимизации диагностики предлагается внедрение в работу бактериологических лабораторий определение биоэкологических свойств компонентов биопленки репродуктивных органов.

По материалам диссертационной работы опубликованы практические рекомендации «Экологическая характеристика микробоценоза вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин» (2012).

Метод определения экологических параметров микробоценоза при дисбактериозе репродуктивного тракта внедрен в работу лаборатории ГУЗ ОКБ г. Ульяновска.

Полученные данные используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по курсу микробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Структурная перестройка биопленки при дисбактериозе репродуктивного тракта женщин проявляется глубокими изменениями пространственной организации и сменой иерархии экологических групп микроорганизмов.

2. Дисбактериоз сопровождается сменой абсолютных доминант, увеличением показателей частоты встречаемости и видового разнообразия добавочной и транзиторной микробиоты биотопа репродуктивного тракта.

3. Изменение структуры биопленки вагинального и цервикального биотопов репродуктивной систем женщин сопровождается изменением биоэкологических свойств патогенных и условно патогенных эндосимбионтов на примере представителей рода Staphylococcus.

Личный вклад автора. В основу данной работы положены материалы собранные автором за период 2009-2011 гг. Автор принимал непосредственное участие в разработке темы, составление плана исследования, сборе материала, обобщения и интерпретации полученных данных.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Санкт-Петербург, 2009); «Всероссийской научно-методической конференции: инновации и традиции науки образования» (Сыктывкар, 2010); III Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» (Москва, 2010); III Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ, 5 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 219 наименований, в том числе 59 зарубежных. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 31 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 содержит обзор отечественной и зарубежной литературы по данной проблеме.

Раздел 1.1. посвящен рассмотрению биопленки как формы существования микроорганизмов. Изучены основные работы, посвященные способности бактерий образовывать биопленки и изменять свои свойства при образовании последних.

Раздел 1.2. посвящен проблеме экологического преимущества биопленок. Рассматриваются вопросы о более выгодном росте бактерий в сообществе, чем в виде планктонных форм.

В разделе 1.3. рассматривается структура биопленки репродуктивного тракта женщин. В данном разделе указана морфология микробоценоза здоровых женщин и при состояниях, связанных с дисбактериозом данного биотопа. Показаны также основные причины, приводящие к развитию нарушений состава микробиоты репродуктивного тракта.

Раздел 1.4. Рассматриваются теоретические аспекты исследований стафилококков. В данном разделе дан анализ многогранного проявления патогенного потенциала данных бактерий и их влияние на изменение состава микробоценозов организма.

Глава 2. посвящена материалам и методам исследований. Изучены культуры микроорганизмов, выделенных из репродуктивного тракта 256 женщин (1 группа) в возрасте от 18 до 45 лет с дисбактериозом влагалища. Группу сравнения (2 группа) составили 53 здоровых женщины, репрезентативных по возрасту.

Исследование морфологии биопленки репродуктивного тракта женщин проводили согласно приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.85. («Об унификации микробиологических методов исследования, применяющихся в клинико-диагностических лабораториях на базе лечебно-профилактических учреждениях»). Исследование позволило определить как качественный, так и количественный состав бактериальной микрофлоры.

Работа выполнена на базах:

Бактериологической лаборатории городской больницы № 1 г. Ульяновска (зав. лабораторией - Т.И. Волгина).

Клинической лаборатории Областной клинической больницы г. Ульяновска (зав. лабораторией - Р.Ф. Бурганова).

Кафедры общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии ИМЭиФК УлГУ.

Центра коллективного пользования УлГУ.

Посевы осуществляли на дифференциально-диагностические и элективные среды, такие как ЖСА, МПА, МПБ, Staphylococcus agar (Becton Diskinson), 5% -кровяной агар, Сабуро, Блаурокка, МРС-4, Эндо и др.

Культуры, выросшие на питательных средах, подвергали групповой (анаэробные, неспорообразующие бактерии), родовой (бифидобактерии) и видовой идентификации (лактобактерии, стафилококки, эшерихии, стрептококки, энтерококки, дрожжеподобные грибы рода Candida). Видовую иентификацию микроорганизмов проводили с использованием определителя Берджи (1997). Морфологические и тинкториальные свойства выделенных культур изучали в мазках, окрашенных по Граму.

Атомно-силовой микроскопии подвергали биопленки, полученные в пластиковых 96-ти луночных планшетах (Sarstedt, Германия). В лунки вносили бульонные культуры бактерий, выращивали в течении 24-48 часов при t=370 С в соответствии с условиями культивирования. Затем готовили препараты для сканирующей микроскопии по методике, предложенной Мальником В.В. (2010).

Экологическую оценку микробоценоза репродуктивного тракта проводили путем определения индекса контагиозности (Уиттекер, 1980), индекса флористической значимости видов (Наткевичайте-Иванускене, 1985), видового разнообразия сообщества микроорганизмов (1980) и показателя постоянства (Домбровский, 1986).

С целью повышения эффективности выявления компонентов биопленки наряду со стандартным методами клинико-лабораторного обследования использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием тест-системы «Фемофлор» (ООО «НПО ДНК-Технология»).

Адгезивную, гемолитическую активность стафилококков определяли in vitro, вирулентность in vivo (Лабинская А.С., 2010).

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием t критерия по Стьюденту. Результаты считались достоверными при р<0,05. Для обработки данных использовали пакет прикладных программ Microsoft Office 2003.

Глава 3 состоит из 4 разделов и включает в себя изложение собственных результатов, полученных в ходе исследования.

В разделе 3.1. представлена общая характеристика компонентов биопленки репродуктивной системы здоровых женщин и пациенток с дисбактериозом.

Проведенные исследования выявили существенные отличия интенсивности роста микробиоты репродуктивного тракта пациенток первой и второй групп. У 80,6% женщин 2 группы выявлен скудный рост микробиоты, обильного роста ни в одном случае обнаружено не было. Напротив, 64,3% обследованных 1 группы имело обильную микробиоту.

В разделе 3.2. описан морфологический состав биопленки репродуктивного тракта.

Результаты исследования показали, что в микробоценозе влагалища практически всех здоровых обследуемых (98,6%) превалировали Lactobacillus spp. в относительно высокой концентрации (6,9±0,2 lg КОЕ/мл), их встречаемость в цервикальном канале составила 50,6%. Bifidobacterium spp. во влагалищном биотопе были выявлены у 46% и в цервикальном канале у 16,7% здоровых женщин. Плотность колонизации данных бактерий составила 4,3±0,1 lg КОЕ/мл. Частота высеваемости остальных представителей микробоценоза в цервикальном и вагинальном биотопах варьировала, однако патогенных видов ни в одном случае выявлено не было .

Представленные данные свидетельствуют о доминировании в биотопе влагалища и цервикального канала здоровых женщин нормальной микробиоты, представленной, в основном, лактобациллами. Они, проявляя высокую степень колонизационной резистентности, являются одним из основных факторов поддержания межвидового баланса микроорганизмов данного биотопа. Обсемененность микросимбионтами влагалища, превышала уровень ПМО в цервикальном биотопе. Показатели частоты встречаемости и плотности колонизации в обоих биотопах условно патогенных микроорганизмов не превышало уровня нормоценоза.

В разделе 3.3. изложены данные о микробоценозе влагалища и цервикального канала при дисбактериозе.

Проведенные исследования микробиоты влагалища женщин 1 группы, выявили значительные изменения соотношения видов, составляющих микробоценоз данного биотопа. Так, при дисбактериозе репродуктивного тракта обследованных женщин выявлены изменения видового состава биопленки по сравнению со здоровыми. Это проявлялось снижением частоты встречаемости представителей рода Lactobacillus и Bifidobacterium в вагинальном биотопе в 2 раза (рис. 1).



Рис. 1. Частота встречаемости Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. во влагалищном биотопе (%)

В цервикальном биотопе у обследованных 1 группы представители нормальной микробиоты не высевались, тогда как у женщин 2 группы частота встречаемости бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium составляла 51,9% и 16,7% соответственно. На фоне дефицита, а в ряде случаев, отсутствия микробов-эубионтов, отмечалось увеличение численности, частоты встречаемости и видового разнообразия условно патогенных микроорганизмов (рис. 2).

При дисбактериозе органов репродуктивного тракта отмечалось увеличение частоты встречаемости представителей добавочной микрофлоры, таких как стафилококки - более чем в 2 раза, грибы рода кандида - в 1,7, энтерококки и коринебактерии - в 1,4 раза, а также появление клостридий, бактероидов и гарднерелл.



Рис.2. Частота встречаемости добавочной микробиоты репродуктивного тракта женщин (%)

Наибольшие показатели частоты встречаемости (58,6%) и интенсивности колонизации (9,6±1,2 lg КОЕ/мл (p<0,05) были отмечены у представителей рода Staphylococcus. Наряду с коагулазоотрицательными, и из влагалища, и цервикального канала были изолированы коагулазоположительные стафилококки.

Из коагулазоотрицательных чаще выделяли S. еpidermidis (55,8% всего общего количества выделенных штаммов) в концентрации 104-106 КОЕ/мл. У 12,1% обследованных 2 группы, в отличие от здоровых женщин, был обнаружен абсолютный патоген S. aureus, показатель микробной обсемененности которого составил 7,5±1,49 lg КОЕ/мл (рис. 3). Все исследуемые штаммы данного вида отличались выраженными признаками патогенности - гемолитической активностью, наличием лецитиназы, плазмокоагулазы, ферментацией маннита.



Рис. 3. Видовой состав стафилококков биотопов репродуктивного тракта

Таким образом, при дисбактериозе репродуктивной системы происходило снижение частоты встречаемости нормальной микробиоты на фоне увеличения количественных показателей и расширения видового спектра условно-патогенных и появления патогенных микроорганизмов (S. aureus, Str. pyogenes). Доминирующим таксоном при дисбиотических нарушениях микробоценоза являлись Staphylococcus spp.

В разделе 3.4. описаны особенности микробных компонентов биопленки при дисбактериозе, связанном с воспалительными процессами в отдельных органах репродуктивного тракта женщин.

При воспалительном процессе в шейке матки, придатках матки и влагалище выявлено снижение частоты встречаемости представителей облигатной микробиоты (Lactobacillus spp.) и отсутствие бактерий рода Bifidobacterium на фоне повышения частоты выделения условно патогенной биоты во влагалищном и цервикальном биотопах. Наиболее значительное повышение было выявлено у S. epidermidis (35,3%) и Candida spp. (36,9%). Показатели плотности колонизации были также увеличены по сравнению со здоровыми женщинами - у S. epidermidis до 8,5±0,7 lg КОЕ/мл, у грибов рода Candida до 8±1,3 lg КОЕ/мл.

Таким образом, изучение микробных компонентов биопленки при воспалительном процессе в органах репродуктивной системы - шейке матки, придатках матки и влагалище, выявило снижение показателей частоты встречаемости и плотности колонизации индигенных симбионтов - Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. во влагалищном и цервикальном биотопах, по сравнению со здоровыми, на фоне повышения уровня выделения условно патогенной биоты.

Наиболее значительное повышение показателей частоты встречаемости и плотности колонизации было выявлено у Staphylococcus epidermidis (35,3% и 8,5±0,7 lg КОЕ/мл соответственно). В составе биопленки был также выявлен абсолютный патоген - S. aureus, который характеризовался высоким титром колонизации влагалищного биотопа.

Глава 4. При изучении ассоциативных взаимоотношений компонентов биопленки производили определение показателей, характеризующих ее экологическую стабильность.

Определение индекса контагиозности, демонстрирующего равномерность распределения видов в пространстве, показало, что у женщин при дисбактериозе наблюдается достоверное уменьшение данного показателя у представителей облигатной микробиоты. Это приводит к освобождению экологических ниш и замещение их факультативной флорой, что свидетельствует о неравномерности участия в горизонтальной структуре микропейзажа репродуктивного тракта основных участников биоценоза и представителей транзиторной биоты.

Максимальное снижение данного показателя отмечалось у представителей облигатной биоты - лактобактерий и бифидобактерий, выделенных у женщин 1 группы. У видов, входящих в группу транзиторной микробиоты, было отмечено увеличение показателя индекса контагиозности - у стафилококков почти в 4 раза, грибов рода кандида - в 2,6, кишечных палочек в 2,3 раза (табл. 1).

В цервикальном канале также отмечали повышение показателя кантогиозности по сравнению с контролем: у стафилококков в 4 раза, дрожжеподобных грибов рода Candida в 2,7, энтерококков в 2 раза. Появились представители родов, не выявленные во 2 группе, такие как коринебактерии и клостридии.

Полученные данные свидетельствовали о диспропорции участия в горизонтальной структуре микропейзажа основных симбионтов и представителей условно-патогенной биоты биопленки.

Таблица 1 - Показатели индекса контагиозности микробных компонентов биопленки

Микроорганизмы	Обследованные
	1 группа (биотопы)	2 группа (биотопы)
	влагалища	цервикального канала	влагалища	цервикального канала
Lactobacillus spp.	0,41±0,1*	0,34±0,02	0,9±0,3	0,82±0,1
Bifidobacterium spp.	0,36±0,02*	0,27±0,01	0,63±0,07	0,57±0,03
Escherichia coli	0,56±0,25	0,35±0,15	0,24±0,01	0,19±0,01
Streptococcus spp.	0,58±0,03	0,4±0,02	0,41±0,17	0,33±0,01
Staphylococcus spp.	0,98±0,1*	0,6±0,02*	0,27±0,03	0,15±0,01
Enterococcus spp.	0,63±0,02	0,48±0,1	0,46±0,07	0,32±0,04
Corynebacterium spp.	0,47±0,16	0,41±0,03	0,28±0,13	-
Clostridium spp.	0,31±0,1	0,3±0,01	-	-
Candida spp.	0,75±0,03*	0,54±0,1*	0,28±0,13	0,2±0,01

Примечание: * - достоверность различия показателя по сравнению с женщинами 2-й группы

Для характеристики компонентов биопленки как экологической системы, раскрытия её ценотической структуры применяли метод учёта количественных соотношений встречаемости определенных типологических групп микроорганизмов.

Для этого определяли индекс флористической значимости. Результаты исследований выявили уменьшение данного показателя для Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. у женщин с дисбактериозом в 1,5 раза по сравнению с обследованными 2 группы.

Условно-патогенные бактерии демонстрировали стойкий рост индекса флористической значимости при дисбактериозе репродуктивного тракта и во влагалищном, и в цервикальном биотопах (табл. 2).

Таблица 2 - Показатели индекса флористической значимости видов экосистемы влагалища

Микроорганизмы	Индекс флористической значимости (%)
	1 группа	2 группа
	Влагалище	Цервикальный канал	Влагалище	Цервикальный канал
Lactobacillus spp.	8,3	6,7	12,1	11,7
Bifidobacterium spp.	6,4	4,1	8,8	7,8
Escherichia coli	5,94	5,1	3,2	2,9
Streptococcus spp.	4,31	4	3,0	2,2
Staphylococcus spp.	10,6*	10,1	2,9	2,1
Enterococcus spp.	4,65	3,9	4,1	2,7
Corynebacterium spp.	3,73	3,4	3,5	-
Clostridium spp.	3,4	2,6	-	-
Candida spp.	8,35*	7,4	2,3	1,6

Примечание * - достоверность различия показателя по сравнению с женщинами 2-й группы

Для определения доли участия разных видов в структуре биоценоза определяли показатель постоянства, позволяющий установить типологию доминант биоценоза (табл.3).

Установлено, что в составе биопленки репродуктивного тракта у здоровых женщин доминирующая группа была представлена лактобактериями, бифидобактерии относились к добавочным видам. Обращает на себя внимание отсутствие в добавочных видах условно-патогенной микробиоты.

Анализ микробных компонентов биопленки репродуктивной системы у женщин 1 группы показал, что изменения имеют последовательный характер и проявляются на уровне экосистемы, выражаясь в отсутствии доминантных видов. Представители нормальной микробиоты, такие как лакто- и бифидобактерии перешли в транзиторную группу, а абсолютно доминирующими видами стали патогенные и условно-патогенные стафилококки. Микробоценоз характеризовался появлением широкого спектра добавочных и транзиторных видов.

Таблица 3 - Показатель постоянства компонентов биопленки репродуктивной системы и у здоровых женщин

№ п/п	Микроорганизмы	Показатель постоянства, %
		1 группа	2 группа
Доминирующие виды
1	Lactobacillus spp.	-	100
2	Staphylococcus spp.	60,5	-
Добавочные виды
3	Bifidobacterium spp.	-	27,2
4	Candida spp.	48,6	-
5	Streptococcus spp.	30	-
6	Enterococcus spp.	30,6	-
Транзиторные виды
7	Gardnerella spp.	17,2	14
8	Clostridium spp.	-	16
9	Corynebacterium spp.	3,4	-
10	Escherichia coli	17,2	-

Установлен выраженный дисбаланс микробиоты, проявляющийся в данной группе за счет увеличения частоты встречаемости представителей условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Увеличение значимости транзиторной микробиоты и снижение облигатной свидетельствует об уравнивании значимости членов сообщества.

Существенной характеристикой микробного сообщества является видовое разнообразие, позволяющее дополнить картину количественных характеристик экосистемы. Определение коэффициента видового разнообразия репродуктивного тракта выявило достоверное увеличение количества видов у обследованных 1-й группы, как во влагалищном биотопе, так и в цервикальном (рис. 4).

Рис.4. Видовое разнообразие биопленки влагалищного и цервикального биотопов обследуемых

Показатель видового разнообразия микробных ассоциаций во влагалищном биотопе увеличивался по сравнению со здоровыми в 1,8 раза, в цервикальном канале - в 1,6 раза. Следовательно, контаминация условно-патогенными штаммами микроорганизмов значительно легче происходила у исследуемых 1-ой группы при дисбактериозе микробоценоза данного биотопа.

Таким образом, проведенные исследования показали, что у женщин с дисбактериозом репродуктивного тракта происходят качественные и количественные изменения биопленки данного биотопа. Это проявляется в увеличении показателей общей бактериальной плотности, а также частоты встречаемости условно-патогенной микробиоты на фоне снижения доминирования основных ассоциантов. Доминантные представители микробоценоза при дисбактериозе отсутствуют, тогда как в контрольной группе основными видами являлись лактобациллы и бифидобактерии. Кроме того, при нарушении микробоценоза в группе добавочных видов появились бактерии Staphylococcus spp. и Candida spp., которые в нормоценозе изучаемого биотопа отсутствовали. Следовательно, выявлены значительные изменения видового разнообразия биотопа урогенитального тракта.

В главе 5 представлена характеристика биоэкологических свойств бактерий рода Staphylococcus.

В разделе 5.1. описаны биологические свойства выделенных представителей рода Staphylococcus.

Показано, что у обследованных 1 группы доминирующим компонентом биопленки являлись стафилококки. По сравнению со 2 группой показатели частоты встречаемости у них увеличились в 2,3 раза, а интенсивности колонизации в 4 раза. Их видовой спектр был шире, чем у здоровых женщин и появился безусловный патоген - S. aureus.

Выделенные культуры стафилококков обладали типичными морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами.

По морфологическим свойствам в препаратах, окрашенных по Граму, Staphylococcus spp. представляли собой кокки (диаметром 0,6-1,5 мкм), располагавшиеся беспорядочными скоплениями, по форме чаще напоминающими гроздья винограда, реже попарно или тетрадами, неподвижные, спор и капсул не образовывали, хорошо окрашивались анилиновыми красителями, грамположительные.

При выполнении атомно-силовой сканирующей микроскопии были получены АСМ-изображения стафилококков, выделенных из биопленки репродуктивного тракта женщин.

В разделе 5.2. приведено сравнительное изучение вирулентности стафилококков, входящих в состав биопленки репродуктивного тракта женщин 1 и 2 групп, in vitro. Показано, что культуры, выделенные при дисбактериозе, в отличие от контроля, обладали способностью расщеплять маннит и вызывать агглютинацию эритроцитов, а также более выраженной гемолитической активностью (рис. 5).

Штаммы стафилококков, выделенные в 1 группе, обладали также, в отличие от 2 группы, коагулазной и фосфатазной активностью.

Для выявления значения стафилококков в развитии дисбактериоза репродуктивной системы изучали их вирулентность in vivo. Проведенные исследования показали, что 83,1% штаммов 1 группы давали положительную внутрибрюшинную пробу, тогда как во 2 группе этот показатель был значительно ниже (p<0,05).

Уровень вирулентности (LD50)стафилококков варьировал, что позволило разделить все изученные штаммы на группы: слабо-вирулентные, у которых LD50 cоставила 2,1; умеренно-вирулентные - 3,2; высоко-вирулентные - 6,2 и невирулентные. В 1й группе преобладали умеренно- и высоко-вирулентные штаммы, во 2й группе - невирулентные (58%) (рис. 6).

Рис.5. Вирулентные свойства стафилококков



Рис.6. Уровень вирулентности стафилококков, входящих в состав биопленки репродуктивного тракта

В разделе 5.3. описана чувствительность стафилококков, выделенных у больных из биотопов влагалища (83 изолята) и цервикального канала (67штаммов) к химиопрепаратам: эритромицину, гентамицину и ампициллину.

Установлено, что множественной антибиотикорезистентностью обладали 25,4% штаммов, в том числе выделенные из биопленки влагалищного биотопа (19,7%) и цервикального канала (5,7%).

Из всех видов стафилококков наиболее высокой антибиотикорезистентностью обладали штаммы S. aureus, особенно выделенные из биопленки вагинального биотопа - 83%. Изоляты, выделенные из цервикального канала, не обладали множественной резистентностью к антимикробным препаратам. Доля умеренно-чувствительных и чувствительных была одинаковой в каждой группе - 8 ,5%.

Из S. epidermidis 63% штаммов были устойчивы к антимикробным препаратам, 15% изолятов проявили умеренную чувствительность, 22% штамма были чувствительны.

У вида S. saprophyticus количество антибиотикоустойчивых штаммов составило 35,2%. Остальная доля изолятов проявила умеренную чувствительность.

С целью более полной характеристики чувствительности клинических изолятов к антимикробным препаратам использовали определение минимальной подавляющей концентрации к отдельным антимикробным препаратам (эритромицин, ампициллин, гентамицин). Для эритромицина и ампициллина она составила 10-3мг/мл, а к гентамицину стафилококки были чувствительны даже при разведении 10-4мг/мл.

Результаты исследования показали, все выделенные клинические изоляты стафилококков обладали разной чувствительностью к антимикробным препаратам. Наибольшее количество изолятов было чувствительно к гентамицину (63,4%) и эритромицину (48,2%), менее выражено данное свойство было по отношению к ампициллину (15%). Полученные результаты подтвердились при определении минимальной ингибирующей концентрации.

Таким образом, показано, что патогенные и условно-патогенные стафилококки, входящие в состав биопленки репродуктивного тракта, обладают значительным набором ферментативных свойств и полирезистентностью к широкому спектру антибиотиков.



ВЫВОДЫ

В структуру биопленки здоровых женщин входили представители 16 родов микроорганизмов, из которых Lactobacillus spp. составляли доминантную группу, Bifidobacterium spp. - добавочную, к группе транзиторных микроорганизмов относились 14 условно-патогенных видов.

Структура биопленки вагинального и цервикального биотопов при дисбактериозе репродуктивной системы характеризовалась снижением частоты встречаемости облигатных компонентов (Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.) на фоне увеличения количественных показателей и расширения видового спектра условно-патогенных, а также появления патогенных микроорганизмов (S. aureus, S. pyogenes).

Перестройка ценотипа и смена абсолютных доминант экосистемы биопленки при дисбактериозе репродуктивной системы сопровождалась снижением доминирования и флористической значимости основных симбионтов (Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp.) на фоне увеличения видового разнообразия и частоты встречаемости транзиторной микробиоты (Staphylococcus spp., Candida spp.). Понижение показателей контагиозности представителей нормальной микробиоты приводило к освобождению экологических ниш, занимаемых транзиторной биотой.

Дисбаланс микробной экосистемы биопленки влагалища и цервикального канала при дисбактериозе репродуктивной системы сопровождался расширением спектра биоэкологических свойств представителей рода Staphylococcus, обеспечивающих подавление симбионтов.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах из списка ВАК:

1. Мясникова (Даньшина) А.В. Мониторинг микробиоценоза урогенитального тракта женщин при микоплазменных инфекциях / М.А. Орлина, И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.В. Мясникова // Вестник новых медицинских технологий. Тула, - 2010. - № 5. - С. 97-100.

2. Мясникова (Даньшина) А.В. Морфологический состав биопленки биотопа влагалища при воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта женщин / А.В. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Ю.С. Нагорнов // Вестник новых медицинских технологий. - Тула, 2011. - № 4. - С. 21-24.

3. Мясникова (Даньшина) А.В. Изменение микрофлоры влагалища при воспалительных заболеваниях урогенитального тракта у женщин с метаболическим синдромом / Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Н.И. Кан, О.И. Ивандеева, А.В. Мясникова, А.С. Нестеров, Ю.С. Нагорнов // Естественные и технические науки - Москва, 2011. - № 6. - С. 108-110.

4. Даньшина А.В. Особенности вагинального микробиоценоза при воспалениях репродуктивного тракта женщин / А.В. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Е.П. Тарабрина, А.С. Нестеров // Естественные и технические науки - Москва, 2012. - № 2. - С. 106-109.

5. Даньшина А.В. Экологическая характеристика микробоценоза репродуктивного тракта женщин [Электронный ресурс] / А.В. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Современные проблемы науки и образования - Москва, 2012. - №2. - Электронный журнал -- Режим доступа: http://www.science-education.ru/102

Публикации в прочих изданиях:

6. Мясникова (Даньшина) А.В. Особенности состава вагинальной микробиоты при урогенитальных инфекциях / И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, М.А. Орлина, А.В. Мясникова // Материалы научной конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии - 2009» - Санкт-Петербург, 2009.

7. Мясникова (Даньшина) А.В. Видовой состав вагинальной микробиоты при урогенитальных патологиях / И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.А. Кузнецова, А.В. Мясникова // Материалы III Всероссийской конференции с международным участием: Медико-физиологические проблемы экологии человека (22-25 сентября 2009 г). - Ульяновск. - 2009. - С. 222-223

8. Мясникова (Даньшина) А.В. Антибиотикорезистентность возбудителя урогенитального уреаплазмоза / М.А. Орлина, И.С. Немова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, А.В. Мясникова // Современные наукоемкие технологии. - Москва, 2010. - № 8. - С. 139.

9. Мясникова (Даньшина) А.В. Традиционный метод экологической оценки микробиоценоза при кольпите / А.В. Мясникова, Н.И, Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Материалы Всероссийской научно-методической конференции «Инновации и традиции науки образования» - Сыктывкар, 2010. - С. 12-14.

10. Мясникова (Даньшина) А.В. Характеристика микробиоты влагалища при воспалительных заболеваниях внутренних половых органов / А.В. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, Т.И. Волгина // Успехи современного естествознания. - Москва, 2010. - № 5. - С. 66.

11. Мясникова (Даньшина) А.В. Роль микроорганизмов в структуре воспалительных заболеваний урогенитального тракта у женщин / А.В. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Материалы III Всероссийской научно-практической (заочной) конференции «Естественные науки и современность: проблемы и перспективы исследований» - Москва, 2010. - С. 84-86.

12. Мясникова (Даньшина) А.В. Микрофлора влагалища как индикатор репродуктивного здоровья женщин / А.В. Мясникова, И.С. Немова, М.А. Орлина // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Высшее сестринское образование в системе российского здравоохранения» - Ульяновск, 15-16 декабря 2010. - С. 121-122.

13. Мясникова (Даньшина) А.В. Микробный пейзаж влагалища при кольпите /А.В. Мясникова, И.С. Немова, К.С. Кузнецова // Медицинский академический журнал - Москва, 2010. - Т. 10, № 5. - С. 88.

14. Мясникова (Даньшина) А.В. Антибиотикорезистентность микрофлоры влагалища при вульвовагините / А.В. Мясникова, К.В. Мясников // Вестник Российского государственного медицинского университета. - Москва, 2011. - Специальный выпуск № 1. - С. 184-185.

15. Мясникова (Даньшина) А.В. Дисбактериоз влагалища у больных вульвовагинитом / А.В. Мясникова, К.В. Мясников, К.С. Кузнецова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - Москва, 2011. - Специальный выпуск № 1. - С. 185.

16. Мясникова (Даньшина) А.В. Микробоценоз влагалища при аднексите / А.В. Мясникова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Международный журнал экспериментального образования. - Москва, 2011. - № 7. - С. 42.

17. Мясникова (Даньшина) А.В. Микробиоценоз репродуктивного тракта женщин при воспалительных заболеваниях / М.А. Орлина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова, А.В. Мясникова // Практические рекомендации. - Ульяновск, 2011. - 22 с.

18. Даньшина А.В. Экологическая характеристика микробоценоза вагинального и цервикального биотопов репродуктивной системы женщин / А.В. Даньшина, Н.И. Потатуркина-Нестерова, И.С. Немова // Практические рекомендации. - Ульяновск, 2012. - 16 с.

Размещено на Allbest.ru

...