Клинико-молекулярно-генетический анализ наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа

Разработанная методика проведения молекулярно-генетического анализа НМСНI может быть использована для подтверждающей, дифференциальной, пресимптоматической и пренатальной диагностики.

Использование разработанного алгоритма молекулярно-генетического обследования российских больных и внедрение новых методов и протоколов поможет сделать проведение диагностики НМСНI более эффективным, быстрым и менее дорогостоящим.

Положения, выносимые на защиту

1. На долю НМСНIA, обусловленной мутациями в гене РМР22, приходится 60% всех случаев НМСНI. 9% всех случаев НМСНI составляет НМСНIB (мутации в гене Р0), 20% - НМСНIX (мутации в гене GJB1). Определен спектр мутаций генов PMP22, GJB1, Р0 и распределение мутаций по доменам белка. Показана необходимость исследования не только кодирующей, но и некодирующей последовательности гена GJB1. Мутаций генов EGR2, NEFL и LITAF в выборке российских больных с НМСНI не обнаружено.

2. На долю НМСНI с аутосомно-рецессивным типом наследования приходится 1,8% всех случаев с НМСНI, в том числе 0,9%, обусловленных частой мутацией гена GDAP1, и 0,9%, обусловленных частыми мутациями генов SH3TC2 и FIG4. Разработана эффективная система диагностики методом MLPA частых мутаций генов FGD4, FIG4, NDRG1 и SH3TC2, ответственных за НМСН с аутосомно-рецессивным типом наследования.

3. В группах больных с НМСНI и мутациями генов PMP22, GJB1 и гена Р0 при анализе частот встречаемости основных неврологических симптомов выявлены статистически достоверные различия.

4. Разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования больных НМСН 1 типа, определяющий последовательность анализа генов PMP22, GJB1, MPZ, GDAP1 и часто встречающихся мутаций генов, ответственных за АР миелинопатии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференции European Human Genetics Conference 2010, на конкурсе молодых ученых в МГНЦ РАМН в 2009, на конференциях European Human Genetics Conference 2007, 2008, 2009.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично выполнил всю экспериментальную работу, участвовал в консультировании пациентов с НМСН I типа. Автором разработан алгоритм клинико-молекулярно-генетического обследования пациентов с НМСН I типа. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по клинико-молекулярно-генетическому анализу наследственной моторно-сенсорной нейропатии I типа были внедрены в практику медико-генетического консультирования при МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 125 источников, из них 6 отечественных и 119 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 225 пробандов из неродственных семей с НМСН I (101 семейный и 124 изолированных случаев), проживающих на территории РФ. Рассматриваемая выборка больных на 95% представлена русскими. Диагноз "НМСН I" всем больным был поставлен на основании диагностических критериев, утвержденных на 53-eм Международном Семинаре Европейского Нейромышечного Центра (DeJonghe et al. 1998), основными из которых были следующие: 1) медленно прогрессирующая симметричная мышечная слабость и атрофия дистальной части преимущественно нижних конечностей; 2) деформации стоп по типу полых; 3) снижение или утрата сухожильных рефлексов; 4) поверхностные гипостезии в дистальных отделах конечностей; 5) сниженные значения СПИ по двигательным и чувствительным нервам (значения для двигательных волокон срединного нерва < 38 м/с). Все пациенты были обследованы в МГНЦ РАМН или МГК г. Воронежа.

Для статистического анализа сходства клинической манифестации групп пациентов с различными типами НМСН дополнительно были использованы клинические и электронейромиографические данные 26 семей с НМСНIХ и 18 семей с НМСНIВ, не вошедших в исследование.

Контрольная выборка была взята из банка лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН. Ее составили 120 здоровых неродственных человек, проживающих на территории различных регионов РФ.

Во всех случаях у пациентов получено письменное информированное согласие о проведении исследований.

Выделение геномной ДНК проводили с помощью набора DNA Prep 100 Diatom ^TM из образцов периферической крови.

Исследование генов PMP22, GJB1, MPZ (P0), LITAF, EGR2, NEFL и GDAP1 проводили с помощью прямого автоматического секвенирования кодирующих областей генов, включая области экзон-интронных соединений. Амплификацию необходимых фрагментов геномной ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) Все фрагменты были секвенированы с обеих цепей ДНК с использованием Big Dye Terminator's v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) и генетического анализатора ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems), анализ результатов секвенирования проводили с помощью программы Chromas.

При исследовании количества копий гена РМР22 использовали метод количественной мультиплексной лигазной реакции (MLPA). Последовательность проб для реакции выбиралась на основе нуклеотидных последовательностей анализируемых фрагментов ДНК, имеющихся в базе данных GeneBank. Математический обсчет результатов количественной ПЦР проводился с помощью программы CoffalyserV8, представленной в свободном доступе на сайте MRC-Holland (www.mlpa.com).

Для детекции частых мутаций в генах FIG4 и SH3TC2, а также двух частых мутаций, встречающихся у цыган, в генах NDRG1 и SH3TC2 при демиелинизирующих нейропатиях с аутосомно-рецессивным типом наследования был использован метод MLPA. Этот метод значительно дешевле, проще и быстрее, чем прямое автоматическое секвенирование.

Оценку сцепления локуса заболевания с геномными маркерами проводили на основании статистического анализа сегрегации заболевания в семье с аллелями полиморфных маркеров, используя метод максимального правдоподобия (Ott, 1991). Амплификацию фрагментов проводили в стандартных объеме и составе реакционной смеси. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении. Двухлокусный анализ сцепления осуществлялся с помощью программы MLINK, входящей в пакет программ "LINKAGE", версия 5.1 (RockfellerUniversity, URL=http://linkage.rockefeller.edu).

Статистический анализ сходства клинической манифестации групп пациентов с различными типами НМСН осуществлялся с помощью методики, основу которой составляет построение для каждой из групп в пространстве клинических симптомов и признаков доверительных шаров, позволяющих количественно выразить степень вариабельности клинического фенотипа у пациентов с различными типами НМСН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетический анализ НМСН 1 типа с доминантным типом наследования

При исследовании гена РМР22 мутации были выявлены в 135 семьях, что составляет 60% всех случаев НМСНI в РФ (табл.1):

наиболее частая при НМСНI131

Размещено на http://www.allbest.ru/

мутации - дупликации в области короткого плеча хромосомы 17 (17р11.2-р.12) - была выявлена в 130 семьях, что составило 57,8%;

в результате секвенирования последовательности гена РМР22131

Размещено на http://www.allbest.ru/

в одной семье выявлена мутация c.440T>G (Leu147Arg) в гетерозиготном состоянии, что составляет 0,4% всех случаев НМСНI.

на долю частичных делеций/дупликаций гена РМР22 пришлось 1,8% (4 се131

Размещено на http://www.allbest.ru/

мьи).

Таблица 1. Спектр мутаций гена РМР22 у российских больных.

В 90 семьях, у которых не было выявлено мутаций в гене РМР22, и данные анализа родословных не противоречили Х-сцепленному типу наследования, был проведен поиск мутаций в гене GJB1. В результате исследования были выявлены 33 различные мутации, включая 13 ранее не описанных, гена GJB1 в 46 семьях. Это составило 20% всех семей с НМСН 1 типа. Проведен анализ спектра и частот встречаемости различных типов мутаций в гене GJB1 (табл.2).

Показано, что мутации гена GJB1 являются второй по частоте (после дупликации гена PMP22) причиной развития НМСНI и обнаруживаются у 20% больных.

Показано наличие в гене GJB1 «горячих» точек мутаций (табл.3).

Таблица 2. Спектр мутаций гена GJB1 у российских больных.

Таблица 3. «Горячие» точки мутаций гена GJB1.

В 44 семьях, причину болезни в которых не удалось установить после исследования генов PMP22 и GJB1, был проведен поиск мутаций в гене MPZ. В ходе проведенного исследования в 21 семье выявлен 21 аллельный вариант, в т.ч. 6 ранее не описанных, НМСН 1В типа, что составило 9% всех семей с НМСН 1 типа (табл.4).

Таблица 4. Спектр мутаций гена MPZ у российских больных.

Показано, что мутации гена MPZ являются третьей по частоте (после дупликации гена PMP22 и мутаций гена GJB) причиной развития НМСН и обнаруживаются у 9% больных.

В 44 семьях, причину болезни в которых не удалось установить, был проведен поиск мутаций в генах LITAF, EGR2 и NEFL, ответственных за НМСН1C, НМСН1D, и НМСН1F типа соответственно. Исследование мутации в этих генах полностью исчерпывает весь список известных на сегодняшний день генетических вариантов АД миелинопатий. Ни в одной семье мутаций в данных генах выявлено не было. При сравнении данных о частотах встречаемости различных генетических вариантов НМСНI, полученных нами, с мировыми (табл. 5) видно, что значимых различий не наблюдается.

Таблица 5. Суммарные молекулярно-генетические данные по НМСНI с доминантным типом наследования

Частоты НМСН1Х и НМСН1В соответствуют верхним границам таковых в различных популяциях, в связи с чем, частота НМСН 1А типа несколько ниже, чем в большинстве европейских популяциях.

Молекулярно-генетический анализ миелинопатий с АР типом наследования

После исследования выборки на все описанные на данный момент АД гены, мутации в которых приводят к фенотипу НМСНI, причина заболевания установлена в 202 семьях (95 семейных случаев и 107 изолированных), что составляет 90%. В 23 семьях (7 семейных случаев и 16 изолированных) мутаций обнаружено не было. Предполагается, что среди изолированных случаев, мутаций в которых выявлено не было, могут быть АР случаи. Поэтому следующим этапом настоящего исследования был поиск мутаций в гене GDAP1, ответственном за НМСН4А. Показано, что на долю мутаций в этом гене приходится около 25% всех случаев миелинопатий с аутосомно-рецессивным типом наследования.

В результате исследования кодирующей последовательности гена GDAP1 мутация Leu239Phe выявлена в двух изолированных случаях на трех хромасомах: у одного больного в гомозиготном состоянии, у второго - гетерозиготном состоянии, что соответствует 0,9% всех проанализированных случаев миелинопатий.

Диагностика АР состояний до настоящего времени была затруднена вследствие отсутствия коммерческих тест-систем для всех форм АР миелинопатий и вследствие отсутствия достаточного количества материала для исследования. Поэтому были разработаны две MLPA-системы для детекции мутаций, часто встречающихся по данным литературы в различных популяциях.

Система 1 включала две частые мутации генов SH3TC2 (Arg1109X) и NDRG1 (Arg148X), описанные у болгарских цыган (Рис.1А). Система 2 включала две мутации гена SH3TC2 (Arg658Cys и Arg954X) и мутацию Ile41Thr гена FIG4 (Рис.1Б).

Кроме того, в кодоне 298 гена FGD4 описано две различные замены, поэтому было принято решение о секвенировании экзона 7 у российских больных с миелинопатиями с неустановленной причиной заболевания.

В результате исследования 14 семей, в которых не была установлена причина болезни и исключен АД тип наследования, выявлено по одной мутации в гетерозиготном состоянии в двух семьях: мутация Ile41Thr гена FIG4 и мутация Arg658Cys гена SH3TC2, что соответствует 0,9% всех случаев НМСНI.

Таким образом, в результате проведенного исследования причина НМСН 1 типа выявлена в 91,5% случаев. Около 90% всех случаев составляют 1А и 1В с АД типом наследования и 1Х тип с Х-сцепленным доминантным типом, обусловленные мутациями в генах PMP22, MPZ и GJB1, соответственно, на долю миелинопатий с АР типом наследования приходится 1,8%.

Рис. 1. Системы для детекции повторяющихся мутаций в генах, ответственных за развитие НМСНI с аутосомно-рецессивным типом наследования.

Анализ сцепления в двух больших семьях с НМСНI

В результате исследования всех известных генов, приводящих к НМСНI с доминантным типом наследования, гена GDAP1 и частых мутаций генов SH3TC2, FIG4, FGD4 и NDRG1, ответственных за миелинопатии с АР типом наследования, без выявленной причины заболевания остались 19 семей: 7 с АД типом и 12 изолированных.

Среди семей с АД типом наследования в нашей выборке без определенной причины заболевания есть две большие семьи из Самары (семья 194) и Владимира (семья 985). Х-сцепленный тип наследования в данных семьях исключен генеалогически.

Для анализа сцепления с известными аутосомно-доминантными локусами НМСН использованы высокополиморфные микросателлитные маркеры, тесно сцепленные с локусами НМСН1А, НМСН1В, НМСН1С, НМСН1D и НМСН1Е. За область исключения принята прилежащая к исследуемому маркеру область, внутри которой значение Lod-балла было меньше или равно -2.

Для локусов НМСН1В, НМСН1С и НМСН1F в семье 194 получены результаты, не исключающие сцепление заболевания с ними (табл. 6).

Для всех известных АД локусов НМСН в семье 985 получены результаты, исключающие сцепление заболевания с любым из них (табл. 7). Это позволило сделать вывод, что заболевание в данной семье не сцеплено с известными АД локусами НМСН 1 типа, и, таким образом, представляет собой новый генетический вариант демиелинизурующей формы наследственной моторно-сенсорной нейропатии. Данная семья пригодна для дальнейшего полногеномного картирования, что, вероятно, позволит обнаружить новый локус заболевания.

Таблица 6. Исключение сцепления локуса НМСНI в семье 194 с известными АД локусами НМСН I

Таблица 7. Исключение сцепления локуса НМСНI в семье 985 с известными АД локусами НМСН I

Статистический анализ сходства клинической картины групп пациентов с различными типами НМСНI

С целью выявления особенностей клинических характеристик отдельных генетических вариантов НМСН 1 типа, нами проведен статистический анализ, направленный на выявление различий в частотах встречаемости основных клинических признаков в четырех группах больных, состоящих из пациентов, как вошедших в исследуемую выборку, так и обследованных ранее.

Группа НМСН1А - 68 больных с дупликацией 17р11.2-р12 гена РМР22

131

Размещено на http://www.allbest.ru/

Группа НМСН1В - 39 больных с мутациями в гене MPZ131

Размещено на http://www.allbest.ru/

Группа НМСН1Х - 69 больных с мутациями в гене GJB131

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Группа НМСН0 - 14 больных с НМСН 1 типа без выявленных мутаций.

Для наглядного представления близости клинической манифестации исследу131

Размещено на http://www.allbest.ru/

емых групп НМСН использовалась методика построение для каждой из групп в пространстве клинических симптомов и признаков доверительных шаров, позволяющих количественно выразить степень вариабельности клинического фенотипа у пациентов с различными типами НМСН (рис. 2).

Рис. 2. Фенотипические различия между исследуемыми типами НМСН.

Как следует из рис. 2, рассматриваемые типы НМСН демонстрируют достаточно значительное перекрывание областей, характеризующих вариабельность клинического фенотипа образующих их пациентов. Это обстоятельство указывает на близость клинической манифестации исследуемых типов НМСН, если сопоставлять их по комплексу клинических симптомов и признаков. Однако, для каждого из типов НМСН можно выделить фрагменты областей, не перекрываемых областями, соответствующими другим типам НМСН. Это обстоятельство указывает на наличие отдельных симптомов и признаков, обладающих некоторыми дифференцирующими свойствами.

С целью выделения этих наиболее информативных симптомов и признаков было проведено попарное сопоставление частот встречаемости признаков в отдельных группах. В табл. 8 проведено попарное сравнение пациентов с НМСН0, НМСН1А, НМСН1В и НМСН1Х между собой. Результаты сопоставления представлены величинами значимостей (р). Жирным шрифтом с подчеркиванием в таблицах выделены признаки, достоверно разичающиеся в сравниваемых группах.

Таблица 8. Сопоставление частот (%) встречаемости признаков среди пациентов с НМСН0, НМСН1А, НМСН1В и НМСН1Х

Таким образом, в результате проведенных исследований значимых отличий в клинических проявлениях между НМСН1А, НМСН1Х и НМСН0 не выявлено. Однако при сопоставлении клинических симптомов НМСН1В выявлен ряд существенных отличий в тяжести клинического течения по сравнению с НМСН1А/НМСН1Х/НМСН0.

Показано, что для НМСН 1В типа более характерен ранний дебют заболевания (до 5 летнего возраста), а также большая выраженность и генерализация процесса. Это проявляется в повышении частоты встречаемости таких признаков как гипотрофия мышц голеней, мозжечковая атаксия, нарушение проприоцептивной чувствительности в ногах и руках, интенционный тремор кистей. Достоверно чаще у больных этой группы обнаруживалась поверхностная гипостезия стоп и кистей. Это связано с тем, что у больных с НМСН 1А, 1Х типа и НМСН0 отмечалась выраженная вариабельность расстройств чувствительности. Так у 16% больных с НМСН 1А, 1Х типов и НМСН0 отмечалась гиперестезия стоп, а у 7% гиперестезия кистей, которые были характерны на начальных стадиях патологического процесса, и свидетельствовали о раздражении задних рогов спинного мозга. Гиперестезия стоп отмечена нами только у 2,5.% больных с НМСН 1В типа. Кроме того, у больных с НМСН1А, 1Х типами и НМСН0 достоверно чаще отмечалась деформация стоп по типу стопы Фридрейха, в то время как у больных с НМСН 1В типа отмечались другие типы деформации стоп или их не было вовсе. Наряду с этим, показаны значимые различия в частоте встречаемости асимметрии поражения у больных с НМСН 1В типа и у больных с НМСН1А, 1Х типов и НМСН0. Этот признак обнаружен более чем у 17% больных с НМСН 1В типа и только у 1,5% больных с НМСН 1А и 1Х типами. Известно, что асимметрия поражения не характерна для наследственных нервно-мышечных заболеваний, в связи с чем, требовалось проведение дифференциальной диагностики между наследственным характером поражения и нейропатиями экзогенной и эндогенной природы. В целом можно отметить, что проведенный анализ показал наличие более тяжелой степени тяжести заболевания у больных с НМСН 1В типа.

Анализ различий между исследуемыми группами по значениям СПИ был использован непараметрический критерий Краскела-Уоллиса. Таким образом, рис. 3 отражает соотношение средних значений СПИ в исследуемых группах.

Рис. 3. Средние значения СПИ для различных типов НМСН

Таким образом, видим, что:

НМСН0 и НМСН1А не обнаруживают существенных различий по значениям СПИ (соответствующие доверительные интервалы перекрыва131

Размещено на http://www.allbest.ru/

ются).

для НМСН1Х характерно существенное превышение средних значе131

Размещено на http://www.allbest.ru/

ний СПИ по сравнению со всеми другими типами.

НМСН1В характеризуется наименьшими средними значениями СПИ по сравнению с другими типами НМСН.

131

Размещено на http://www.allbest.ru/

Достоверность этого вывода подтверждается оценкой различий между исследуемыми группами НМСН на основе Критерия Краскела-Уоллиса. Результаты представлены в табл. 9.

Таблица 9. Анализ различий между исследуемыми группами пациентов по средним значениям СПИ

Алгоритмы диагностики различных типов НМСНI

На основании результатов клинико-молекулярно-генетического анализа, проведенного нами в группе российских больных с НМСНI, разработан алгоритм их диагностики с использованием молекулярно-генетических методов. Важным этапом медико-генетического консультирования семей, отягощенных НМСН, является выявление генетического варианта с использованием молекулярно-генетических методов. Идентификация генетического варианта необходима для решения ряда проблем, основными из которых являются: определение генетического статуса родственников пробанда, определение риска рождения у них больного ребенка и планирование способов дородовой диагностики. Однако существование генетической гетерогенности и значительного сходства клинических проявлений НМСН создают значительные трудности при проведении такой диагностики с использованием дорогостоящих методов ДНК анализа. Это обусловливает необходимость создания алгоритма идентификации генетического варианта НМСН, который позволит сократить временные и материальные затраты на проведение диагностического этапа и повысит его эффективность. В основу такого алгоритма могут быть положены различия в частоте встречаемости различных вариантов НМСН, возрасте начала, типах наследования, показателях СПИ по срединному нерву и особенностях клинических проявлений и течения заболевания

Таким образом, для планирования алгоритма ДНК диагностики с целью выявления генетического варианта врачу-генетику необходимо: 1) провести генеалогический анализ; 2) определить возраст манифестации заболевания; 3) получить показатели СПИ по срединному нерву; 4) получить результаты неврологического осмотра. Диагностический алгоритм для определения типа НМСНI, адаптированный для российских пациентов, представлен на рис. 4.

Рис. 4. Диагностический алгоритм НМСНI у российских больных

При выявлении у пробанда скоростей проведения импульса ниже 38 м/c необходимо в первую очередь исследовать мутации генов, продуктами которых являются белки миелиновой оболочки нерва.

В семьях с аутосомно-доминантным типом наследования и при наличии единственного больного в семье, важным признаком, позволяющим спланировать последовательность исследования мутаций, является СПИ по срединному нерву. При её резком снижении (<15м/с) и наличии характерных клинических признаков:

Возраст дебюта до 5 лет

Гипостезия стоп и кистей

131

Размещено на http://www.allbest....