АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспресии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

АТФ - зависимые протеазы и шапероны как эффективные регуляторы экспресии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri

03.02.07 - Генетика

Мелькина Ольга

Москва - 2010

Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук И.В. Манухов ФГУП «ГосНИИ генетика»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.А. Хмель

Институт молекулярной генетики РАН

доктор биологических наук, профессор В.А. Лившиц

Научно-исследовательский институт

«Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»)

Ведущая организация:

Международный биотехнологический центр Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Системы регуляции экспрессии генов типа “Quorum Sensing” (QS) у бактерий определяют тесную связь процесса транскрипции с плотностью популяции, - экспрессия группы генов начинается лишь при достижении популяцией бактерий определенной (критической) концентрации. Сам термин QS был впервые введен в обиход в 1994 г Greenberg E.P. с сотр. (Fuqua W.C., Winans S.C. and Greenberg E 1994). Однако феномен типа QS был обнаружен значительно раньше (в 1970-е гг) у морских бактерий Aliivibrio (ранее Vibrio) fischeri для группы lux-генов, ответственных за биолюминесценцию клеток (Nealson & Hastings, 1979). По названию ключевых регуляторных генов lux-оперона A. fischeri luxI и luxR в последствие подобные системы относили к механизму регуляции типа “luxI-luxR” (Meighen E.A.,1991).

В настоящее время QS регуляция обнаружена у большого числа видов как грам-положительных, так и грам-отрицательных бактерий и показано, что QS системы играют ключевую роль во взаимодействии бактерий с высшими организмами, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др.

Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом - хозяином. Инфекционный процесс непосредственно связан с достижением популяцией патогенных бактерий критической плотности и соответственно с синхронным синтезом факторов вирулентности.

QS система также регулирует экспрессию генов, участвующих в формировании биопленки, которая является существенным фактором патогенности, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к антибактериальным препаратам и защитному действию иммунной системы хозяина. Поэтому использование блокаторов QS системы в настоящее время рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии.

Представляет особый интерес определить связь систем QS с основными энергозависимыми системами в клетке, а именно, с АТФ-зависимыми протеазами и шаперонами, которые осуществляют деградацию денатурированных и ошибочно синтезированных белков (протеазы) и проводят фолдинг и рефолдинг белков (шапероны).

Известно, что АТФ-зависимые протеазы и шапероны также играют важную роль в ряде регуляторных каскадов, например, при переходе клеток в стационарную фазу, при “тепловом шоке” и др. (Gottesman S., 1999; Weihart D. et al, 2003; Tomoyasu T. et al, 2001). В настоящей работе на модели lux-оперона морских бактерий A. fischeri проведено изучение роли АТФ-зависимых протеаз и шаперонов в качестве модуляторов QS системы.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску генов в хромосоме бактерий Escherichia coli, белки-продукты которых влияют на эффективность действия системы регуляции типа QS. В качестве модельной системы QS используется lux-оперон (luxRICDABEG) морских светящихся бактерий A. fischeri. Предполагалось исследовать влияние белков-шаперонов и АТФ-зависимых протеаз на активность белков-регуляторов системы QS и ферментов люцифераз, гены которых (luxAB) входят в состав lux-оперона. В работе решались следующие задачи:

1. Исследование влияния и механизма действия шаперонинов GroEL/GroES (семейство Hsp60) на фолдинг белка LuxR и его делетированных форм.

2. Исследование влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм. Проведение сравнительного анализа влияния Lon-протеазы на экспрессию генов lux-оперона A. fischeri в специально сконструированных модельных системах, в состав которых входят как плазмида с генами lux-оперона, так и плазмиды с фрагментами ДНК, кодирующими полный LuxR или его С-домен.

3. Изучение механизма защитного действия белков - шаперонов семейства Hsp100 при термоинактивации белков в клетке. Получение данных о влиянии белков - шаперонов семейства Clp на рефолдинг белков.

Научная новизна. Впервые показано, что основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шапероном GroEL, необходимого для сборки нативной структуры LuxR. Впервые показано, что при DnaK-DnaJ-GrpE-зависимом рефолдинге денатурированных белков в клетках E. coli значительное влияние на скорость и уровень рефолдинга оказывают малые шапероны IbpA и особенно IbpB, а также шаперон ClpA, принадлежащий семейству Hsp100.

Практическая значимость. Основные результаты работы могут быть использованы на практике: применение плазмиды с генами ibpAB при суперпродукции гетерологичных белков в бактериальных клетках E. coli для повышения их растворимости; использование генов, кодирующих АТФ-зависимые протеазы, для ингибирования систем QS и, как следствие, для снижения активности вирулентных генов у патогенных бактерий.

Структура работы. Диссертация изложена на 95 листах машинописного текста, включая 30 рисунков и 4 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы. Список литературы включает 120 работ отечественных и зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырех статьях и представлены на III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 г., на международной школе - конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е.Лобашова, в 2007 г., на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. Диссертационная работа была апробирована на семинаре секции «Генетика» Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 15 сентября 2010 года.

Содержание работы

У морских бактерий Aliivibrio fischeri экспрессия lux-генов регулируется системой "LuxI-LuxR", которая определяет интенсивность биолюминесценции растущих клеток в зависимости от плотности популяции ("quorum sensing"): отсутствие свечения при малых концентрациях клеток и резкое усиление свечения при достижении популяцией критической плотности. Lux-оперон A. fischeri (luxRICDABEG) состоит из гена luxR с промотором P_l, и генов luxICDABEG с промотором P_r. Гены luxI и luxR кодируют регуляторные белки LuxI и LuxR соответственно. Ацилсинтаза LuxI осуществляет синтез аутоиндуктора (АИ-1), ацильного производного лактона L-гомосерина, который играет ключевую роль в “общении” бактерий, так как свободно диффундирует через клеточные мембраны. Белок LuxR - активатор транскрипции генов luxICDABEG. Связываясь с АИ, белок LuxR приобретает способность образовывать комплекс c lux-боксом, представляющим собой инвертированный повтор из 20 п.н. в области промотора P_r, и активировать транскрипцию генов luxICDABE.

Система QS самодостаточна, т.е. она не нуждается в дополнительных факторах для своего проявления. Однако ряд данных указывает на то, что в клетке существуют белки, которые способны моделировать активность данной системы. Мы их называем внутриклеточными факторами. К ним относятся протеазы и шапероны.

Для определения влияния внутриклеточных факторов на регуляцию системы QS применялись различные методы исследования.

1. Методы исследования

Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды, а также их генетические характеристики представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

Штаммы	Характиристика	Источник
SG20250	?lacU169 araD flbB relA clpA+,	S.Gottesman (США)
SG22099	clpA::kan (остальные маркеры как у SG20250)	-//-
SG22163	malP::lacIq	-//-
SG22186	?lon rcsA::kan (остальные маркеры как у SG22163)	-//-
AB1157	F- thr-1 leuB6 proA2 his-4 argE3 thi-1 lacY1 galK2 ara-14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44	ВКПМ
AB1899	F- lonA1 (остальные маркеры как у AB1157)	ВКПМ
NK113	clpP::cat (остальные маркеры как у AB1157)	N.E.Murray (Англия)
NK114	clpX::kan (остальные маркеры как у AB1157)	-//-
SKB178	F- galE- sup gro+	ИМГ РАН
OFB111	groE673 Gly173Asp337 (остальные маркеры как у SKB178)	-//-
TG-1	thi-1 supE44 hsd?5 ?(lac-proAB) [F' traD36 proAB+ lacIq lacZ?M15]	ВКПМ
MG1655	F- ilvG reb-50 rph-1	ВКПМ
BW25113	rmB3?lacX4787 hadR5114 ?(araBAD)567 ?(rhaBAD)568 rph-1	С.В. Машко (Kelo-collection)
JW3664	ibpA::kan (остальные маркеры как у BW25113)	-//-
JW3663	ibpB::kan (остальные маркеры как у BW25113)	-//-
JW0013	dnaK::kan (остальные маркеры как у BW25113)	-//-
Плазмиды
pF1	вектор pBR322 со встроенным по BamHI-сайту полным lux-опероном А. fischeri (luxRluxICDABE);Apr	наша лаборатория
pF2	вектор pUC19 со встроенными генами luxAB А. fischeri под lac промотором; Apr	-//-
pGEX-LuxR	pGEX-KG вектор со встроенным по BamHI/EcoRI-сайтам геном luxR А. fischeri; Apr	-//-
pVFR1	вектор pDEW201 с встроенной кассетой luxCDABE Photorhabdus luminescens в качестве генов-репортеров и фрагментом ДНК А. fischeri, содержащим ген luxR под промотором Pl и регуляторную область с правым промотором Pr и lux-боксом; Apr	данная работа
рLuxR	вектор pUC19 со встроенным по BamHI/EcoRI-сайтам геном luxR А. fischeri под lac промотором; Apr	данная работа
рLuxR?N	вектор pTZ57R содержит 5' - делетированный фрагмент гена luxR под lac промотором; Apr	данная работа
рGEX-LuxR?N	вектор pGEX-KG содержит 5' - делетированный фрагмент гена luxR; Apr	данная работа
рGEX-LuxR?C	вектор pGEX-KG содержит 3' - делетированный фрагмент гена luxR; Apr	данная работа
рОМ	pACYC184 со встроенным по BamHI/NruI - сайтам генами luxIABCDEG А. Fischeri под правым промотором Pr, а также lux-боксом (без luxR); Cmr	данная работа
pGrpE-lux	вектор pDEW201содержит под промотором PgrpE кассету генов luxCDABE, выделенных из генома бактерий Photorhabdus luminescens; Apr	наша лаборатория
pOMibpAB	вектор pZS33 содержит гены ibpAB, расположенные под промотором PLtetO-1; Cmr	данная работа

Манипуляции с ДНК. Трансдукцию бактериофагом Р1 проводили по стандартной методике (Миллер Дж.,1979). Выделение плазмидной ДНК, рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток E. coli проводили согласно стандартным методам, изложенным в (Sambrook et al., 1989).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили на приборе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Температурный режим подбирали с учетом длины амплифицированного фрагмента, длины и состава используемых праймеров. Выделение и очистку ПЦР продуктов проводили с использованием набора DNA extraction kit (Fermentas, Литва).

Выделение и очистка белков с помощью аффинной хроматографии. Клетки E. coli TG1, содержащие плазмиды pGEX-LuxR, pGEX-LuxRДN или pGEX- LuxRДC, растили в среде LB c ампициллином. При достижении средней стадии экспоненциальной фазы в среду добавляли индуктор изопропил-в-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и продолжали инкубировать 2-3 ч при 37⁰C. Затем клетки инкубировали еще 12 ч при 18⁰C. Клетки осаждали центрифугированием и переводили в охлажденный 1xPBS (140 мM NaCl, 2.7mM KСl, 10mM Na₂HPO₄, 1.8 KH₂PO₄ ,pH 7.3) с добавлением 0,5% тритон Х-100. Клетки лизировали при помощи ультразвуковой дезинтеграции, лизат центрифугировали при 18.000g 20 мин на холоду. Супернатант дважды пропускали через колонку с глутатион-агарозой. После адсорбции колонку промывали 1xPBS, освобождаясь от несвязавшихся белков. Химерные белки GST-LuxR, GST-NTD и GST-CTD элюировали раствором восстановленного глутатиона. Белковые фракции анализировали при помощи электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (0.1% додецилсульфат натрия - SDS) согласно Лэммли (Laemmli U. K., 1970).

Измерение экспрессии генов luxICDABEG A. fischeri в клетках E. coli. Экспрессию lux-генов контролировали, измеряя интенсивность биолюминесценции клеток. Измерение интенсивности биолюминесценции суспензии клеток проводили с помощью люминометра "Биотокс-7” и микропланшетного люминометра LM-01T (Immunotech) при комнатной температуре. При оценке люциферазной активности в бактериях E. coli (pF2) к 200 мкл суспензии клеток добавляли 2 мкл n-деканаля (6,8 мкМ) и через 30 сек -1 мин измеряли интенсивность биолюминесценции.

Термоинактивация и рефолдинг люциферазы. Кинетику и уровень рефолдинга термоинактивированных люцифераз измеряли in vivo в клетках E. coli, содержащих гибридную плазмиду pF2 с генами luxAB. Бактерии росли при 28⁰С с аэрацией до ранней экспоненциальной фазы (OD = 0.2-0.3), а затем при 42⁰С в течение 30 мин без перемешивания для индукции белков «теплового шока». После этого для ингибирования синтеза белка к суспензии клеток добавляли хлорамфеникол (167 мкг/мл) и выдерживали на водяной бане при повышенной температуре (46⁰С) для инактивации люциферазы. Рефолдинг люцифераз проводили при комнатной температуре. Через определенные интервалы времени отбирали пробу суспензии клеток (200 мкл) и сразу после добавления n-деканаля (субстрат люциферазной реакции) измеряли интенсивность биолюминесценции.

2. Роль шаперонина GroEL и кошаперонина GroES в регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli

Ранее было показано, что клетки E. coli , мутантные по генам groEL и groES, содержащие плазмиду с полным lux-опероном A. fischeri, характеризуются значительно сниженным уровнем биолюминесценции (Dolan & Greenberg,1992). Влияние мутаций в гене groEL на экспрессию lux-оперона A. fischeri ограничивается геном luxR и его продуктом белком-активатором LuxR. Этот вывод следует из данных, полученных с помощью сконструированной плазмиды pVFR1. В плазмиде pVFR1 клонирован ген luxR совместно с регуляторной областью lux-оперона с промоторами P_l и P_r A. fischeri, а вместо генов luxICDABE A. fischeri встроена кассета с генами luxCDABE Photorhabdus luminescens, кодирующими термостабильную люциферазу. Транскрипция правого промотора P_r и, соответственно, синтез люциферазы инициируется введением в среду молекул АИ.

На Рис.1 представлены данные эксперимента. Как видим, значительное снижение интенсивности биолюминесценции имеет место в клетках штамма OFB111groEL673, содержащих плазмиду pVFR1. Т.к. структурные гены luxCDABE P. luminescens, клонированные в плазмиде pUC, показывают одинаковую интенсивность люминесценции в штаммах SKB178 gro⁺ и OFB111groEL673 (данные не представлены), то, следовательно, в случае плазмиды pVFR1 влияние шаперонина GroEL имеет место на белок LuxR.

Рисунок. 1. Зависимость интенсивности биолюминесценции клеток E. coli SKB178 gro⁺ и OFB111 groEL673 от времени инкубации при 22⁰С.

Клетки ночной культуры инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28⁰С до OD = 0,4-0,5. Затем инкубировали 30 мин при 42⁰С для инактивации белка LuxR. После добавления аутоиндуктора (конечная концентрация 5·10^-8 М), продолжали инкубацию без перемешивания при 22⁰С. Через определенные интервалы времени отбирали пробы по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. Штаммы содержали плазмиду pVFR1:

Так как LuxR состоит из двух доменов с различными функциями, было проведено сравнительное исследование влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli. Для этой цели использовались сконструированные гибридные плазмиды pLuxR или pLuxRДN. На рис. 2 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции от времени инкубации клеток E. coli SKB178 gro⁺ и OFB111, содержащих плазмиду pOM (с генами luxCDABEG) и плазмиду pLuxR (продуцирует полноразмерный белок LuxR) или pLuxR?N (продуцирует C - домен белка LuxR).

Как видно из Рис.2, наличие в клетках E. coli SKB178 gro⁺(pOM) дополнительной плазмиды pLuxR или pLuxRN приводит к резкому увеличению интенсивности биолюминесценции в связи с активацией транскрипции генов luxICDABE с промотора P_R. Мутация groEL673 резко снижает интенсивность биолюминесценции в бактериях, содержащих плазмиду pLuxR (определяет синтез цельного LuxR). Однако, если в качестве активатора транскрипции используется С - домен белка LuxR (плазмида pLuxRДN), то мутация groEL673 не влияет на экспрессию генов luxICDABE.



Рисунок 2. Влияния шаперонина GroEL на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов lux-оперона A. fischeri.

Отдельные колонии клеток, выросших на агаризованной среде при 37⁰С, переводили в L-бульон и дважды отмывали центрифугированием. Затем клетки ресуспендировали в 200 мкл L-бульона и измеряли биолюминесценцию.

()SKB178gro+(pLuxRДN, pOM),

()OFB111groEL673(pLuxRДN, pOM),

()SKB178gro+(pLuxR, pOM),

()OFB111groEL673(pLuxR, pOM),

()SKB178gro+ (pOM),

()OFB111groEL673 (pOM).

Таким образом, в опытах in vivo было показано, что шаперонин GroEL не требуется для фолдинга С-концевого домена белка LuxR. Предполагается, что шаперонин GroEL специфически связывается с N-концевым доменом белка LuxR.

3. Аффинная очистка белка LuxR, его С - и N - доменов. Электрофоретическое разделение в полиакриламидном геле белка LuxR, его С - и N - доменов

Для прямой проверки связывания GroEL с N-концевым доменом LuxR были сконструированы генетические конструкции, определяющие синтез химерных белков:

GST-LuxR (глутатион трансфераза (GST), которая трансляционно слита с полноразмерным LuxR), GST-?(163-250)LuxR (GST, трансляционно слитая с N-концевого доменом белка LuxR (GST-NTD)) и GST-? (2-162)LuxR (GST, трансляционно слитая с С-концевым доменом белка LuxR (GST-CTD)). Плазмиды получили названия pGST- LuxR, pGST-NTD и pGST-CTD. Данная система позволяет проводить эффективную аффинную очистку на колонке с глутатион-агарозой. Полученные белковые фракции разделяли при помощи электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии SDS.

На Рис. 3 представлены данные SDS - электорофореза полученных белковых фракций. Как видно из рисунка, при аффинной очистке вместе с полноразмерным белком GST-LuxR и его N-доменом (GST-NTD) выделяется дополнительная полоса в 60 kDa. Однако, при аффинной очистке С - домена белка LuxR (GST-CTD) эта полоса отсутствует.

Рисунок 3. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (12%) белковой фракции, полученной в результате аффинной хроматографии на колонке с глутатион-агарозой.

Белковую фракцию выделяли из клеток штаммов E. coli TG-1, содержащих pGST-CTD (дорожка 1), pGST-LuxR (дорожка 2) и pGST-NTD (дорожка 3). На дорожках 1 и 3 так же присутствует полоса глицерол - киназы (56,2 кДа), а на дорожке 1 и 2 полоса элонгационного фактора EF-Tu (43,3 кДа) (согласно масс-спектрометрическому анализу эти полосы соответствуют глицерол - киназе и элонгационному фактору EF-Tu). Эти белки сопровождают GST белок при мягких условиях отмывки.

Масс-спектрометрический анализ показал, что белок, выделенный из полосы 60 кДa, по составу и распределению пептидных фингерпринтов согласно базе данных SWISS-PROT является шаперонином GroEL (Табл. 2).

Таблица 2. Результаты фингерпринт-анализа* пептидов, полученных энзиматическим (трипсин) расщеплением белков, элюированных из акриламидного геля после SDS-электрофореза.

Белковые полосы**	Белок сравнения	Число совпадающих петидов	-10*Log(P)***
54,8 kDa 2-я дорожка	GST-LuxR	15	144
57,6 kDa 2-я дорожка	GroEL	15	264
57,6 kDa 3-я дорожка	GroEL	15	242
36,4 kDa 1-я дорожка	GST-CTD	14	183
45 kDa 3-я дорожка	GST-NTD	16	178

* Сравнение пептидных масс по базе данных NCBInr при помощи поисковой программы Mascot (www.matrixscience.com).

** Данные SDS-электрорфореза (Рис. 3).

*** Значимость совпадения с белком сравнения определяется как -10*Log(P) где P - вероятность случайности совпадения. При -10*Log(P) > 72 совпадение считается неслучайным (р < 0,05)

Таким образом, было показано, что в условиях in vivo GroEL шаперонин связывается с полноразмерным LuxR и его N-доменом, но не связывается с С-доменом LuxR. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что N-концевой домен LuxR белка является мишенью для GroEL шаперонина при фолдинге. Можно сделать предположение, что GroEL шаперонин необходим для фолдинга только N-концевого домена белка LuxR.

4. Компенсация gro мутации высокими концентрациями аутоиндуктора

На рис. 4 приведена зависимость максимальной интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro⁺ и OFB111groEL673, содержащих плазмиду pVFR1 от концентрации АИ. Клетки ночной культуры инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28⁰С до экспоненциальной фазы (OD = 0,4-0,5). Затем инкубировали 30 мин при 42⁰С и после добавления различных концентраций АИ, - N-(3-оксогексаноил) лактон L-гомосерина, («Сигма»), продолжали инкубацию без перемешивания при 22⁰С. Через определенные интервалы времени отбирали пробы по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. Максимальная интенсивность биолюминесценции наблюдается через 60 мин.

Рисунок 4. Зависимость максимальной интенсивности биолюминесценции клеток SKB178 gro⁺ и OFB111groEL673 от концентрации АИ.

() - SKB178 gro⁺ (pVFR1);

() - OFB111groEL673 (pVFR1).

Как видно на Рис.4, если минимальная (пороговая) концентрация АИ в случае штамма SKB178 gro⁺ равняется около 10^{- 9} М, то для мутантного штамма OFB111groEL673 пороговая концентрация АИ составляет около 10^-7 M. Таким образом, дефект в мутантном гене groEL673 в определенной степени можно компенсировать при добавлении в среду высоких концентраций АИ.

5. Роль АТФ-зависимых протеаз Lon и ClpXP в регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli.

Другими дополнительными факторами, влияющими на экспрессию lux-генов A. fischeri, являются АТФ-зависимые протеазы. В отличие от шаперонинов GroEL/ES, АТФ-зависимая протеазы Lon и ClpXP участвуют в негативном контроле экспрессии lux-оперона. На Рис.5 приведены кривые зависимости интенсивности биолюминесценции (I) от OD суспензии клеток E. coli AB1157 lon⁺ clp⁺, NK113 clpP::cat, NK114 clpX:kan и AB1899 lonA1, содержащих гибридную плазмиду pF1 с lux-опероном A. fischeri.

Рисунок 5. Влияние мутаций в генах clpX, clpP, lon на экспрессию генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli; зависимость интенсивности биолюминесценции (I) от оптической плотности (OD).

Бактерии росли при 30⁰С на L-среде с 1,7% агаром. Ночную культуру инокулировали в жидкую LB и растили при 30⁰С с аэрацией. Экспрессию lux-генов контролировали, измеряя интенсивность биолюминесценции клеток. Все используемые штаммы содержали плазмиду pF1 с lux-опероном A. fischeri.

() - AB1157 lon⁺clp⁺,

() - NK113 clpP:cat,

() - NK114 clpX::kan,

()- AB1899 lonA1.

Как видим, клетки штамма AB1899, мутантные по гену lonA, люминесцируют на несколько порядков ярче по сравнению с клетками штамма AB1157 clp⁺ lon⁺ при всех значениях OD. Повышенный уровень интенсивности биолюминесценции характерен и для бактерий NK113 и NK114, мутантных по генам clpP и clpX, однако, он несколько ниже, чем для штамма AB1899 lonA1.

Ранее было показано, что мишенью для протеазы Lon является активатор транскрипции белок LuxR (Манухов И.В. и др., 2006). Соответственно, повышенное содержание LuxR в бактериях, мутантных по гену lon, определяет как более раннее открытие правого промотора Pr (AB1899 - OD около 0.4 - 0.5; AB1157 - OD около 0.9 - 1.0), так и высокий уровень экспрессии генов lux-оперона, что фиксируется по превышению интенсивности биолюминесценции клеток AB1899 примерно на четыре порядка по сравнению с таковой для бактерий штамма AB1157 (Рис.5).

На основании данных, представленных на Рис.5, можно заключить, что, помимо Lon-протеазы, в негативной регуляции экспрессии генов lux-оперона участвует также протеаза ClpXP, однако ее вклад в данный эффект значительно ниже. Начало экспрессии lux-генов в клетках штаммов NK113 и NK114 фиксируется при более высоком значении OD около 0.6 - 0.7, а усиление интенсивности биолюминесценции не превышает двух порядков по сравнению с таковой для бактерий штамма AB1157 (Рис.5).

Было проведено сравнительное исследование влияния Lon-протеазы на эффективность действия цельного LuxR и его С-домена в качестве активаторов транскрипции генов lux-оперона A. fischeri в клетках E. coli.

Для оценки действия Lon - протеазы на LuxR и его С-домен гибридные плазмиды pLuxR или pLuxR?N были введены в клетки штаммов E. coli SG22163 malP::lacI^q и SG22186 malP::lacI^q?lon, содержащие плазмиду pOM. Бактерии росли при 30⁰С на L-среде с 1,7% агаром. Ночную культуру инокулировали в жидкую LB и растили при 30⁰С с аэрацией до OD 0.2-0.3. Далее к суспензии клеток добавляли ИПТГ (0 - минут) для индукции транскрипции с lac промотора и, соответственно, синтеза белков LuxR или его С-домена, а для активации LuxR добавляли в среду АИ (для проявления активности С-домена АИ не требуется). После этого клетки продолжали инкубировать при комнатной температуре без перемешивания с измерением интенсивности биолюминесценции через определенные интервалы времени. На Рис.6 представлены результаты этого эксперимента.

Как видим на Рис. 6а, интенсивность биолюминесценции клеток SG22186 ?lon (pLuxR, pOM) быстро нарастает уже в течение первых 15 мин с момента добавления ИПТГ и АИ, что указывает на наличие в клетках в момент начала индукции (0-минут) количества молекул LuxR, достаточного для активации P_r промотора lux-оперона. Однако, в клетках штамма SG22163 lon+ (pLuxR, pOM) индукция транскрипции генов lux-оперона начинается лишь через 70 мин после добавления ИПТГ (0,1-1,0 мМ) и АИ (10^-7M), что объясняется деградацией белка LuxR протеазой Lon.



Риcунок 6. Влияние Lon - протеазы на активность LuxR и его С - концевого домена как индукторов экспрессии генов lux-оперона A. fischeri.

Зависимость интенсивности биолюминесценции (I, отн.ед.) клеток штаммов SG22163 lon+ и SG22186 ?lon, содержащих плазмиды pLuxR и pOM(а) или pLuxR?N и pOM(б), от времени инкубации при комнатной температуре. Начало инкубации (0-минут) определяется добавлением к опытным образцам ИПТГ (0,1 мМ) и АИ (10^-7М).

() SG22186 ?lon (pLuxR, pOM) (+ИПТГ,+АИ), (О) SG22186 ?lon (pLuxR?N, pOM) (+ИПТГ),

() SG22186 ?lon (pLuxR, pOM) (-ИПТГ,-АИ), (?) SG22186 ?lon (pLuxR?N, pOM) (-ИПТГ),

() SG22163 lon+ (pLuxR, pOM) (+ИПТГ,+АИ), (Д)SG22163 lon+ (pLuxR?N, pOM) (+ИПТГ),

(Х) SG22163 lon+ (pLuxR, pOM) (-ИПТГ,-АИ). () SG22163 lon+ (pLuxR?N, pOM) (-ИПТГ).

Иная картина имеет место, если в клетки введена плазмида pLuxR?N, кодирующая С-домен белка LuxR (Рис. 6б). Как видим, как в клетках SG22163 lon+ (pLuxR?N, pOM), так и SG22186 ?lon (pLuxR?N, pOM) экспрессия lux-генов стартует через 100 мин с момента добавления ИПТГ (0,1-1,0 мМ). Следовательно, лишь цельный белок LuxR, но не его С-домен, является мишенью для Lon- протеазы.

На основании данных, представленных в настоящей работе, можно предложить следующую схему формирования активной формы LuxR, положительного регулятора (активатора) транскрипции генов lux-оперона A. fischeri (Рис.7). На первой стадии в результате синтеза на рибосоме образуется структура с полностью сформированным С-доменом и слабо упакованным («рыхлым») N-доменом (форма LuxR*). На второй стадии N-домен LuxR* контактирует с шаперонином GroEL, что обеспечивает последующий процесс фолдинга белка, завершаемый формированием компактной структурой N-домена (форма LuxR**). Белок LuxR** еще не способен активировать транскрипцию lux-генов, так как N-домен частично закрывает C-домен, блокируя формирование комплекса C-домена с lux-боксом. На третьей стадии N-домен белка LuxR** образует комплекс с молекулой АИ (3-O=6HSL), что обеспечивает мономерам белка формировать активный димер (LuxR-АИ)₂, в котором N-домены обеспечивают контакт мономеров, а открытые C-домены формируют комплекс с lux-боксом.

Необходимо отметить, что N-домен белка LuxR** характеризуется очень низкой константой диссоциации при комплексировании с АИ: пороговая концентрация АИ, при которой активируется экспрессия lux-генов, порядка 10^-9М (что соответствует примерно 3-4 молекулам АИ в расчете на объем бактериальной клетки).

Как показано в настоящей работе, белок в форме LuxR* (образующийся непосредственно после синтеза на рибосоме) также способен формировать комплекс с АИ с последующей димеризацией LuxR. Однако, в этом случае константа диссоциации для процесса комплексообразования примерно на два порядка выше: пороговая концентрация АИ равна примерно 10-7М, что соответствует уже 300-400 молекулам АИ в расчете на клетку. Эта цифра слишком велика и не дает клетке возможности провести нормальную QS - регуляцию транскрипции генов, так как активация генов будет происходить лишь при очень высоких плотностях популяции. Поэтому можно считать роль системы шаперонинов GroEL/ES ключевой в системах регуляции типа QS. бактериальный плазмид термоинактивация белок

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 7. Предполагаемая схема взаимодействия полипептидной цепи LuxR с шаперонином GroEL и аутоиндуктором (АИ) во время синтеза на рибосоме и формирования нативной структуры.

LuxR* - форма белка непосредственно после синтеза на рибосоме,

LuxR** - форма белка в результате прохождения полипептида через систему шаперонинов GroEL/ES.

(LuxR-АИ)₂ - активная димерная форма белка LuxR в комплексе с АИ.

7. Изучение механизма защитного действия бактериальных шаперонов семейства Hsp100 при термоинактивации белков в клетке.

Следующая часть диссертационной работы посвящена изучению влияния шаперонов непосредственно на экспрессию структурных генов lux-оперона A. fischeri, а именно на структурные гены luxAB, определяющие синтез б - и в - субъединиц бактериальной люциферазы.

Ранее было показано, что шаперонин GroEL и АТФ - зависимые протеазы Lon и ClpXP не влияют напрямую на активность бактериальной люциферазы. Основная группа шаперонов, принимающая непосредственное участие в процессах фолдинга и рефолдинга белков в клетках Escherichia coli - это семейство Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE). В частности система шаперонов DnaK-DnaJ-GrpE (DnaKJE) ведет процесс рефолдинга термоинактивированной бактериальной люциферазы A. fischeri. Без этой системы шаперонов процесс восстановления термоинактивированной люциферазы невозможен, поэтому далее мы всегда будем иметь в виду только DnaKJE - зависимый рефолдинг.

Однако помимо шаперонов DnaKJE в процессе рефолдинга и дезагрегации белковых агрегатов в бактериальной клетке принимает участие целый ряд других белков - шаперонов. В работе (Wickner S.et al., 1994) было показано, что присутствие белка ClpA в смеси с ферментом in vitro в момент термоинактивации позволяет проводить эффективный рефолдинг этого фермента при последующем добавлении к смеси шаперонов DnaKJE. Авторы предположили, что ClpA защищает фермент от агрегации. В работе (Dougan D.A. et al., 2002) с помощью метода светорассеяния in vitro на модели термоинактивированных ферментов MDH и светлячковой люциферазы было продемонстрировано, что шаперон ClpA активно участвует в АТФ - зависимой дезагрегации агрегированных форм белков. Однако, относительно участия ClpA in vivo в дезагрегации и рефолдинге денатурированных белков в клетках E. coli экспериментальные данные отсутствуют.

Для оценки влияния шаперона ClpA на рефолдинг бактериальной люциферазы in vivo нами была использована плазмида pF2, в которой гены luxAB, определяющие синтез бактериальной люциферазы A. fischeri, расположены под промотором P_lac. Бактерии росли при 30⁰ с аэрацией до OD = 0,4-0,5 с последующей инкубацией при 42⁰С 30 мин для индукции белков «теплового шока». Затем к суспензии клеток для ингибирования синтеза белка добавляли хлорамфеникол (167 мкг/мл), и культуру переносили в водяную баню при температуре (46⁰C) для инактивации люциферазы. Рефолдинг термоинактивированной люциферазы проводили при комнатной температуре.

Рисунок 8. Влияние мутации clpA::kan на кинетику и уровень DnaKJE-зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы А. fischeri.

Кинетика рефолдинга люциферазы А. fischeri в клетках E. coli MG1655 clpA⁺(а) и MG1655 clpA::kan (б) при различной длительности инкубации клеток при 46⁰С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 25⁰С.

Продолжительность инкубации при 46⁰С: ()- 5 мин, (Д) - 15 мин, (О)- 30 мин, ()- 60 мин.

На Рис. 8 приведены кинетические кривые ренатурации люциферазы A. fischeri (в %% от исходного уровня) в зависимости от времени рефолдинга при 25С при различной длительности инактивации фермента при 46⁰С. В клетках E. coli MG1655 dnaK⁺ clpA⁺ рефолдинг практически полный (до 80-90% от исходного уровня) после 5-10 мин инактивации. При пролонгировании процесса термоинактивации (30 мин и более) уровень рефолдинга лишь несколько снижается (Рис. 8а). Иная картина наблюдается в случае мутантного штамма MG1655 clpA::kan. Как видно из данных, представленных на Рис. 8б, уровень рефолдинга несколько ниже уже при небольших временах термоинактивации (5 мин), и он быстро спадает практически до фонового уровня при увеличении времени при 46⁰С более 30 мин.

По-видимому, недостача шаперона ClpA наблюдается только при пролонгированной термоинактивации люциферазы, когда образуются более крупные агрегаты, для дезагрегации которых и необходим шаперон ClpA.

Помимо шаперонов DnaKJE и шаперона ClpA в процессе рефолдинга белковых агрегатов в бактериальной клетке принимают участие малые белки - шапероны IbpA и IbpB (принадлежащие семейству АТФ-независимых шаперонов sHsp). Как показано в ряде работ, шапероны IbpA и IbpB образуют комплексы с белковыми агрегатами, что приводит к ускорению процесса дезагрегации, причем, в процессе рефолдинга, как такового, шапероны IbpAB не участвуют (Laskowska E., et al.,1996; Kuczynska-Wisnik D., et al.,2002; Mogk A., et al.,2003). Согласно данным, полученным в опытах in vitro, наличие IbpAB в смеси с белком-субстратом защищает белки от термоденатурации, снижая уровень агрегации, что фиксируется методом светорассеяния (Mogk A., et al.,2003).

Для оценки влияния шаперонов IbpAB на рефолдинг бактериальной люциферазы in vivo использовали плазмиду pF2. Термоинактивацию и рефолдинг люциферазы проводили согласно описанной выше методике.

а) б)

Рисунок 9. Влияние мутаций в генах ibpA и ibpB на кинетику и уровень DnaKJE-зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri.

Кинетика рефолдинга люциферазы A. fischeri после инкубации клеток 5 мин (а) и 60 мин (б) при 46⁰С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс отложено время рефолдинга люциферазы при 25⁰С.

Все штаммы содержали плазмиду pF2.

() - BW25113 ibpA⁺ ibpB⁺ dnaK⁺

() - JW3664 ibpA::kan,

() - JW3663 ibpB::kan,

() - JW0013 dnaK::kan.

На Рис. 9 приведены кинетические кривые зависимости уровня рефолдинга (ренатурации) люциферазы A. fischeri (в % % от исходного уровня) от времени инкубации при температуре 25⁰С. Отметим, что в клетках мутантного штамма JW0013 dnaK::kan рефолдинг белка полностью отсутствует. В клетках E. coli BW25113 dnaK⁺ ibpAB⁺ имеет место быстрый и практически полный рефолдинг, до 80-90% от исходного уровня, если время термоинактивации при 46⁰С пять мин (Рис. 9а). При термоинактивации в течение 60 мин при 46⁰С уровень рефолдинга снижается примерно в два раза (Рис. 9б).

Иная картина наблюдается в случае мутантных штаммов JW3663 ibpB::kan и JW3664 ibpA::kan. Как видно из данных, представленных на Рис. 9, наблюдается замедление процесса рефолдинга, а также снижение уровня рефолдинга, что особенно проявляется при 60 - минутной термоинактивации. Имеет место также различие в способности вести рефолдинг люциферазы у мутантных штаммов: в штамме JW3663 ibpB::kan замедление скорости и снижение уровня рефолдинга выражены значительно сильнее, чем в штамме JW3664 ibpA::kan.

Введение в мутантные клетки JW3663 ibpB::kan и JW3664 ibpA::kan плазмиды pOMIbpAB (вектор pZS33, содержащий гены ibpAB под промотором P_LtetO-1) практически полностью компенсирует дефекты генома и даже усиливает процессы рефолдинга выше уровня, наблюдаемого в диком штамме, что, по-видимому, определяется копийностью плазмиды (Рис. 10).

Рисунок 10. Влияние плазмиды pOMibpAB на кинетику и уровень DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri.

Кинетика рефолдинга A. fischeri после 60 мин инкубации клеток при температуре 46⁰С в E. coli JW3664 ibpA::kan (а) и JW3663 ibpB::kan (б). По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время рефолдинга люциферазы при 25⁰С.

() - BW25113 ibpA⁺ ibpB⁺ dnaK⁺(pF2),

() - JW3664 ibpA::kan (pF2),

() - JW3664 ibpA::kan (pF2, pOMibpAB),

()- JW3663 ibpB::kan (pF2),

() - JW3663 ibpB::kan (pF2, pOMibpAB).

Представляло интерес сравнить влияние шаперонов IbpAB и ClpA на DnaKJE-зависимый рефолдинг денатурированных белков и оценить возможность компенсировать недостачу шаперона ClpA малыми шаперонами IbpAB.

На Рис. 11 приведены кинетические кривые ренатурации люциферазы A. fischeri (в %% от исходного уровня) в зависимости от времени инкубации при температуре 25⁰С в клетках E. coli MG1655 clpA⁺ и MG1655 clpA::kan.

Как видим, при длительной термоинактивации при 46⁰С (60 мин) уровень рефолдинга люциферазы в мутантном штамме MG1655 clpA::kan значительно снижен по сравнению с таковым в штамме MG1655 clpA⁺. Этот результат соответствует ранее полученным данным о важности шаперона ClpA в процессе рефолдинга белков при пролонгированной инкубации клеток при высокой температуре.



Рисунок 11. Влияние плазмиды pOMibpAB на кинетику и уровень DnaKJE - зависимого рефолдинга термоинактивированной люциферазы A. fischeri в клетках MG1655 clpA⁺ и MG1655 clpA::kan после 60 мин инкубации клеток при температуре 46⁰С. По оси ординат отложена активность люциферазы (в процентах от исходного уровня), по оси абсцисс - время рефолдинга люциферазы при 25⁰С.

() - MG1655 clpA⁺(pF2);

() - MG1655 clpA::kan(pF2);

() - MG1655 clpA::kan (pF2,pOMibpAB).

Можно было предположить, что при сходных эффектах (защита белков-субстратов от агрегации) ClpA и IbpAB, фиксируемых в опытах in vitro (Laskowska E., et al.,1996; Kuczynska-Wisnik D., et al.,2002; Mogk A., et al.,2003), малые шапероны IbpAB способны компенсировать дефект клетки по гену clpA. Однако, как это представлено на Рис. 11, наличие в мутантных по гену clpA бактериях E. coli MG1655 clpA::kan плазмиды pOMIbpAB не повысило эффективность процесса рефолдинга длительно термоинактивированной люциферазы. Можно предположить, что шапероны IbpAB и ClpA действуют на разных этапах процессов дезагрегации и ренатурации белков и независимо друг от друга.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что шаперонин GroEL системы GroEL/ES необходим для фолдинга цельного LuxR, но не его С-домена;

2. Показано, что АТФ-зависимые протеазы Lon и ClpXP осуществляют протеолитический контроль экспрессии генов lux-оперона Aliivibrio fischeri в клетках Escherichia coli;

3. Показано, что мишенью для протеазы Lon является цельный LuxR, а не его С-домен;

4. Показано участие шаперона ClpA (семейство Hsp100) в рефолдинге термоинактивированной люциферазы при пролонгированной термоинактивации;

5. Показано, что мутации в генах ibpA и ibpB снижают скорость и уровень рефолдинга, причем недостаток шаперона IbpB сказывается сильнее, чем недостаток шаперона IbpA;

6. Показано, что повышенное содержание белков IbpA и IbpB, компенсируя дефекты в генах ibpA и ibpB, не компенсирует дефекты в гене clpA.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Котова В. Ю., Манухов И. В., Мелькина О. Е., Завильгельский Г. Б. Мутация clpA:kan в гене, кодирующем шаперон семейства Hsp100, значительно снижает эффективность DnaK-зависимого рефолдинга белков в бактериях Escherichia coli// Молекулярная биология 2008, т. 42, №6, с.1018-1022.

2) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. С - домен LuxR, активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для lon - протеазы. // Молекулярная биология 2010, т. 44, № 3, с.515-519.

3) О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. Протеолитический контроль экспрессии генов lux- оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli//Генетика 2010, т.46, №8, с.1050-1056.

4) Ilya V. Manukhov, Ol'ga E. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. // Journal of Bacteriology 2010, V192, 20, P5549-5551.

Материалы конференций:

1) Мелькина О. Е., Манухов И. В., Завильгельский Г. Б. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri. Материалы III Российского симпозиума «Белки и пептиды», Пущино, 2007, с.83.

2) Мелькина О. Е., Горянин И.И. GroEL шаперон необходим для фолдинга N-концевого домена LuxR - активатора транскрипции lux-оперона Vibrio fischeri. Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009, с.71.

Размещено на Allbest.ru

...