Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Влияние паразитических простейших на изменение биоэкологических свойств участников микробоценоза кишечника

03.00.16 - экология

03.00.07 - микробиология

кандидата биологических наук

Курзин Александр Валерьевич

Ульяновск, 2009

Работа выполнена на кафедре общей и клинической фармакологии с курсом микробиологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Чураков Борис Петрович

доктор медицинских наук, профессор Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каменек Валерий Михайлович

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Мордовский Государственный университет им. Н.П. Огарева

Защита диссертации состоится «____» _____________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет» по адресу: ул. Набережная реки Свияги, 106, корпус 1, ауд. 703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, с авторефератом - на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г.Ульяновск, ул. Л.Толстого, д.42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований

Автореферат разослан «___» ______________ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент С.В. Пантелеев

Основная характеристика работы

Актуальность проблемы. Человек и окружающая среда представляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия между макро- и микроорганизмами, строго адаптированными друг к другу (Бондаренко В.М., 2007).

Полагают, что микробы-симбионты, формирующие микроэкологические системы организма, определяют стабильность нормальной микрофлоры человека и принимают самое непосредственное участие в регуляции процессов, происходящих в организме человека.

Качественное и количественное соотношение популяций микробов в отдельных органах и системах, является чрезвычайно чувствительным индикатором состояния организма человека. Система популяций микроорганизмов нормальной микробиоты представляет собой эволюционно созданный «биологический барьер» макроорганизма, позволяющий ему существовать в нашей биосфере.

Нарушение нормальной микрофлоры кишечника характеризуется исчезновением или снижением числа облигатных ее представителей, с одной стороны, и увеличением популяционного уровня условно-патогенных микробов (энтеробактерий, стафилококков, грибов рода Candida и др.), отсутствующих или встречающихся в ничтожных количествах в норме - с другой. В итоге такие дисбиозные микробные ассоциации не в состоянии выполнять защитные и физиологические функции в кишечнике, которые они осуществляют в условиях нормоценоза. Нарушения микробоценоза кишечника может возникать при воздействии самых различных факторов экзогенной и эндогенной природы.

Одной из причин, способствующих развитию нарушений микробного равновесия в кишечнике могут являться паразитарные инвазии. В России ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных различными паразитозами, а по мнению Главного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко (2002), этот показатель составляет 20 млн. Одним из наиболее распространенных возбудителей кишечных протозоозов является простейшее Blastocystis hominis.

Данный паразитоз длительное время не привлекал внимания специалистов, однако в последние годы было убедительно показано участие данных паразитических простейших в развитии различных патологий человека (Stensvold et al. 2009).

Находясь в кишечнике, бластоцисты участвуют в формировании микробоценоза данного биотопа. Нарушая баланс микроорганизмов, данные возбудители способствуют более полной реализации патогенного потенциала транзиторной микробиоты, особенно при образовании ими протозойно - бактериальных ассоциаций.

Одними из чрезвычайно распространенных представителей условно-патогенной микробиоты кишечника являются бактерии рода Proteus, роль которых в формировании микробоценоза кишечника остается недостаточно изученной. Имеются факты, свидетельствующие о способности микроорганизмов этого рода изменять свои биологические свойства при взаимодействии с другими представителями микробиоты, формирующей микробный пейзаж кишечника. Однако до сих пор эти аспекты взаимодействия микроорганизмов в микробоценозе кишечника остаются мало изученными.

Цель исследования. Изучить изменение биоэкологических свойств компонентов микробоценоза кишечника под действием паразитических простейших B. hominis.

Задачи:

1. Изучить видовой состав и экологические отношения в микробоценозе кишечника в норме.

2. Изучить влияние паразитических простейших на изменение межмикробных отношений в составе микробоценоза.

3. Выявить изменения биологических свойств участников микробоценоза кишечника на примере P. mirabilis.

Научная новизна работы. Впервые изучено влияние паразитического простейшего B. hominis на изменение биологических свойств отдельных представителей микробоценоза кишечника на примере бактерий P. mirabilis.

Показано значительное усиление вирулентных свойств данных бактерий в результате взаимодействия с паразитическими простейшими В. hominis in vivo и in vitro, что является проявлением повышения агрессии микроорганизмов в отношении макроорганизма.

Взаимодействие бактерий P. mirabilis с паразитическими простейшими В. hominis в бактериально-протозойных ассоциациях позволяет протеям наиболее полно проявить свой патогенный потенциал, что выражается в значительном усилении летального эффекта этих бактерий при заражении мышей. микробоценоз кишечник паразитический межмикробный

Установлено влияние бластоцист на экологические характеристики микробоценоза кишечника макроорганизма. Анализ ценотипа кишечника показал, что его изменения проявляются на уровне экосистемы и имеют последовательный характер.

Изучены изменения во взаимодействии представителей различных родов бактерий, формирующих микробоценоз кишечника при развитии протозойной инвазии.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют представления о характере протозойно - бактериальных взаимодействий, углубляют знания об особенностях патологического действия B. hominis и изменениях патогенного потенциала бактерий, формирующих микробные сообщества макроорганизма. В результате взаимодействия с паразитическими простейшими бактериальная составляющая микробоценоза кишечника значительно изменяет свои вирулентные свойства, оказывая патологическое действие на макроорганизм.

В связи с высокой степенью инвазированности населения различными кишечными паразитами, в том числе B. hominis, при образовании бактериально - протозойных ассоциаций, следует учитывать изменения патогенных свойств бактерий, формирующих нормальный микробоценоз кишечника, и возможность возникновения эндогенной инфекции в результате изменения патогенного потенциала представителей условно патогенной микробиоты.

Выраженные изменения вирулентных свойств бактерий P. mirabilis при их взаимодействии с паразитическими простейшими B. hominis диктуют необходимость учета фактора протозойной инвазии при рассмотрении роли данных микроорганизмов в рамках микробоценоза кишечника, это предполагает необходимость внедрения паразитологических исследований в работу практических лабораторий.

По материалам диссертации опубликованы практические рекомендации «Особенности диагностики инфекций, вызванных представителями рода Proteus» (2009) и «Дисбиоз кишечника и методы его диагностики» (2009).

Результаты исследования используются в работе клинико-бактериологической лаборатории ОККВД (г. Ульяновск), городской клинической детской больницы №1 (г. Ульяновск).

Данные, полученные в результате исследования, позволяют совершенствовать учебный процесс по курсу микробиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Проявления кишечного бластоцистоза и нарушения микробоценоза кишечника зависят от степени выраженности патогенности бластоцист.

2. Структурная перестройка микробоценоза кишечника при бластоцистной инвазии сопровождается нарушением количественных и качественных показателей микробного сообщества кишечника.

3. Бластоцистная инвазия вызывает изменения культуральных, биохимических и вирулентных свойств бактерий P. mirabilis.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на на 15-й ежегодной научно-практической конференции «Труды молодых ученых Ульяновского государственного университета» (Ульяновск, 2005); 1-й конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Ульяновск, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, одна из них в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 2 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка используемой литературы. Диссертация изложена на 115 страницах. Список литературы содержит 284 наименований, в том числе 132 зарубежных. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 21 рисунками.

Содержание работы

Глава 1 содержит обзор отечественной и зарубежной литературы по теме работы.

Раздел 1.1. посвящен рассмотрению микробоценоза кишечника и его характеристикам. В данном разделе указаны основные причины, приводящие к развитию нарушений нормального состава микробиоты кишечника и негативное воздействие данных нарушений на макроорганизм.

Раздел 1.2. посвящен роли паразитических простейших B. hominis и их роли в патогенезе человека и животных. В данном разделе анализируется многогранность проявлений патогенного потенциала паразитических простейших и их влияние на изменения состава кишечного микробоценоза.

В разделе 1.3. рассмотрены факторы вирулентности представителя транзиторной микрофлоры P. mirabilis и факторы, способствующие изменениям его патогенности. Изучены основные работы, посвященные способности данных бактерий образовывать ассоциации с другими микроорганизмами и изменять свойства при образовании подобных ассоциаций.

Глава 2 Материалы и методы исследований. Изучение микробоценоза кишечника и воспроизведение кишечного бластоцистоза проводили на нелинейных лабораторных мышах массой 23,1+2,2 г, которых содержали в условиях постоянного температурного режима (20^о-25^оС) и стабильной освещённости. Животные получали полноценное питание. Перед проведением экспериментов и опытные, и контрольные группы находились в карантине.

Кишечный бластоцистоз воспроизводили по модифицированной методике К.Т.Moe (1997) (Патент на изобретение №2224465, от февраля 2004г.). Культуры B.hominis были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии. Выявление бластоцист проводили микроскопическим и культуральным методами. Микроскопию нативных или окрашенных мазков производили после формалин эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли (Al-Braiken 2008). Размеры бластоцист определяли при помощи окуляр-микрометра. Для культивирования простейших B.hominis использовали среды Павловой, Zierdt, Джонсона и Suresh.

В ходе исследований у экспериментальных животных проводили изучение микробиоты кишечника. Культуры, выросшие на питательных средах, подвергли групповой, родовой и видовой идентификации.

Таблица 1. Среды, использованные при изучении кишечной микробиоты

№	Среда	Микроорганизмы	Условия культивирования
1.	Эндо, висмут-сульфит агар	Эшерихии, другие энтеробактерии	24 ч, аэробное, +370 С
2.	Блаурокка	Бифидобактерии	3-4 сут, анаэробное, +370 С
3.	МРС-4	Лактобациллы	4 сут, анаэробное, +370 С
4.	ЖСА	Стафилококки	48 ч, аэробное, +370С
5.	5% кровяной агар, Калины	Стрептококки, энтерококки	48 ч, аэробное, +370С
6.	5% кровяной агар	Гемолитические штаммы	24 ч, аэробное, +370С
7.	Вильсона-Блера	Анаэробы	2 сут, анаэробное, +370С
8.	Сабуро	Дрожжеподобные грибы	1-е сут, +370 С, 2-5 сут. +220 С, аэробное

Видовую идентификацию микроорганизмов проводили с использованием определителя Берги (1997). Учет результатов проводили согласно приказа № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях» и приказа Минздрава России от 09.06.2003 №231 «Об утверждении отраслевого стандарта «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004 -2003)»

Работа выполнена на базе:

1. Бактериологической лаборатории городской больницы №1 г. Ульяновска (зав. лабораторией -Т.И. Волгина ).

2. Центра общего пользования УлГУ.

Количество микроорганизмов подсчитывали по формуле: для плотных сред , для жидких сред , где Х - количество микроорганизмов каждого вида (КОЕ/г), n - количество выросших колоний, k - разведение, из которого произведен посев с обратным знаком степени.

Результаты исследований сопоставляли с данными нормального состава биотопа. При этом исходили из следующих критериев:

1) значительного (на несколько порядков) снижения численности основных для данного биотопа видов или вариантов.

2) значительного (на несколько порядков) увеличения численности популяций видов, которые в нормальном биоценозе встречаются в небольших количествах.

3) появления в микрофлоре большого количества атипичных штаммов основных видов.

Экологический анализ микробоценоза проводили путем определения индекса контагиозности (Mehraj, 2008), индекса значимости (Mariam et al., 2008), видового разнообразия сообществ микроорганизмов (Sirima et al., 2008).

Характер пространственного распределения экологических групп в биотопе изучали с помощью индекса контагиозности по формуле: UK = , где UK - индекс контагиозности; S - выборочная дисперсия; X - среднеарифметическая плотность.

Индекс значимости экологических групп микробиоценоза рассчитывали по формуле:

V =

где V - индекс значимости; g - сумма встречаемости видов данной группы; n - число описанных пробных площадок; m - среднее число видов на пробной площадке; z - число видов в данной группе.

Видовое разнообразие сообществ микроорганизмов, населяющих различные биотопы, определяли по формуле: d = , где d - видовое разнообразие; S - количество видов; N - общая плотность бактерий.

Для определения доли участия разных видов в структуре биоценоза использовали показатель постоянства С (Helmy et al., 2008), его вычисляли по формуле:

C =

где С - показатель постоянства; р - число выборок, содержащих изучаемый объект; Р - общее число взятых образцов.

Таблица 2. Объем проведенных исследований

№	Наименование проведенного исследования	Количество исследований
1	Получение культур простейших B. hominis	589
2	Выделение культур бактерий P. mirabilis	418
3	Световая микроскопия препаратов	2366
4	Приготовление препаратов для электронной микроскопии	50
5	Электронная микроскопия препаратов бактерий и простейших	42
6	Видовая идентификация микрорганизмов	842
7	Определение сахаролитической активности бактерий P. mirabilis	316
8	Определений культуральных свойств протеев	452
9	Определение гемолитической активности протеев	224
10	Тесты адгезивной активности	158
11	Внутрибрюшинное заражение мышей	263
12	Воспроизведение кишечного бластоцистоза	249

Все полученные данные подвергались статистической обработке с определением коэффициента достоверности Стьюдента. Результаты считались достоверными при p<0,05. Также производилось определение коэффициента корреляции. Для обработка данных использовался пакет Microsoft Office 2003.

Глава 3 состоит из 4 разделов и включает в себя изложение собственных результатов, полученных в ходе исследования.

В разделе 3.1. изложено состояние бактериальной эндофлоры кишечника у мышей, до начала эксперимента. Проведенные исследования выявили: клостридии у 7,1% животных в количестве 0,20,06 lg КОЕ/г, представителей рода Klebsiella в 24,3% случаев, их количество составило 1,07±0,04 lg КОЕ/г, протеев - у 27,1% мышей в количестве 3,02±0,1 lg КОЕ/г.

Результаты исследования микробного пейзажа у животных показали, что в их испражнениях преобладали бесспоровые облигатные анаэробы - бактероиды (10,10,12 lg КОЕ/г) и бифидобактерии (6,40,13 lg КОЕ/г).

Количество лактобактерий было значительно меньше и не превышало 5,30,18 lg КОЕ/г. Кишечные палочки были обнаружены во всех пробах испражнений у животных в количестве 7,40,16 lg КОЕ/г.

В зависимости от полученного значения показателя постоянства, все виды подразделили на постоянные (доминирующие), которые присутствовали более чем в 50% образцов; добавочные, выявляемые в 25-50% проб и случайные, обнаруженные в < 25% образцов.

Таблица 3. Структура кишечного микробиоценоза мышей до начала эксперимента

№	Микроорганизмы	Показатель постоянства
Доминирующие виды	%
1	Bifidobacterium spp.	100
2	Escherichia coli	100
3	Bacteroides spp.	100
Добавочные виды
1	Klebsiella spp.	24
2	Proteus spp.	27
Случайные (транзиторные виды)
1	Clostridium spp.	7,1

Таким образом, ясно видна главенствующая роль представителей родов Bifidobacterium, Escherichiа и Bacteroides в составе микробиоты кишечника.

В разделе 3.2. описаны особенности течения экспериментальной бластоцистной инвазии и ее проявления у мышей. Процесс развития бластоцистной инвазии был разделен на три стадии:

1 - начальная (от момента заражения до 5 суток)

2 - разгара заболевания (с 6 по 15 сутки)

3 - выздоровления (ремиссии) (с 16 по 28 сутки)

Во время 1-ой стадии у животных отмечалось появление первых признаков заболевания: изменение характера шерстяного покрова, вялость, снижение аппетита, появление жидкого стула у некоторых животных.

2-я стадия характеризовалась выраженными проявлениями протозойной инвазии: жидкий стул в тяжелых случаях с примесью слизи и крови, животные слабо реагировали на внешние раздражители.

В течение 3-ей стадии происходило постепенное выздоровление животных с обратным развитием всех признаков заболевания.

У зараженных мышей развивалась острая бластоцистная инвазия, однако степень ее проявления варьировала. У 57,5% животных наблюдали выраженные признаки заболевания: изменение характера шерстяного покрова, вялость, снижение аппетита, жидкий стул, в тяжелых случаях с примесью слизи и крови, слабая реакция на внешние раздражители (1-я группа).

У животных 2-й группы (35,7%) развивался менее выраженный процесс, кровь и слизь в фекалиях не обнаруживались, отмечалась нормальная реакция на внешние раздражители, однако фиксировалась вялость, жидкий стул, снижение аппетита.

У животных 3-й группы (4,2%) признаков заболевания не выявлено.

В разделе 3.3. изложены данные о количественных и качественных изменениях видового состава микробоценоза кишечника у мышей с экспериментальным бластоцистозом. Инвазия сопровождалась значительными изменениями микробоценоза кишечника, происходило нарушение баланса межвидовых отношений, проявлявшееся наиболее значительно у животных первой группы. У них, начиная со 2-3 суток эксперимента, наблюдалось значительное снижение численности представителей индигенной микробиоты: у бактерий рода Bifidobacterium до 1,54±0,25 lg КОЕ/г (в контроле 6,4±0,13 lg КОЕ/г; p<0,05), у рода Escherichia до 1,03±0,19 lg КОЕ/г (в контроле 7,40,16 lg КОЕ/г; p<0,05). Одновременно наблюдалось увеличение количества клебсиелл от 1,07±0,04 lg КОЕ/г (первые сутки) до 4,22±0,75 lg КОЕ/г (двенадцатые сутки). Содержание эшерихий с нормальной ферментативной активностью и лактозонегативных кишечных палочек составило 7,960,12 lg КОЕ/г (p < 0,05) и lg 2,610,34 КОЕ/г (p < 0,05) соответственно. Наряду с этим характерным микроорганизмом для микробного пейзажа кишечника обследованных больных являлась кишечная палочка с гемолитическими свойствами, обнаруженная в количестве lg 2,320,35 КОЕ/г (рис. 1).

Рис. 1. Соотношение штаммов кишечной палочки с различной ферментативной активностью

У животных второй группы выявлены менее выраженные изменения качественного и количественного состава микробоценоза кишечника. Количество таких представителей индигенной микробиоты, как Bifidobacterium, изменялось до 3,45±0,32 lg КОЕ/г (в контроле 6,4±0,13 lg КОЕ/г; p<0,05), рода Escherichia до 2,01±0,1 lg КОЕ/г (в контроле 7,40,16 lg КОЕ/г.). Также наблюдалось некоторое увеличение количества представителей транзиторной микробиоты кишечника: клебсиелл - до 2,27±0,17 lg КОЕ/г (в контроле 1,56±0,03 lg КОЕ/г; p<0,05),

У представителей третьей группы экспериментальных животных (без признаков бластоцистоза) достоверных изменений в составе микробиоты кишечника не выявлено, в составе микробоценоза доминировали представители родов Bifidobacterium, Escherichiа и Bacteroides.

Таблица 4. Микробиота кишечника при развитии бластоцистоза на 2-3 сутки эксперимента

Микроорганизмы	Количественное содержание микробиоты Lg KOE/г (Мm)
	1 группа	2 группа	Контроль
Bifidobacterium spp.	1,54±0,25*	3,45±0,32*	6,4±0,13
Lactobacillus spp.	7,870,11*	8,70,3*	13,9±0,26
Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью (типичные)	7,960,12*	8,30,21*	7,40,16
Escherichia coli гемолитические	1,03±0,19*	0,450,08*	Не обнаружен
Escherichia coli лактозонегативные	2,320,35	2,270,24	1,50,08
Klebsiella spp.	4,22±0,75*	3,17±0,51*	1,03±0,01
Staphylococcus aureus	1,470,24	0,350,03	Не обнаружен
Дрожжеподобные грибы р. Candida	2,260,29*	2,260,29*	1,00,03

Примечание: различия с контролем достоверны - * р < 0,05.

В разделе 3.4. описаны изменения основных экологических характеристик, описывающих микробоценоз кишечника.

Исходя из полученных нами данных на начальной стадии развития заболевания распределение микроорганизмов в пространстве носило равномерный характер, что подтверждалось значениями индекса контагиозности меньше единицы.

Так, индекс контагиозности бифидобактерий равен 0,45±0,01, в то время как в группе сравнения этот показатель приближается к единице (0,75±0,08), что свидетельствует о случайном распределении бактерий в микробиоценозе. Для таких представителей облигатной микрофлоры, как лактобактерии и бактероиды, было характерно равномерное распределение в пространстве (0,7±0,1 и 0,87±0,3 соответственно), в то время как в контрольной группе данный показатель составил 0,9±0,1 и 0,075±0,12 соответственно (p<0,01).

Индекс контагиозности бактерий рода Escherichia составил 0,31±0,3, в контроле - 0,95±0,4. Наряду с этим, выявлялось повышение индекса контагиозности для бактерий условно-патогенной группы (рисунок 9 б ). Так, для бактерий рода Enterococcus он составил 0,64±0,7 (0,48±0,1 в контрольной группе), Staphylococcus - 0,55±0,03 (0,39±0,17), Candida - 1,34±0,2 (0,43±0,25). Показатель распределения бактерий рода Proteus составил 1,1±0,1, в то время как в группе здоровых людей этот показатель не превышал 0,75±0,1 (p<0,05).

Максимальное снижение индекса контагиозности отмечалось у кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью (разница между контрольными и экспериментальными значениями составила 31,1%). Выявлено также значительное снижение индекса контагиозности у бифидобактерий (на 15,1 %).

Напротив, у представителей условно-патогенной группы, таких как Staphylococcus и Enterococcus отмечено значительное увеличение индекса контагиозности (на 103,7% и 60% соответственно). У представителей рода Proteus изменение индекса контагиозности составило 29,4%.

У представителей рода Proteus изменение индекса контагиозности составило 29,4%, что объясняется прогрессирующим нарушением экологических связей в микробоценозе кишечника (рис. 2).



Рис. 2. Изменение контагиозности облигатной (а) и условно-патогенной микробиоты (б)

Анализ результатов изменения флористической значимости микроорганизмов кишечника, свидетельствует о том, что значимость облигатной микробиоты достоверно снижалась в 1-й период развития бластоцистной инвазии (табл. 5).

Таблица 5. Показатели индекса флористической значимости видов биоценоза кишечника

Микроорганизмы	Индекс флористической значимости (%)
	Начальная стадия	Разгар заболевания	контроль
Bifidobacterium spp.	10,1	9,8*	12,1
Lactobacillus spp.	7,95	7,9	8,2
Escherichia spp.	8,15	8,0	8,7
Bacteroides spp.	10,31	10,1	11,0
Enterococcus spp.	7,6*	6,7	6,2
Proteus spp.	4,45	4,9	4,0
Klebsiella spp.	3,73	4,2*	3,5
Staphylococcus spp.	4,99	4,97	4,83
Clostridium spp.	6,35	6,36	6,30
Грибы Candida spp.	4,7	4,5	4,2

* - достоверность p<0,05

Напротив, для представителей условно-патогенной биоты микропейзажа кишечника в начальной стадии было характерно некоторое увеличение флористической значимости. Так, для энтерококков данный показатель увеличился в начальной стадии инвазивного процесса до значения 7,6%, в то время как в контрольной группе он составлял 6,2% (р<0,05). У клебсиелл увеличение флористической значимости было незначительным 3,73% - (3,5% в контроле)

У клостридий данный показатель практически не изменился (6,35% против 6,3% в контрольной группе). Не было также обнаружено достоверного изменения флористической значимости бактерий рода Proteus (p>0,05).

Анализ ценотипа кишечника показал, что его изменения имеют последовательный характер и проявляются на уровне экосистемы. Это выражалось в появлении среди доминантных видов представителей транзиторной биоты, а роды Klebsiella и Proteus из группы случайной микробиоты перешли в группу добавочных видов.

В разгар заболевания в микробоценозе кишечника выявлено достоверное уменьшение контагиозности представителей нормальной микробиоты, что приводило к освобождению экологических ниш, успешно занимаемых транзиторной флорой. Данное соотношение свидетельствует о неравномерности участия в горизонтальной структуре микробопейзажа кишечника основных симбионтов и представителей транзиторной флоры. Выявленные изменения подтверждались изменениями индекса флористической значимости и показателем видового разнообразия (табл. 6).

Таблица 6. Показатели индекса флористической значимости видов биоценоза кишечника в первую стадию

Микроорганизмы	Индекс флористической значимости (%)
	Начальная стадия	Разгар заболевания	контроль
Bifidobacterium	10,1	9,8*	12,1
Lactobacillus	7,95	7,9	8,2
Escherichia	8,15	8,0	8,7
Bacteroides	10,31	10,1	11,0
Enterococcus	7,6*	6,7	6,2
Proteus	4,45	4,9	4,0
Klebsiella	3,73	4,2*	3,5
Staphylococcus	4,99	4,97	4,83
Clostridium	6,35	6,36	6,30
Грибы Candida	4,7	4,5	4,2

* - достоверность p<0,05

Напротив, для представителей условно-патогенной биоты микропейзажа кишечника в начальной стадии было характерно некоторое увеличение флористической значимости. Так, для энтерококков данный показатель увеличился в начальной стадии инвазивного процесса до значения 7,6%, в то время как в контрольной группе он составлял 6,2% (р<0,05). У клебсиелл увеличение флористической значимости было незначительным 3,73% (3,5% в контроле). )

У клостридий данный показатель практически не изменился (6,35% против 6,3% в контрольной группе). Не было также обнаружено достоверного изменения флористической значимости бактерий рода Proteus (p>0,05).

Флористическая значимость представителей транзиторной микрофлоры в свою очередь демонстрировала стойкий рост. Так, для представителей рода Proteus изменение данного показателя составило более 0,4 % (от 4,45% на начальной стадии до 4,9% на стадии разгара заболевания, в контроле 4,0%)

Результаты исследований выявили корреляционную зависимость между численностью представителей группы эшерихий и протеев, коэффициент корелляции составил 0,47 у контрольной группы и 0,45 у экспериментальной группы на момент начала эксперимента. В дальнейшем у рассматриваемых групп микроорганизмов наблюдалось стойкое снижение значения коэффициента корелляции до уровня 0,09, что свидетельствует о нарушении межмикробных отношений в кишечнике.

Глава 4. Изменение биологических свойств P. mirabilis при взаимодействии с простейшими B. hominis.

Учитывая высокую значимость P. mirabilis в развитии нарушений микробоценоза кишечника, а также патологии человека и животных было проведено изучение биологических свойств данных бактерий при влиянии простейших B. hominis на микробное сообщество кишечника.

С этой целью определяли морфологические, тинкториальные и культуральные свойства протеев, а также их ферментативную и гемолитическую активность, наличие факторов, отвечающих за адгезию (MR/P фимбрии) и способность к развитию летального эффекта в опытах in vivo.

Проведенные исследования выявили значительные изменения проявлений свойств патогенной активности протеев при их взаимодействии с простейшими B. hominis.

В разделе 4.1. были изучены морфологические, тинкториальные и культуральные свойства протеев, выявлено усиление вирулентной активности P.mirabilis, что проявлялось в приобретении способности всех штаммов протея к образованию феномена «роящегося» роста, тогда как до совместного культивирования «роение» фиксировалось у 87% штаммов.

В разделе 4.2. показано, что все штаммы протеев после взаимодействия с бластоцистами in vitro и in vivo изменяли ферментативную активность, в частности все изученные штаммы P.mirabilis приобретали способность к ферментации маннозы.

В разделе 4.3. изложены данные по изменению гемолитической активности протеев. Все группы штаммов P. mirabilis, использовавшиеся в эксперименте, демонстрировали достоверное увеличение коэффициента гемолитической активности. Бактерии, выделенные из фекального материала экспериментальных животных до их заражения простейшими, обладали гемолитической активностью в 53% случаев. После взаимодействия с бластоцистами in vitro 67% штаммов протеев проявляли гемолитическую активность, что также подтверждает усиление вирулентных свойств данных микроорганизмов (рис. 2).

Рис. 2.Увеличение уровня коэффициента гемолитической активности

Раздел 4.4. посвящен изменению адгезивных свойств представителей P. mirabilis при их сокультивировании с паразитическими простейшими. По результатам взаимодействия бактерий с простейшими in vivo и in vitro был выявлен значительный рост числа штаммов, обладающих маннозорезистентными фимбриями, что свидетельствует об усилении адгезивной активности протеев. Так, после совместного культивирования бактерий, полученных от здоровых животных, с простейшими количество штаммов, вызывающих агглютинацию эритроцитов, выросло с 26,7% до 63,3%. Более чем в два раза выросла доля штаммов, обладающих маннозорезистентными фимбриями (таблица 6).

Таблица 6. Изменение способности протеев вызывать агглютинацию эритроцитов человека

	1 группа	2 группа	3 группа	4 группа	Контроль
Количество штаммов способных к агглютинации эритроцитов (абс/%)	8/ 26,7	19/ 63,3	22/ 73,3	26/ 86,7	10/ 33,3
Из них устойчивы к действию маннозы	3	12	14	14	4

Значительных изменений адгезивных свойств бактерий, выделенных у мышей с бластоцистной инвазией, после их сокультивирования in vitro с простейшими B. hominis не выявлено.

В разделе 4.5. представлены результаты теста определения вирулентности методом внутрибрюшинного заражения мышей, обнаружено увеличение вирулентности штаммов протея взаимодействовавших с простейшими. Наибольшее увеличение вирулентных свойств отмечалось после взаимодействия протеев с бластоцистами in vivo в кишечнике экспериментальных животных.

Вирулентность штаммов, выделенных у здоровых и инвазированных животных, была не одинакова, она варьировала в пределах от 3,2±0,1 до 4,2±0,2, часть изолятов не обладали вирулентными свойствами.

Полученные данные позволяют сделать вывод об усилении вирулентности бактерий рода Proteus при взаимодействии их с паразитическими простейшими B. hominis.

Выводы

1. Нормоценоз кишечника представлен 8 видами микрорганизмов, из которых 3 относятся к группе облигатной кишечной микробиоты, 2 к добавочным видам и 1 к транзиторным, условно патогенным микроорганизмам. В доминирующую группу входили представители родов Bifidobacterium, Escherichiа и Bacteroides.

2. Паразитические простейшие B. hominis вызывают острую протозойную инвазию, сопровождающуюся значительными изменениями количественных и качественных показателей микробиоты, что проявлялось снижением флористической значимости основных симбионтов, и увеличением частоты встречаемости транзиторной биоты.

3. В результате взаимодействия паразитических простейших B. hominis с бактериями P. mirabilis у последних изменяются культуральные, биохимические свойства и уровень вирулентности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Курзин А.В. Мониторинг микробиоты кишечника при экспериментальной ишемии на фоне бластоцистной инвазии / А.М Лазарев, Ю.Ю. Красноперова, А.В. Курзин // Проблемы региональной экологии. №2 , 2009. - №2 - С. 74 - 78.

2. Курзин А.В. Влияние простейших Blastocystis hominis на формирование ишемии толстого кишечника / А.М. Лазарев, Ю.Ю. Красноперова, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Е.А. Зубкова // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 2. - С. 30 - 31.

3. Курзин А.В. Микробная экология кишечника при экспериментальной ишемии, отягащенной бластоцистной инвазией / А.М. Лазарев, Н.И. Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, А.В. Курзин // Материалы всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». - Ульяновск: УлГУ, 2007. - С. 145 - 146.

4. Курзин А.В. Изменение состава микрофлоры кишечника при дисбиозе, вызванном инвазией простейшими Blastocystis hominis / А.В. Курзин, Ю.Ю. Красноперова, Н.С. Глебова, А.М. Лазарев // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск: УлГУ, 2007. - С. 51 - 52.

5. Курзин А.В. Морфологические изменения и микробиоценоз толстой кишки при экспериментальной ишемии на фоне бластоцистоза / А.М. Лазарев, Ю.Ю. Красноперова, А.В. Курзин, Е.А. Крючков // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск: УлГУ, 2007. - С. 152 - 154.

6. Курзин А.В. Влияние микробиоты толстой кишки на формирование и тяжесть течения экспериментальной ишемии, ассоциированной с бластоцистозом / А.М. Лазарев, Н.И. Потатуркина -Нестерова, Ю.Ю. Красноперова, А.В. Курзин, Е.А Зубкова, М.П. Свитайло // Естествознание и гуманизм. - Томск, 2007. - Том 4, № 1 - С. 116.

7. Курзин А.В. Оценка нарушений межвидового взаимодействия микроценоза кишечника при экспериментальном бластоцистозе / А.В. Курзин, А.М. Лазарев // Проблемы и перспективы современной науки. - Томск, 2008. - Вып. 1 - С. 81 - 82.

8. Курзин А.В. Особенности микробиоты тонкого отдела кишечника при экспериментальной ишемии на фоне инвазии Blastocystis hominis / А.М. Лазарев, Н.И. Потатуркина-нестерова, Ю.Ю. Красноперова, А.В. Курзин // Проблемы и перспективы современной науки. - Томск, 2008. - Вып. 1 - С. 82 - 83.

9. Курзин А.В. Частота встречаемости бластоцистной инвазии при хронической экземе / Н.С. Глебова, А.В. Курзин // Материалы I конференции молодых ученых медико-биологическая секции Поволжской ассоциации государственных университетов. - Ульяновск: УлГУ, 2008 - С. 28-29.

Размещено на Allbest.ru

...