Распространенность стафилококков в популяции лиц, живущих в крупном промышленном городе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Распространенность стафилококков в популяции лиц, живущих в крупном промышленном городе

03.02.03 - Микробиология

На правах рукописи

Жадченко Юлия Викторовна

Волгоград 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Крамарь Олег Григорьевич

Официальные оппоненты: Главный научный сотрудник ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора РФ доктор медицинских наук, профессор Анатолий Васильевич Липницкий

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России Галина Николаевна Усатова

Ведущая организация ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится 26 марта 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 при ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства России по адресу:400131, г. Волгоград, пл.Павших борцов, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства России (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов,1)

Автореферат разослан «____» _________ 2013 года.

Ученый секретарь - Марина Дмитриевна Ковалева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Взаимодействие организма человека с микроорганизмами, заселяющими его открытые экосистемы - сложный и многофакторный процесс. В результате действия внешних и внутренних факторов качественный и количественный состав микробиоценозов постоянно меняется (О.В. Бухарин, 1990, 2003; В.М. Бондаренко, 2004, 2007; Б.А. Шендеров, 2002, 2003).

Общеизвестно, что в состав микрофлоры человека, кроме нормальных симбионтов, входят транзиторные виды, относящиеся к категории условно-патогенных, при этом при определенных условиях они могут переходить в разряд причинных, вызывая инфекционные процессы в различных органах и тканях (Д.Г. Дерябин, 2000, 2005; А.А. Воробьев с соавт., 2001, 2006; L. Brunetti et al., 2007). Среди последних значительная роль принадлежит стафилококкам, наиболее патогенными представителями которых считаются S.aureus. Будучи достаточно хорошо изученными, они привлекают внимание микробиологов и врачей всех специальностей (M.C. Enright et al., 2002; P. Moriellon et al., 2005; J.A. Rihn et al., 2005; T. Ferry et al., 2005).

Микроорганизмам рода Staphylococcus принадлежит одно из первых мест в возникновении внутрибольничных инфекций (В.Б Белобородов, С.Д. Митрохин С.Д., 2003, 2004). В настоящее время во всем мире отмечается усложнение эпидемиологической ситуации в связи с широким распространением в стационарах и во внебольничной среде клинических изолятов S.aureus, устойчивых к метициллину (MRSA) (Т.И. Афанасьева, 1998; Г.Г. Онищенко, 2002; А.А. Никулин, А.В. Дехнич, 2010.

По роду своей деятельности медицинский персонал вынужден длительно находится в условиях госпитальной среды, подвергаясь воздействию факторов лечебного и диагностического процесса, что может приводить к дестабилизации иммунологической реактивности и изменению нормальной микрофлоры (В.Г. Акимкин, 2003, 2005; О.В. Ковалишена, 2005; Н.В. Медуницин, 2007; Ю.В. Захарова, 2008). Это, в свою очередь, способствует его колонизации условно-патогенными видами, в том числе S.aureus, нередко с измененными биологическими свойствами (Е.П. Ковалева, 2000, 2002; С.В. Сидоренко, 2001, 2002; Л.С. Страчунский с соавт., 2002, 2005) .

Вместе с тем, изменение микробиоценозов, их качественная и количественная характеристика у работников стационаров изучены не достаточно. В этой связи совершенствование методов эпидемиологического и микробиологического мониторинга, направленных на выявление эпидемически значимых штаммов и условий, способствующих их биологической сукцессии, приобретает все более актуальное значение (В.И. Покровский с соавт., 2000; Л.П. Зуева с соавт., 2004, 2005, 2006; В.К. Ильин, 2005).

Исследования в области взаимодействия организма человека с населяющими его бактериями могут способствовать выработке новые подходов к диагностике и профилактике многих, в том числе внутрибольничных, заболеваний.

Цель исследования: разработка и обоснование критериев оценки значимости стафилококков в формировании нормальной микробной флоры здорового человека и медицинских работников; выработка рекомендаций, направленных на снижение колонизации эпидемически значимыми штаммами.

Задачи исследования

1. Изучить нормальную микрофлору открытых биотопов и установить параметры колонизации стафилококками кожи, слизистых оболочек носовых ходов и кишечника здоровых людей.

2. Выявить закономерности колонизации организма человека S.aureus в зависимости от состояния микробиоты хозяина и внешних экологических факторов, установить биотопы, имеющие высокое эпидемиологическое значение.

3. Выяснить особенности формирования микрофлоры у лиц, сотрудников соматических стационаров. Оценить влияние факторов госпитальной среды на микрофлору открытых биотопов и на уровень колонизации S.aureus в зависимости от тяжести микроэкологических нарушений.

4. Изучить фенотипические особенности золотистых стафилококков у различных категорий носителей.

5. На основании полученных данных разработать тактику профилактических мероприятий и практические рекомендации, направленные на коррекцию микрофлоры.

Научная новизна работы.

Впервые с применением критериев общего экологического подхода к оценке биоценоза определена значимость стафилококков в формировании микрофлоры открытых биотопов тела (слизистых оболочек носовых ходов, кожи и кишечника) здоровых людей, проживающих в неравнозначной экологической обстановке.

Показано, что золотистые стафилококки входят в состав резидентной микрофлоры здорового человека, колонизируя открытые биотопы в составе ассоциаций с аутохтонными симбиотическими микроорганизмами, при этом последние являются факторами, ограничивающими численность S.aureus.

Установлено, что слизистая оболочка носовых ходов здоровых людей является оптимальной экологической нишей для S.aureus. Стафилококки, колонизирующие данный биотоп, обладают выраженной гетерогенностью по биологическим признакам, которая обеспечивает им убиквитарность и интенсивные миграционные процессы.

Определены причинно-следственные связи между частотой колонизации золотистыми стафилококками и выраженностью дисбиоценотических нарушений у лиц, подверженных комплексному влиянию факторов больничной среды. Показано, что у медицинского персонала происходит формирование дисбактериоза открытых биотопов с уменьшением доминирования нормальных симбионтов и увеличением такового для условно-патогенных бактерий, в том числе S.aureus.

Показано, что влияние госпитальных факторов проявляется в обеднении фенотипического и генетического разнообразия S.aureus, что позволяет говорить о формировании высокоэпидемичных госпитальных штаммов. Золотистые стафилококки, входящие в состав микробиоты данной категории носителей, обладают высокой резистентность к антимикробным препаратам, что требует дифференцированного подхода при коррекции микроэкологических нарушений.

Научно-практическая значимость работы.

Автором обоснована концептуальная модель, ориентированная на мониторинг микроэкологических нарушений у различных категорий носителей золотистых стафилококков. Полученные результаты позволят оптимизировать эпидемиологический мониторинг за эпидемически значимыми штаммами стафилококков в соматических стационарах и рекомендовать систему мероприятий, позволяющих минимизировать дисбактериозы открытых биотопов у данной категории лиц.

Положения, выносимые на защиту

1. Золотистые стафилококки входят в состав нормальной резидентной микрофлоры здорового человека, колонизируя открытые биотопы тела. Симбиотические виды, входящие в состав бактериальных ассоциаций кожи и слизистых оболочек, являются факторами, ограничивающими численность S.aureus.

2. Эпидемиологически значимым биотопом для S.aureus является слизистая оболочка носовых ходов. Штаммы, колонизирующие данный биотоп, обладают выраженной гетерогенностью популяции по биологическим признакам, которая обеспечивает им убиквитарность и интенсивные миграционные процессы.

3. Заселению стафилококками открытых биотопов предшествует нарушение качественного и количественного состава микрофлоры. Интенсивность колонизации золотистыми стафилококками имеет высокую корреляцию со степенью выраженности дибиотических нарушений. С максимальной интенсивностью данные процессы протекают у лиц, проживающих в экологически неблагоприятной обстановке.

4. Медицинские работники составляют группу высокого риска по развитию множественных сочетанных микроэкологических нарушений. Микробный статус открытых биотопов медицинского персонала соматического стационара подвергается воздействию разнообразных факторов госпитальной среды, что проявляется снижением значимости нормальных симбионтов и увеличением доминирования условно-патогенных бактерий, высокой частотой микроэкологических нарушений и высоким уровнем бактерионосительства S.aureus.

5. Микрофлора слизистых оболочек, кожи, кишечника медицинского персонала характеризуется преобладанием антибиотикорезистентных и высоко вирулентных S.aureus, что позволяет говорить о колонизации штаммами высокой эпидемической значимости.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008); 55-ой юбилейной региональной конференции профессорско-преподавательского коллектива Волгоградского государственного медицинского университета «Современная инновационная медицина-населению Волгоградской области» (Волгоград, 2008); 67-ой, 69-ой, 70-ой научно-практических конференциях молодых ученых и студентов (Волгоград, 2009, 2011, 2012); научно-практической конференции, посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2009).

Внедрение в практику

Полученные результаты включены в материалы лекций и практических занятий на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической микробиологии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ. По результатам работы издано пособие для студентов «Микроэкология пищеварительного тракта. Дисбактериоз, методы лечения, профилактика» (Волгоград, 2011).

Результаты исследования внедрены и используются в работе Управления Роспотребнадзора по Волгоградской области, ГБУЗ «Волгоградская детская клиническая инфекционная больница», легли в основу рационализаторского предложения «Способ санации бактерионосителей Staphylococcus aureus» (удостоверение ВолгГМУ №18 от 29.06.2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендуемых Перечнем ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 195 источник, в том числе 118 отечественных и 77 зарубежных авторов. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 17 таблицами.

микробный стафилококк колонизация эпидемический

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии с курсом клинической микробиологии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Для решения поставленных задач комплексному клинико-лабораторному обследованию был подвергнут 101 практически здоровый человек в возрасте от 18 до 25 лет, проживающих в районах города Волгограда с неравнозначной экологической нагрузкой. Критериями включения в группу служило отсутствие хронических и острых заболеваний на момент обследования, длительность проживания в городе не менее 10 лет, отрицание использования антибактериальных препаратов и пробиотиков в течение последних 3-х лет. Средний возраст составил 21,7±3,2 года. В дальнейшем эти наблюдаемые были разделены на группы в зависимости от экологии места проживания, при этом северная модельная территория была представлена Краснооктябрьским, центральная - Центральным, южная - Кировским и Красноармейским административными районами. Таким образом, было составлено 3 группы наблюдения: первая (I) - 33 человека, проживающих в южной части города, вторая (II) - 31 из северного и третья (III) - 37 из центрального условно-чистого модельного района (контрольная группа сравнения).

Изучение влияния факторов госпитальной среды на состав микрофлоры открытых биотопов и уровня носительства стафилококков осуществлено при обследовании 37 работников соматического стационара. При включении в группу использовали следующие критерии отбора: возраст от 21 до 25 лет (средний составил 23,3±2,8 года); длительность работы в стационаре не менее 3 лет; отсутствие острых и хронических заболеваний на момент обследования; отрицание использования антибактериальных препаратов в течение последнего года.

Всем наблюдаемым проводили микробиологический качественно-количественный анализ поверхностной микробной флоры кожи области локтевой ямки правой руки, слизистых оболочек нижней трети носовых ходов, кишечника.

Забор материала и исследование качественного и количественного состава микрофлоры слизистых оболочек проводили по общепринятым методикам (приказ МЗ №535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», 1985).

Для изучения микробиоценоза кожи использовали методику В.С. Крамарь (1997), при этом учитывали число первоначально выросших колоний с последующим пересчетом на 1 см2 исследуемой поверхности. При анализе учитывали 1) общую бактериальную плотность, 2) количество и видовой состав грампозитивных и грамнегативных бактерий; г) грибов рода Candida. Уровень микробной колонизации исследуемых биотопов оценивали в десятичных логарифмах от среднего количества микроорганизмов (lg КОЕ).

Количественный и видовой состав кишечной микрофлоры изучали по методике H. Haenel (1973) в модификации В.М. Коршунова с соавт., (1997). Оценку состояния биоценоза проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Отраслевом стандарте Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (Приказ МЗ РФ №231 от 9.06.2003, ОСТ 91500.11.0004-2003).

Выделение и идентификацию стафилококков осуществляли в соответствии с приказами МЗ СССР N 535 (МЗ СССР от 22.04.85 г.) и №8 (МЗ РФ от 1995 г). Исследование выделенных культур по чувствительности к антибиотикам различных групп осуществляли с применением расширенного набора дисков согласно «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2.1890-04 МЗ РФ, 2004). Метициллинустойчивые культуры (MRSA) выделяли на плотной селективной питательной среде, содержащей по методике Т.А. Афанасьевой (1998). Лизоцимную активность микроорганизмов изучали по методике, описанной В.М. Никитиным (1986). Лецитиназную активность штаммов определяли общепринятым методом на желточно-солевой среде Г.Н. Чистовича.

Из персистирующих свойств микроорганизмов изучали антилизоцимную, антикомплементарную активность с использованием методик, предложенных О.В. Бухариным с соавт. (1990) и О.В. Бухариным, Ю.А. Брудастовой и Д.Г. Дерябиным (Патент РФ №2010860). Кроме того, исследовали способность деградировать бактериальную составляющую препарата интерферон (В. Ю. Соколов, 1988).

Генетическое исследование выделенных культур осуществляли в соответствии методическими рекомендациями «Метициллинрезистентные Staphylococcus aureus - возбудители внутрибольничных инфекций: идентификация и генотипирование. Методические рекомендации» (утв. Роспотребнадзором 23.07.2006). Данный раздел работы сделан совместно и консультирован профессором, заведующим кафедрой молекулярной биологии и генетики В.А. Антоновым.

Все полученные в работе данные и результаты проведенных исследований были подвергнуты статистической обработке в стандартной прикладной программе “Exсel” - ”STATISTICА” (О.Ю. Реброва, 2002, 2006). Вычислялись следующие показатели: средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m), среднеквадратическое отклонение (). Достоверность значений средних величин определялась с использованием критерия t Стьюдента. Значимость различий относительных величин проверяли с использованием критерия 2. Наличие связи между изучаемыми признаками и явлениями устанавливали с использованием коэффициентов парной и множественной корреляции (r).

Обсуждение результатов исследования

Изучение закономерностей колонизации стафилококками здоровых людей начинали с исследования микрофлоры кожи. Анализ облигатно-аэробной поверхностной микрофлоры показал, что ее состав был достаточно разнообразным.

Стафилококки были самыми многочисленными и значимыми представителями микрофлоры кожи, обнаруживаясь у всех (100%) обследуемых и составляя 62,5% всех выделенных изолятов. В структуре микробиоценоза преобладали коагулазоотрицательные негемолитические виды - S.epidermidis и S.saprophyticus, обнаруживаемых в 65,3% и 51,5% наблюдений. Плотность колонизации данными видами составляла lg 2,59±0,33 и lg 2,52±0,61 КОЕ/см2. У 16,8% обследуемых они вегетировали на коже в виде ассоциаций, наиболее часто определялись совместно с микрококками и коринебактериями. Таким образом, эти два вида стафилококков составляли резидентную доминирующую микрофлору изучаемого биотопа.

С клинической точки зрения наибольшее значение в возникновении патологических состояний человека играют коагулазоположительные стафилококки, основным представителем данной группы бактерий является S.aureus. Полученные нами данные показали, что золотистые стафилококки составляли 7,5% всех выделенных культур, колонизируя 13 человек (12,9%), при этом их среднее содержание составило lg 2,58±0,41 КОЕ/см2, что было сопоставимо с плотностью коагулазоотрицательных видов (S.epidermidis - lg 2,59±0,33 и S.saprophyticus - lg 2,52±0,61 КОЕ/см2)(p>0,05).

Анализ характера колонизации показал, что у 4 человек (3,9%) S.aureus выделялись в монокультуре, в 1 случае (0,9%) - в виде ассоциации с бациллами, и у 3 (2,9%) - с грамнегативными энтеробактериями, преобладая в количественном отношении и показывая высокую степень обсеменения - до 1000 КОЕ/см2.

При оценке микрофлоры слизистых оболочек носовых ходов было установлено, что в ней преобладали грампозитивные представители, составляя 89,0% всех выделенных культур, тогда как грамнегативные - только 11,0%, при этом 92,0% из них были нейссериями, и только 8,0 % - энтеробактериями. Как и в микробиоценозе кожи, доминирующим родом были стафилококки, составляя 51,5% всего сообщества кокковых микроорганизмов. Доля стрептококков также была весьма значительна - 36,7%, микрококков - 11,8%. Наиболее частыми обитателями слизистых носовых ходов были эпидермальные стафилококки, колонизируя 52,5% человек. Данные микроорганизмы имели максимальные показатели обсемененности - lg 2,99±0,11 КОЕ/т.

Обращала на себя внимание высокая частота обнаружения в микрофлоре носовых ходов здоровых людей золотистых стафилококков. Они были выделены со слизистых оболочек 34 человек (33,7%). Данные бактерии показывали высокое бактериальное число - lg 2,65±0,61 КОЕ/т, однако оно было достоверно ниже, чем у S.epidermidis и негемолитических стрептококков (lg 2,99±0,11 и lg 2,94±0,33 КОЕ/т)(p<0,05).

Нам представлялось интересным изучить закономерности ассоциативного формирования микробных сообщества данного биотопа у носителей золотистых стафилококков и людей, свободных от носительства.

В процессе изучения микрофлоры слизистых носовых ходов золотистые стафилококки были обнаружены у 34 обследованных (33,7%). Изучение микробиоценоза носителей показало, что в монокультуре S.aureus обнаруживали в 11,8% наблюдений, несколько чаще - с двумя видами (23,5%). В 20,6% случаях он вегетировал в составе 4-х членной ассоциации, однако, чаще всего S.aureus выделяли в сочетании с 3 видами - 44,1% изолятов. При изучении сопутствующей флоры было установлено, что только в 20,0% случаев в ее состав входили нормальные симбионты, тогда как в 80,0% - условно-патогенные микроорганизмы - грибы, грамнегативные бактерии, гемолитические стрептококки. Так, грибы рода Кандида, определяясь суммарно у 12 человек (11,9%), в 9 случаях образовывали ассоциацию с золотистыми стафилококками. Аналогичная закономерность была установлена для гемолитических стрептококков и бацилл (68,2% изолятов равнозначно).



Рис.1. Частота выделения S.aureus со слизистых оболочек носовых ходов в ассоциациях

Учитывая данный факт, нам представлялось интересным исследовать влияние бактерий-ассоциантов на численность сообщества золотистых стафилококков, колонизирующих слизистые оболочки здоровых людей. С этой целью нами была проанализирована плотность колонизации S.aureus в зависимости от видового наполнения микробиоценоза (рис.2).

Рис. 2 Плотность колонизации слизистых оболочек носовых ходов S.aureus в зависимости от характера выделения

Полученные данные показали, что максимальные показатели обсеменения слизистых оболочек S.aureus регистрировались в случае его выделения в виде монокультуры (lg 2,98±0,17 КОЕ/т), тогда как минимальные - в 4-х членных ассоциациях (lg 2,31±0,72 КОЕ/т), при этом данные различия носили достоверный характер (p<0,05). Таким образом, было установлено, что при заселении биотопа несколькими видами-ассоциантами, последние оказывают угнетающее влияние на S.aureus, возможно за счет прямой конкуренции за адгезивные рецепторы и пищевые ресурсы.

Следующим этапом нашей работы явилось изучение микрофлора испражнений группы наблюдения. Ее анализ показал, что в кишечнике здоровых людей вегетирует весьма значительное количество микроорганизмов. Постоянными представителями биоценоза были лактобактерии (100 %), при этом у большинства обследуемых эти микробы обнаруживались в титрах 106 - 109 КОЕ/г. Так же часто в микрофлоре обнаруживались бифидобактерии (100 %), при этом средняя арифметическая величина обсемененности была весьма значительной (lg 8,220,23 КОЕ/г).

Аэробная флора толстой была представлена эшерихиями и энтеробактериями. E.coli обнаруживались у всех обследуемых (100 %) со средней арифметической величиной обсемененности равной lg 7,360,33 КОЕ/г, грибы рода Кандида - в 17,8 % и lg 4,320,26 КОЕ/г.

При анализе стафилококковой микрофлоры кишечника здоровых людей было установлено, что суммарно их выделяли у 38 обследованных (37,6%), при этом S.aureus - у 24 (23,8%), а S.epidermidis - у 22 (21,8%), при этом у 2 человек (1,9%) они вегетировали совместно. Было установлено, что у ? обследуемых содержание S.aureus в кишечнике варьировало от 105 до 106 КОЕ, у 20,8% он обнаруживался в редуцированных количествах - 104 КОЕ, и лишь у 16,7% обсемененность была высокой и превышала 107 микробных тел в 1 грамме испражнений. Средний показатель обсемененности им кишечника здоровых людей составил lg 5,380,34 КОЕ/г, что было сопоставимо с количеством других аэробных видов. Наиболее часто S.aureus вегетировал в виде монокультуры (50,0%), совместно с грибами рода Кандида его обнаруживали у 25,0% наблюдаемых, с энтеробактериями - у 16,7%, у 8,3% - совместно с эпидермальными стафилококками.

Согласно современным представлениям, нормальная микрофлора является подвижной экосистемой, чутко реагирующей на любые внешние воздействия. Высокий уровень экологической нагрузки в городе Волгограде, многопрофильность промышленных предприятий, загрязняющих атмосферный воздух химическими веществами, создают условия для формирования экологического влияния на микрофлору и могут определять региональные особенности микробиоценозов человека.

Для выполнения поставленной задачи все обследуемые были разделены на три группы в соответствии с постоянным местом жительства, при этом 33 из них проживали в южном (I), 31 в северном (II) и 37 в центральном модельных районах города Волгограда (III контрольная группа сравнения).

При исследовании микрофлоры слизистых оболочек носа были установлены некоторые различия, определяющиеся зоной наблюдения. Так биологическая значимость S.epidermidis - доминирующего симбионтов микрофлоры слизистых, была достоверно ниже в южном и северном регионе. Встречаемости данных бактерий в центре города составляла 59,6%, тогда как в южном и северном районах - 45,5 и 51,6%. Максимальная плотность колонизации эпидермальными стафилококками была установлена для жителей центральной и южной частей города - lg 3,13±0,72 и lg 3,04±0,61 КОЕ/т, тогда как на севере регистрировали минимальные показатели - lg 2,80±0,70 КОЕ/т (p<0,05). Здесь же были установлены высокие цифры выделения нейссерий и бацилл - 29,7 и 24,3%.

Негемолитические стрептококки, напротив, у жителей центрального района обнаруживали реже (29,7% против 42,4 и 48,4% в I и II группах), однако здесь они показывали максимальные показатели бактериальной обсемененности - lg 3,18±0,98, что достоверно превышало цифры в группах сравнения (lg 2,92±0,82 и lg 2,73±0,73 КОЕ/т соответственно)(p<0,05).

Что касается условно-патогенных бактерий, то высокая обсемененность слизистых оболочек грибами была диагностирована у жителей юга (15,2%, lg 2,20±0,28 КОЕ/т) и севера (12,9%, lg 1,15±0,17 КОЕ/т), достоверно превышая значения контрольной группы (8,1% и lg 1,13±0,23 КОЕ/т) (p<0,05).

Анализ колонизации золотистыми стафилококками показал, что частота выделения S.aureus увеличивалась в ряду: центр > север > юг, составляя 24,3, 32,2 и 45,5% соответственно. Величина обсемененности, напротив, была выше у жителей центра (lg 3,00±0,70 КОЕ/см2), и минимальной на севере города - lg 2,40±0,51 КОЕ/т. Выявленные изменения носили достоверный характер (p<0,05) (рис.3).

Для выявления закономерностей колонизации здоровых людей S.aureus представлялось интересным оценить частоту регистрации дисбиотических нарушений микробной флоры слизистых оболочек носовых ходов у лиц обследуемых групп. Полученные результаты показали, что в среднем нарушения микрофлоры носовых ходов регистрировались у здоровых жителей Волгограда с частотой 26,4±3,8%. Реже всего они обнаруживались среди лиц, проживающих в центре города - 21,6%, при этом тяжесть дисбактериоза была минимальной - I степени. Среди жителей северной части дисбактериоз регистрировали в 29,1%, тогда как на юге - в 30,3% наблюдений. Кроме того, у 2 человек из южной зоны (6,1%) были обнаружены значительные микроэкологические сдвиги в виде дисбактериоза II степени, не выявляемые в группах сравнения.



Рис.3. Частота выделения и плотность бактериальной колонизации S.aureus в зависимости от экологии места проживания.

При изучении индивидуальных микробиоценозов обследуемых было выяснено, что только у 5,4% наблюдаемых в центре, 6,4% на севере и 6,1% на юге золотистые стафилококки вегетировали в составе нормальной микробиоты, тогда как в подавляющем большинстве случаев они колонизировали слизистые оболочки на фоне имеющихся дисбиотических изменений в качественном и/или количественном составе микрофлоры.

Таким образом, полученные данные позволили говорить о том, что чаще всего носительство S.aureus формируется у лиц, имеющих дисмикробиоценотические нарушения. С максимальной интенсивностью данные процессы происходят у жителей экологически неблагополучных территорий, что является отражением неблагоприятного техногенного влияния на состояние общей колонизационной резистентности.

Медицинский персонал в процессе профессиональной деятельности подвергается воздействию большого числа неблагоприятных факторов госпитальной среды, которые способны изменять как иммунологическую реактивность самого макроорганизма, так и собственный микробиоценоз медицинских работников.

Для решения поставленных задач нами было проведено изучение микрофлоры трех биотопа тела 37 медицинских работников многопрофильного соматического стационара. Обследованию были подвергнуты слизистые оболочки нижней трети носовых ходов, микрофлора кишечника и кожа области локтевой ямки правой руки.

При изучении параметров микробиоценозов было установлено, что у медицинских работников регистрировали значимые нарушения в их структуре в виде замещения нормальных симбионтов условно-патогенными микроорганизмами. Этот феномен характеризовал собой дисбактериоз, регистрируемый у 67,7% наблюдаемых.

Так при исследовании микрофлоры кожи было установлено, что процент лиц с нормальным составом микрофлоры сокращался вдвое (с 75,2 до 32,4%) по сравнению с контрольной группой. Нормоценоз у лиц, не работающих в медучреждениях, был диагностирован в 75,2% наблюдений, дисбактериоз I степени регистрировали в 23,9% случаев. Только у 1 человека (0,9%) были обнаружены нарушения, характеризующие собой дисбактериоз II степени. В группе медицинских сотрудников нормальный состав кожной микрофлоры был зарегистрирован у 32,4%, Д I - у 29,7%, Д II - у 35,1% наблюдений. Особо следует отметить, что у 1 человека (2,8%) были установлены тяжелые нарушения в виде дисбактериоза III степени, в виде полного отсутствия нормальных симбионтов и обнаружения 3-х видов условно-патогенных бактерий в высоких титрах (рис.4).

Рис. 4. Состояние микрофлоры изучаемых биотопов у медицинских работников соматического стационара, %

Как следует из данных рис.4, у медицинского персонала часто устанавливали тяжелые микроэкологических нарушения в составе кишечной микрофлоры. Так Д3, не обнаруживаемый у лиц контрольной группы, был зарегистрирован в 21,7% наблюдений, Д2 - в 40,5%, Д1 - 27,0%, тогда как нормоценоз - только у 10,8% человек. Это было достоверно хуже, чем у лиц контрольной группы: нормофлора 52,5%, Д1 - 30,7%, Д2 - только у 16,8%.

Рис.5. Выраженность микроэкологических нарушений у бактерионосителей S.aureus и лиц, свободных от бактерионосительства, %

Для решения вопроса о закономерностях колонизации золотистыми стафилококками, все медицинские работники, находящиеся под нашим наблюдением, были разделены на 2 группы: лица, у которых в микробиоценозе обследуемых биотопов были обнаружены золотистые стафилококки (21 человек) и свободные от носительства люди (16 наблюдаемых). У всех была проведена оценка состояния микроценоза всех изучаемых биотопов по данным индивидуальных микробиоценограмм. Полученные результаты представлены на рис. 5.

Анализ рис.5 наглядно свидетельствует о том, что у носителей S.aureus интенсивность установленных дисбиотических сдвигов в целом была более выраженной, что проявлялось увеличением степени тяжести микроэкологических нарушений на всех исследуемых анатомических участках тела. Так ни у одного из бактерионосителей не был зарегистрирован нормоценоз на слизистых оболочках носа, тогда как у группы сравнения его определяли в 37,5% наблюдений. Напротив, у носителей в 14,4% регистрировали тяжелые нарушения в виде дисбактериоза III степени, тогда как у лиц, свободных от него, таковых установлено не было.

Аналогичные данные были получены при изучении микрофлоры кожи: нарушения были максимальны у лиц, колонизированных золотистыми стафилококками. Менее значимые различия характеризовали состояние микрофлоры кишечника, однако 43,7% человек имели минимальные нарушения в виде Д1, тогда как в группе сравнения этот показатель сдвигался в сторону дисбактериоза второй степени - 47,6%. Полученные данные свидетельствуют, что колонизации S.aureus предшествуют нарушения нормального состава микрофлоры, проявляющиеся исчезновением нормальных симбионтов и колонизацией условно-патогенными бактериями. В качестве экзогенного фактора, способствующего интенсификации данного процесса, может выступать профессиональный фактор - работа в медицинских стационарах.

Итак, проведенные исследования говорят о том, что комплексное влияние факторов среды медицинского стационара приводит к угнетению нормальной симбиотической микрофлоры с растормаживанием оппортунистической, что подтверждается увеличением частоты встречаемости и плотности колонизации условно-патогенными бактериями, в том числе S.aureus.

В этой связи представлялось интересным попытаться установить закономерности колонизации S.aureus различных биотопов тела лиц групп сравнения.

Было установлено, что у лиц, не занятых в медицине, золотистые стафилококки чаще всего обнаруживали на слизистых оболочках носовых ходов (34 обследуемых, 33,7%), реже в кишечнике (24, 23,8%) и на поверхности кожи локтевых сгибов (13, 12,9%). При этом у 13 (12,9%) человек он колонизировал одновременно все 3 изучаемые биотопа, у 7 (6,9%) - два, и у 14 (13,8%) - только один, при этом в 11 случаях (10,9%) это были носовые ходы, и в 3 (2,9%) - кишечник. Таким образом, слизистые оболочки носовых ходов являются биотопом, наиболее подверженной колонизации S.aureus.

Изучение корреляционных взаимосвязи показало наличие прямой корреляции средней силы между частотой колонизации слизистых носовых ходов и кожи (r = 0,58), носовых ходов и кишечника (r = 0,66), и высокой в паре «кишечник-поверхность кожи» (r = 0,70).

Анализ корреляционных взаимосвязей у бактерионосителей, занятых в медицинском стационаре, позволил подтвердить данное предположение. Всего S.aureus был выделен у 20 человек (54,0%), при этом анализ его расселения показал, что у 7 (18,9%) его обнаруживали только на слизистых оболочках носовых ходов, у 13,5% - было колонизировано 2 биотопа и в 21,6% случаев - три. В случае моноколонизации в 100% его находили только на слизистых оболочках носовых ходах, при обнаружении на двух биотопах - в 100% он вегетировал в носовых ходах, при этом в 4 случаях вторым биотопом был кишечник и в 1 - кожа.

Таким образом, полученные нами данные показали, что именно слизистые оболочки носовых ходов являются местом первичной колонизации S.aureus, и только потом происходит его расселение на другие биотопы тела. Это подтверждается наличием прямой сильной корреляции в обнаружении золотистых стафилококках в парах «носовые ходы» - «кишечник» ( r = 0,64) и средней в паре «носовые ходы» - «кожа» (r = 0,52).

Таким образом, резюмируя вышеизложенное, можно говорить о том, что у медицинского персонала происходит изменения качественного и количественного состава нормальных ассоциантов на всех изучаемых биотопах тела, которые предшествуют колонизации S.aureus. В качестве экзогенного фактора, способствующего интенсификации данного процесса, может выступать профессиональный фактор - работа в медицинских стационарах.

Регуляция микробного биоценоза в экологической нише обеспечивается множеством фактов. Но основным их них является феномен биологического разнообразия, особенно важный для убиквитарных бактерий, к которым относится стафилококки, чей жизненный цикл сопряжен с миграционными процессами и периодической сменой хозяина и экологических ниш. Для сохранения вида стафилококки должны постоянно приспосабливаться к существованию в конкретных условиях, определяющихся целой совокупностью факторов среды обитания. Освоение микроорганизмами колонизируемых биотопов должно сопровождаться изменением не одного признака, а набора фенотипических характеристик, т.е. их биопрофиля.

В этой связи представлялось интересным изучение экологической детерминированности фенотипической вариабельности и направленности полиморфизма S.aureus по некоторым факторам, в том числе по чувствительности к антибактериальным препаратам в зависимости от экологии ниши выделения.

Было установлено, что культуры, выделенные как у медицинских работников, так и у здоровых носителей, проявляли высокую резистентность к антибиотикам пенициллинового ряда, при этом при этом как в первой, так и во второй группе отмечается значительный процент оксациллинрезистентных штаммов (35% для медицинских работников, 33,8 для здоровых носителей).

Существенные различия в антибиотикорезистентности были зарегистрированы по отношению к макролидам. Так, если штаммы, выделенные у носителей 1-ой группы, демонстрировали устойчивость к эритромицину и клиндамицину в 43,1 и 24,6% наблюдений, то культуры, выделенные у медицинского персонала - в 53,4 и 35,0% соответственно.

Обращала на себя внимание крайне низкая чувствительность стафилококков, выделенных у медицинских работников, к амногликозиду II поколения тобрамицину. Так, если среди штаммов, выделенных у обычных носителей, резистентными к тобрамицину оказались 15,4%, то среди культур, выделенных у медицинских работников, устойчивость к данному антибиотику достигла 71,1%.

Высокую устойчивость S.aureus, выделенные в обеих группах, демонстрировали к тетрациклину и левомицетину (78,3 и 61,6% в группе медицинского персонала и 70,8 и 35,4% в группе обычных носителей), однако обращает на себя внимание тот факт, что количество штаммов, резистентных к левомицетину, в группе медицинских работников в было в два раза выше, чем у обычных носителей. Цефалоспориновый препарат I генерации цефазолин оказался малоэффективным для всех категорий, при этом высоко- и умереннорезистентными были 70,8 и 85,0% культур по группам соответственно. Напротив, препарат III генерации цефтриаксон продемонстрировал высокую антибактериальную активность как в отношении изолятов, выделенных у медицинских работников (70,0% чувствительных штаммов), так и в группе сравнения (76,9% чувствительных культур). Установлено, наибольшей активностью в отношении штаммов, выделенных как в первой, так и во второй группе, обладали линезолид и ванкомицин (98-100% культур), что позволяет рекомендовать их в качестве препаратов выбора при лечении стафилококковой инфекции.

Полученные данные свидетельствуют о том, что слизистая оболочка полости носа медицинского персонала представляет собой резервуар потенциально опасных для пациента видов стафилококков, обладающих высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам.

Нами было проведено изучение детерминированности фенотипического полиморфизма S.aureus по факторам персистенции - лизоцимной (ЛА), антилизоцимной (АЛА) и антикомплементарной активности (АКА), а также способности инактивировать бактериальную составляющую препарата интерферон (анти БСИ). Полученные данные представлены в табл.1.

Табл. 1. Распространенность и выраженность факторов персистенции стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носовых ходов здоровых людей

Исследуемый фактор персистенции	Категория носителей
	Обычный контингент	Медицинский персонал
	Частота обнаружения, %	Выраженность признака, Мm	Частота обнаружения, %	Выраженность признака, Мm
Лизоцимная активность (у.е.)	62,2	5,084,00	53,6	1,751,73
Антилизоцимная активность (мкг/мл)	45,9	1,051,13	97,6	5,021,59
Способность инактивировать бактериальную составляющую препарата интерферон (у.е.)	48,6	0,810,65	82,9	2,241,26
Антикомплементарная активность (мкг/мл)	40,5	2,563,05	82,9	6,341,61

Сравнительный анализ по изучаемым признакам выделенных культур позволил говорить о существовании ряда закономерностей, характеризующих политипичность золотистых стафилококков в зависимости от категории бактерионосителей.

Популяция стафилококков, колонизирующих обычных бактерионосителей, была очень вариабельна по возможности продукции персистентных факторов. Среди них регистрировали как штаммы с отсутствием таковых (13,5%), так и полным набором последних (8,1%). У 45,9% обнаруживалось по 1 признаку, а по 2 фактора в различных сочетаниях у 32,4% изолятов. Напротив, у стафилококков, выделенных от медицинского персонала, преобладали штаммы с полным набором изучаемых признаков - 65,9%. Только 1 изолят S.aureus обладал антилизоцимной активностью как монопризнаком, а культур с отсутствием секретируемых факторов обнаружено не было.

Таким образом, популяция стафилококков, колонизирующих медицинский персонал, характеризовалась низким биологическим разнообразием с преобладанием штаммов с высоким вирулентным потенциалом. Данное положение нашло подтверждение в сравнении индексах богатства фенотипа (БФ) и коэффициенте реализации фенотипа (КР) изучаемых групп. Количество потенциальных вариантов фенотипов на основе изучаемых признаков составляло 8. Все эти варианты были полностью реализованы в популяции S.aureus, выделенных от обычных бактерионосителей (индекс БФ - 8,0). Тогда как в группе сравнения его значения были меньше, составляя 5,0. Коэффициент реализации фенотипов, рассчитанный как отношение числа выявленных вариантов к их теоретически возможному количеству, также был выше в 1 группе (1,0), тогда как во 2 - 0,62 (рис.6).



Рис. 6. Значения коэффициентов богатства фенотипов (БФ) и реализации фенотипов (КР) популяции S.aureus в зависимости от категории бактерионосителей

Все это свидетельствовало об обеднении фенотипического разнообразия стафилококков у медицинского персонала. В организме людей, постоянно пребывающих в условиях медицинского стационара, происходит обеднение биологического разнообразия S.aureus по сравнению с «оптимальной» эконишей. Подобные изменения, с одной стороны, свидетельствуют об усилении патогенных свойств микроорганизмов, с другой, являются следствием направленной селекции клонов, более адаптированных к конкретным условиям обитания.

Таким образом, слизистые оболочки носовых ходов здоровых бактерионосителей является оптимальной эконишей для S.aureus, в которой поддерживается высокая степень их гетерогенности. Это обеспечивает высокие возможности для их транслокации в другие экологические ниши. Стафилококки, колонизирующие медицинский персонал, подвергаются действию селективных факторов, вследствие чего они модифицируют свою фенотипическую структуру, обеспечивающую им динамическое равновесие со средой обитания.

Подтверждение данного предположения было получено при изучении особенностей генетических характеристик S.aureus в зависимости от источника выделения.

При плазмидном скрининге S.aureus, внехромосомные ДНК различного размера были обнаружены в 18 из 44 тестируемых культур (40,9 %). Плазмидсодержащие штаммы золотистого стафилококка были выделены как от медицинского персонала, так и от здоровых (контрольной группы) бактерионосителей. Однако встречаемость штаммов S.aureus, содержащих плазмиды, была значительно выше среди сотрудников лечебных учреждений. При этом было показано, что стафилококки второй группы были более гетерогенны по плазмидному спектру.

Для выявления более «тонких» генетических особенностей изучаемых изолятов был использован метод RAPD. Нумерический анализ электрофореграмм, основанный на реакции амплификации с различными произвольными праймерами и UPGMA-кластеризации, позволили разделить сравниваемые 44 штамма S.aureus на 15-17 кластерных групп, состоящих из двух и более штаммов, в зависимости от уровня сходства. При суммировании результатов RAPD-типирования и формировании единой матрицы сходства с использованием всего набора праймеров все анализируемые штаммы S.aureus были сгруппированы в 24 кластерные группы. При анализе штаммов, входящих в сформированные кластерные группы, были выявлены группы идентичных как по плазмидному спектру, так и RAPD-профилю, что свидетельствовало о клональности изолятов в различных источниках выделения и циркуляции среди сотрудников стационара госпитальных штаммов S. aureus.

При изучении генотипа 15 штаммов S.aureus, выделенных от медицинского персонала стационара, было установлено, что 7 из них имели идентичный профиль амплификации независимо от используемых праймеров. Причем данные штаммы четко формировали уникальные группы, отличные от изолятов, выделенных из других источников, что свидетельствовало об их генетической гетерогенности.

При определении устойчивости к антибиотикам штаммов S.aureus, выделенных от медицинского персонала, нами установлено, что все эти штаммы были резистентны к метициллину. Причем наличие гена mecA было подтверждено в реакции амплификации со специфическими праймерами.

Учитывая, что культуры, выделенные от медицинского персонала, были идентичны по RAPD-паттернам, можно предположить о формировании в стационаре и MRSA-штаммов. Согласно современным воззрениям, высокая резистентность к химиопрепаратам может рассматриваться как фактор патогенности микроорганизмов и является маркером госпитальных штаммов.

Таким образом, выявление высокого процента изолятов золотистых стафилококков устойчивых к антибиотикам, колонизирующих сотрудников медицинских стационаров, свидетельствует о колонизации последних штаммами S.aureus повышенной эпидемической значимости.

Выводы

1. Золотистые стафилококки входят в состав резидентной микрофлоры здорового человека, колонизируя открытые биотопы в составе ассоциаций с аутохтонными симбиотическими микроорганизмами, при этом последние являются факторами, ограничивающими численность S.aureus.

2. Заселение открытых биотопов тела здоровых людей золотистыми стафилококками происходит на фоне нарушения качественного и количественного состава микробиоценозов открытых биотопов. Наибольшая интенсивность этих процессов установлена для жителей, проживающих в неблагоприятной экологической обстановке (южного модельного района), что, по-видимому, является отражением снижения общей неспецифической резистентности макроорганизма под воздействием экологического прессинга.

3. Слизистая оболочка носовых ходов здоровых людей является оптимальной экологической нишей для S.aureus. Стафилококки, колонизирующие данный биотоп, обладают выраженной гетерогенностью популяции по биологическим признакам, которая обеспечивает им убиквитарность и интенсивные миграционные процессы.

4. Микробный статус открытых биотопов медицинского персонала соматического стационара подвергается воздействию разнообразных факторов госпитальной среды, что проявляется снижением значимости нормальных симбионтов и увеличением доминирования условно-патогенных бактерий, значительной частотой микроэкологических нарушений и высоким уровнем бактерионосительства S.aureus.

5. У медицинского персонала влияние госпитальных факторов проявляется в обеднении фенотипического и генетического разнообразия S.aureus, что позволяет говорить о формировании у них высокоэпидемичных госпитальных штаммов.

6. Заселению стафилококками открытых биотопов предшествует нарушение качественного и количественного состава микрофлоры. Интенсивность колонизации золотистыми стафилококками имеет высокую корреляцию со степенью выраженности дибиотических нарушений.

7. Высокая частота выявления микроэкологических нарушений у медицинских работников диктует необходимость мониторинга состояния микрофлоры открытых биотопов. Мероприятия по снижению и предупреждению внутрибольничных инфекций, вызванных S.aureus, должны включать в себя выявление и санацию бактерионосителей, занятых в лечебном процессе, и коррекцию дисбактериозов слизистых оболочек верхних дыхательных путей и кишечника.

Практические рекомендации

1. Медицинские работники составляют группу высокого риска по развитию множественных сочетанных микроэкологических нарушений.

2. Микрофлора слизистых оболочек, кожи, кишечника медицинского персонала характеризуется высокой частотой колонизации антибиотикорезистентными и высоко вирулентными S.aureus, что позволяет говорить об их высокой эпидемической значимости.

3. Полученные данные диктуют необходимость мониторинга за микрофлорой открытых биотопов и проведения профилактических мероприятий по коррекции микроэкологических нарушений у данной категории лиц.

4. Меры снижения и предупреждения внутрибольничных инфекций должны включать в себя выявление и санацию назальных бактерионосителей S.aureus с одновременной коррекцией дисбактериоза кишечника и слизистых оболочек.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жадченко Ю.В. Фенотипические характеристики популяции S.aureus, выделенных от различных категорий носителей / Л.В. Крамарь, Ю.О. Хлынина, Н.В. Родионова // Фундаментальные исследования. - 2012. - №4 (2). - С.295-298.

2. Жадченко Ю.В. Частота и закономерности колонизации золотистыми стафилококками сотрудников соматического стационара / О.Г. Крамарь // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - № 6; URL: http://www.science-education.ru/106-7928 (дата обращения: 25.12.2012).

3. Жадченко Ю.В. Особенности формирования микробиоценозов открытых биотопов у медицинских работников под влиянием факторов госпитальной среды / О.Г. Крамарь // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 1; URL: http://www.science-education.ru/107-7956 (дата обращения: 26.12.2012).

4. Жадченко Ю.В. Распространенность S.aureus у практически здоровых людей и больных хирургических и терапевтических стационаров, молекулярно-генетическое типирование этих микроорганизмов / А.А. Покателов, В.А. Антонов, В.О. Крамарь и др. // Проблемы и перспективы современной науки: Сборник научных трудов. - Выпуск 2. - Томск, 2008. - С.32-36.

5. Жадченко Ю.В. Микроэкология кожных покровов и гнойно-воспалительных очагов пациентов хирургического стационара /О.Г. Крамарь, Е.О. Кравцова // Проблемы и перспективы современной науки: Сборник научных трудов. - Т.2,№1. - Томск, 2009. - С.28-29.

6. Жадченко Ю.В. Микроэкология пищеварительного тракта. Дисбактериоз, методы лечения, профилактика: учебное пособие для студентов под ред . О.Г. Крамарь. - Волгоград, 2011. - 29с.

7. Жадченко Ю.В. Экология стафилококков у практически здоровых людей / В.О. Крамарь, А.В. Панченко, В.А. Антонов и др. // Успехи современного естествознания. - 2011. - №5. - С.104-106.

8. Жадченко Ю.В. Микроэкология кишечника и коррекция дисбактериоза у жителей крупного промышленного города /О.Г. Крамарь, Т.Н. Климова, Ю.В. Пестов и др. // Международный журнал экспериментального образования. - 2012. - №1. - С.49-51.

Размещено на Allbest.ur

...