Фармакогностичне дослідження видів роду Melilotus L. флори України

Размещено на http://www.allbest.ru/

Грудько І.В. Фармакогностичне дослідження видів роду Melilotus L. флори України - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2013.

Вперше проведено морфолого-таксономічне дослідження 10 видів та фармакогностичне і хемотаксономічне 7 видів роду Melilotus L. флори України, в результаті якого встановлено вміст гідроксикоричних кислот, кумаринів, дубильних речовин, флавоноїдів, 110 компонентів ефірних олій, органічних кислот, амінокислот, каротиноїдів, хлорофілів, макро- та мікроелементів; виділено 19 фенольних сполук і циклічний спирт інозитол; визначено перспективні види як джерела отримання БАР, на основі яких отримано фармакологічні лікарські субстанції з антимікробною, протипухлинною та антикоагулянтною дією; розроблено проекти МКЯ на сировину. Складено опис, ідентифікацію та випробування методом тонкошарової хроматографії, кількісне визначення кумарину і флавоноїдів.

Ключові слова: Melilotus L., фармакогностичне дослідження, морфолого-таксономічне та хемотаксономічне дослідження, біологічно активні речовини, антибактеріальна, антикоагулянтна та протипухлинна активність.

Грудько И.В. Фармакогностическое исследование видов рода Melilotus L. флоры Украины - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2013.

Диссертация посвящена фармакогностическому исследованию видов рода Melilotus L. флоры Украины с целью выявления новых перспективных видов как источников БАВ, на основе которых получены фармакологические лекарственные субстанции с антимикробной, противоопухолевой и антикоагулянтной активностью. Впервые изучен качественный и количественный состав 110 компонентов эфирных масел 7 видов донников флоры Украины. Хромато-масс-спектрометрическим методом определены БАВ: ациклические монотерпеноиды - гераниол, линалоол и их эфиры; моноциклические монотерпеноиды - терпинен-4-ол; ациклические сесквитерпеноиды - фарнезен, фарнезол; моноциклические сесквитерпеноиды - транс--бисаболен, -сесквифелландрен, -бисаболен, ar-куркумен, -куркумен; бициклический сесквитерпеноид - транс--бергамотен, дитерпен - фитол и тритерпен - сквален.

Впервые проведено морфолого-таксономическое изучение 10 видов донников: проанализировано 2120 положительных и отрицательных состояний признаков. Впервые осуществлено хемотаксономическое исследование 7 видов донников: проанализировано 665 положительных и отрицательных состояний признаков, которые произрастают и культивируются на территории Украины. Построены иерархические ряды, дендрограммы рода на основе морфологических и химических признаков, показывающие таксономические расстояния между донниками. Согласно результатам хемотаксономического исследования установлен перспективный вид донника как источника БАВ: M. albus донник белый. На основании результатов таксономического исследования выявлено, что род разделяется на 3 группы (ветви), каждая отличается определенным набором признаков.

В траве донника белого и донника лекарственного идентифицированы 20 веществ: 2 фенолкарбоновые кислоты (салициловая, галловая), 7 гидроксикоричных кислот (изохлорогеновая, кофейная, феруловая, хлорогеновая, неохлорогеновая, о-гидроксикоричная, о-кумаровая и о-мелилотовая), 3 кумарина (кумарин, дикумарин и умбеллиферон), 7 флавоноидов (лютеолин, кемпферол, кверцетин, кверцетина-7-О-рамнозид, изокверцитрин, цинарозид и рутин), циклический спирт - инозитол. В траве и экстрактах определено количественное содержание органических кислот, гидроксикоричных кислот, кумаринов, флавоноидов, эфирного масла, дубильных веществ, свободных и связанных аминокислот, жирных кислот, хлорофиллов, каротиноидов, макро- и микроэлементов.

Подобраны технологические параметры получения густых (Мелисепт Л, Мелисепт Б, Мелифен Л, Мелифен Б) из травы донника лекарственного и донника белого и сухого экстракта из травы донника лекарственного. Впервые установлены антимикробная, антикоагулянтная, противоопухолевая активности полученных экстрактов. Определена острая токсичность полученных субстанций.

Новизна разработанных оригинальных способов получения биологически активных комплексов из травы донника лекарственного и травы донника белого подтверждена патентами Украины на полезную модель: «Способ получения комплекса биологически активных веществ с антимикробной активностью» (патент на полезную модель № 70295 от 11.06.2012) и «Способ получения липофильного комплекса антимикробного действия» (патент на полезную модель № 70294 от 11.06.2012). Проведена стандартизация травы донника. Разработан проект МКК «Донника белого трава». Составлено описание, идентификацию и испытания методом тонкослойной хроматографии и количественным определением кумарина. Установлены морфолого-анатомические признаки изучаемых видов. Общими признаками являются: строение стебля и эпидермы стебля, наличие простых и головчатых волосков. Для видов подрода Micromelilotus: M. arenarius, M. tauricus, M. neapolitanus и M. indicus установлено наличие двух типов палисадных клеток (высоких и низких) семенной кожуры. Основные отличия наблюдаются в строении бобов. Характер поверхности бобов у донников различный - морщинистый, сетчато-ячеистый, сетчато-морщинистый, поперечно-морщинистый и поперечно-складчато-морщинистый; бобы отличаются по размерам, форме и характеру поверхности.

Ключевые слова: Melilotus L., фармакогностическое исследование, морфолого-таксономическое и хемотаксономическое исследование, биологически активные вещества, антибактериальная, антикоагулянтная и противоопухолевая активность.

Grudko I.V. Pharmacognostic research of Melilotus L. genus species from Ukrainian flora - A manuscript. Dissertation for the candidate of pharmaceutical science Degree in specialty 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National University of Pharmacy, Kharkiv, 2013.

At the first time the morphological and taxonomic studies of 10 species and pharmacognostic and chemotaxonomic studies of seven species of the genus Melilotus L. flora of Ukraine were carried out. As the result the content of hydroxycinnamic acids, coumarins, tannins, flavonoids, 110 constituents of essential oils, organic acids, amino acids, carotenoids, chlorophylls, macro- and micronutrients they are determined; 19 phenolic compounds and cyclohexanіc alcohol - inositol have been obtained; promising species as sources of biologically active substances have been choosen that could be used as base for receiving pharmacological drug substance with antimicrobial, antitumor and anticoagulating action were identified. The methods of quality control for the raw material were worked out. Description, identification and testing of the method of thin layer chromatography, quantification of coumarins and flavonoids were complied.

Key words: Melilotus L, pharmacognostic research, morphologic-taxonomic and chemotaxonomic research, biological active compounds, antibacterial, anticoagulant and anti-tumor activity.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з основних напрямів фармацевтичної науки є пошук біологічно активних речовин (БАР) для отримання фармакологічних субстанцій різної направленості дії. Перспективним джерелом для такого пошуку залишаються рослини флори України. Лікарські засоби рослинного походження займають виняткове положення серед препаратів для лікування різноманітних захворювань.

В офіційній та народній медицині України здавна застосовуються представники роду Буркун - Melilotus L. Буркун лікарський - Melilotus officinalis L. є офіцинальним в Україні, Росії та країнах ЄС. Фармакопейним видом в Україні та Росії є також буркун високий - Melilotus altissimus Thuill. За даними наукових першоджерел витяги з буркунів відновлюють та захищають внутрішню оболонку кровоносних і лімфатичних судин, що запобігає утворенню тромбів та емболій. Експериментально доведено, що буркун є ефективним регенератором паренхіми печінки. Екстракти з буркуну лікарського проявляють гіпокоагулянтну, антиагрегаційну, антиоксидантну, гепатопротекторну дію. Сучасні дослідження підтверджують доцільність застосування препаратів буркуну як рослинних адаптогенів з гіпокоагулянтними властивостями в комплексній терапії пацієнтів геронтологічного профілю. Відмічено, що вони покращують функціональний стан пацієнтів після радіоактивного опромінення. Проте, БАР неофіцинальних видів роду Буркун практично не вивчені.

Одним з сучасних підходів до визначення перспективних видів рослин для введення їх до офіцинальної номенклатури є морфолого- і хемотаксономічні дослідження, які дозволяють скласти більш об'єктивну характеристику видів і створюють передумови для вирішення питань класичної систематики. Цей підхід забезпечує умови для прогнозування і виявлення перспективних видів буркунів, як джерел БАР.

Отже, системне фармакогностичне вивчення представників роду Буркун, дослідження БАР, розробка способів одержання фармакологічної активних субстанцій, стандартизація сировини з подальшим створенням на її основі лікарських засобів є актуальними для фармації.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відповідності з планом проблемної комісії "Фармація" МОЗ та АМН України (Протокол № 62 від 17.02.2010 р.), вона є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Національного фармацевтичного університету "Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження" (№ державної реєстрації 0103U000476).

Тему дисертаційної роботи було затверджено на засіданні Вченої ради Національного фармацевтичного університету від 26. 02. 2010 р., протокол № 7.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - фармакогностичне, морфолого- та хемотаксономічне дослідження видів роду Melilotus L. флори України, розробка технологій одержання лікарських субстанцій та встановлення їх фармакологічної активності.

Для досягнення поставленої мети нами вирішувались наступні завдання:

- складення аналітичного огляду першоджерел за результатами фітохімічних, морфологічних та фармакологічних досліджень представників роду Melilotus;

- проведення хімічного та хроматографічного дослідження якісного складу груп та індивідуальних БАР видів роду Melilotus;

- проведення морфолого-таксономічного та хемотаксономічного дослідження роду Melilotus на основі сучасних інформаційних технологій, встановлення таксонів, що можуть бути перспективними для введення до номенклатури офіцинальних видів;

- встановлення кількісного вмісту основних БАР досліджуваних видів за допомогою хімічних та фізико-хімічних методів аналізу;

- визначення флавоноїдного, поліфенольного, жирнокислотного, амінокислотного та мікроелементного складу сировини досліджуваних видів;

- виділення індивідуальних сполук та їх ідентифікація;

- визначення компонентного складу ефірних олій досліджуваних видів;

- розроблення технологічних схем одержання субстанцій буркунів, встановлення їх фармакологічних властивостей;

- проведення хімічного аналізу БАР одержаних екстрактів хімічними та фізико-хімічними методами;

- встановлення морфолого-анатомічних діагностичних ознак сировини видів роду Melilotus;

- розробка проектів методик контролю якості сировини;

Об'єкт дослідження: комплексне дослідження 10 видів роду Melilotus, які ростуть і культивуються в Україні: M. officinalis, M. albus, M. dentatus, M. altissimus, M. polonicus, M. wolgicus, M. arenarius, M. tauricus, M. neapolitanus та M. indicus.

Предмет дослідження: морфолого-таксономічне та хемотаксономічне дослідження представників роду Melilotus та виявлення перспективних видів як джерел БАР; виявлення, кількісне визначення, виділення БАР та ідентифікація індивідуальних сполук; розробка технологій одержання субстанцій на основі сировини досліджуваних видів; стандартизація рослинної сировини.

Методи дослідження: використовували наступні методи дослідження: методи інформаційних технологій та граф-аналізу для морфолого-таксономічного та хемотаксономічного вивчення роду Melilotus; хімічного аналізу; хроматографічного аналізу на папері (ПХ) та в тонкому шарі сорбенту (ТШХ); газорідинної (ГРХ) та газової хроматографії (ГХ); хромато-мас-спектрометрії; УФ-спектрофотометрії; ІЧ-спектрометрії, тривимірної скануючої спектрофлуориметрії.

Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено морфолого-таксономічне дослідження 10 видів та досліджено анатомічні діагностичні ознаки трави 7 видів роду Melilotus флори України.

Вперше хромато-мас-спектрометричним методом визначено якісний склад та кількісний вміст 110 компонентів ефірних олій 7 видів буркунів флори України: б. лікарського, б. білого, б. волзького, б. зубчатого, б. кримського, б. неаполітанського та б. індійського, органічних кислот у траві б. лікарського та б. білого і жирних кислот у траві б. індійського, а також в екстрактах б. лікарського та б. білого.

На основі морфолого-таксономічного дослідження побудовано ієрархічний ряд роду. На основі морфолого- та хемотаксономічного дослідження встановлено взаємозв'язки між окремими видами буркунів, побудовано дендрограми роду.

В результаті хемотаксономічного дослідження на основі терпеноїдного складу трави 7 видів буркунів методом граф-аналізу встановлено перспективні види, що можуть бути застосовані на рівні з M. officinalis, а саме - M. albus та M. indicus.

Вперше проведено комплексне фармакогностичне дослідження M. officinalis та M. albus, в результаті якого встановлено вміст гідроксикоричних кислот, кумаринів, дубильних речовин, флавоноїдів, компонентів ефірних олій, органічних кислот, амінокислот, каротиноїдів, хлорофілів, макро- та мікроелементів.

Вперше визначено якісний склад та кількісний вміст амінокислот у траві б. лікарського, б. індійського та б. білого методом ВЕРХ.

Вперше визначено якісний склад та кількісний вміст фенольних сполук у траві б. лікарського та б. білого методом ВЕРХ.

Вперше визначено кількісний вміст суми флавоноїдів, суми гідроксикоричних кислот, хлорофілів, каротиноїдів у сировині б. лікарського та б. білого.

З трави буркуну лікарського та трави б. білого в індивідуальному стані виділено і встановлено структуру 20 речовин, з них 2 фенолкарбонові кислоти, 7 гідроксикоричних кислот, 3 кумарини, 7 флавоноїдів та циклічний спирт інозитол. 17 речовин виділено з досліджуваної сировини вперше: фенолкарбонові кислоти - саліцилова, галова; гідроксикоричні кислоти - кофейна, ферулова, транс-о-кумарова, хлорогенова, неохлорогенова, ізохлорогенова; кумарин - умбеліферон, флавоноїди - цинарозид, кемпферол, кверцетин, ізокверцитрин, кверцетин-7-O-рамнозид, рутин та циклічний спирт інозитол.

Розроблено технологію одержання біологічно активних субстанцій з трави б. лікарського та трави б. білого, досліджено їх фармакологічну активність (антибактеріальну, антифунгальну, антикоагулянтну та протипухлинну) і визначено токсичність.

Новизна досліджень підтверджена 2 патентами України на корисну модель: «Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з антимікробною дією» (№ 70295 від 11.06.2012) та «Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії» (№ 70294 від 11.06.2012).

Практичне значення одержаних результатів. За результатами досліджень розроблено проект МКЯ «Буркуну білого трава». Розроблено технології одержання субстанцій з трави б. лікарського та трави б. білого, що проявляють антибактеріальну, антифунгальну, антикоагулянтну та протипухлинну активність і можуть бути впроваджені у виробництво для виготовлення нових лікарських засобів.

Результати досліджень впроваджені у науково-дослідну роботу та в навчальний процес кафедр медичної ботаніки, хімії природних сполук і фармакогнозії НФаУ, кафедри фармакогнозії і фармацевтичної хімії Луганського державного медичного університету, кафедри фармакогнозії Запорізького державного медичного університету, кафедри фармації Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, кафедри фармакогнозії, технології ліків і медичної ботаніки Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, кафедри фармації Івано-Франківського національного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Дисертанту належить вирішальна роль у визначенні мети дослідження, шляхів її реалізації, плануванні та проведенні експерименту, інтерпретації та узагальненні одержаних результатів, формуванні основних положень та висновків, що захищаються. Автором проведено літературно-патентний пошук інформаційних джерел про розповсюдження, хімічний склад і використання рослин роду Буркун у науковій та народній медицині. На основі морфолого-таксономічного та хемотаксономічного досліджень виявлено корелятивні зв'язки між морфологічними ознаками і наявністю БАР буркунів та визначено перспективні види. Досліджено якісний склад сировини буркунів, виділено в індивідуальному стані і встановлено будову 20 речовин, з них 2 фенолкарбонові кислоти, 7 гідроксикоричних кислот, 3 кумарини, 7 флавоноїдів та 1 циклічний спирт. Розроблено технологію одержання субстанцій з трави двох видів буркуну та проведено визначення антибактеріальної, антифунгальної, антикоагулянтної та протипухлинної активності одержаних субстанцій і встановлена їх токсичність. Розроблено методи контролю якості на лікарську рослинну сировину «Буркуну білого трава».

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на: Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2008-2011); XV, XVІ, XVІІ і XІХ Російських національних конгресах «Человек и лекарство» (Москва, 2008, 2009, 2012); Ювілейній науково-практичній конференції з міжнародною участю «Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення і перспективи» (Харків, 2009); VII Міжнародному симпозіумі з фенольних сполук (Москва, 2009); Національному з'їзді фармацевтів і молодих вчених (Харків, 2010); Міжнародній науковій конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання сучасної медицини» (Харків, 2011); XV Міжнародному конгресі студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2011); Науково-практичній конференції «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новий Світ, АР Крим, 2011); II Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених та студентів «Здобутки та перспективи розвитку фармацевтичної та медичної галузі в сучасному світі» (Луганськ, 2012); Науково-практичній конференції «Хімія природних сполук» (Тернопіль, 2012); XVI Міжнародній науково-практичній конференції «Problems and ways of modern public health development» (Kiev, London, 2011); XХХ Міжнародній науково-практичній конференції «Problems and ways of modern public health development» (Золотий знак і Золотий диплом за І місце; Лондон, 2012).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 31 наукову працю, з них 8 статей у фахових виданнях України та зарубіжних країн, 2 патенти України на корисну модель, 19 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальних досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел і додатків. Обсяг основного тексту дисертації складає 185 сторінок. Робота ілюстрована 64 рисунками, 55 таблицями. Список використаних джерел містить 190 найменувань, з них кирилицею 113 та латиницею 77.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

фармакогностичний melilotus буркун флора

У вступі обґрунтовані актуальність, наукова новизна та практичне значення теми дисертаційної роботи, сформульовані мета і основні завдання досліджень, показано зв'язок з науковими програмами і планами.

Розділ 1. Сучасний стан фармакогностичного вивчення представників роду Melilotus L. (Буркун) світової флори та флори України (Огляд літератури). Приведено аналітичний огляд сучасного стану досліджень рослин роду Буркун: фармакогностичній характеристиці, використанню в науковій та народній медицині, номенклатурі препаратів з використанням сировини буркунів.

Розділ 2. Пошук перспективних видів Melilotus L. флори України на основі морфолого-таксономічного та хемотаксономічного дослідження. Наведено результати морфолого-таксономічного та хемотаксономічного дослідження роду Melilotus L. та визначення перспективних видів на основі виявлених корелятивних зв'язків. Відомо, що систематизація рослин засновується на суб'єктивному підході до опису рослини, який не завжди об'єктивно показує дійсне положення рослини в ієрархії роду. Виходячи з цього, нами вперше здійснені морфолого- та хемотаксономічні дослідження на основі методу граф-аналізу, які проводились з метою встановлення ієрархії роду та встановлення на основі отриманих результатів перспективних видів як джерел цінних фармакологічних субстанцій. Для систематичної обробки морфологічних ознак буркунів використано морфологічні ознаки 10 видів буркунів, які відносяться до різних підродів: підроду Eumelilotus - M. officinalis (1), M. albus (2) та M. dentatus (3); підроду Macromelilotus - M. altissimus (4), M. polonicus (5) та M. wolgicus (7); підроду Micromelilotus - M. arenarius (6), M. tauricus (8), M. neapolitanus (9) та M. indicus (10). До вихідної таблиці-матриці було вміщено 212 морфологічних таксономічних ознак для 10 видів, таким чином, аналізувалися 2120 позитивних і негативних станів таксономічних ознак. Таблиця служила основою для проведення таксономічного аналізу: розрахунків інформаційної ваги ознак, інформаційної ваги таксонів, коефіцієнтів зустрічальності, оригінальності ознак та своєрідності таксонів. Використовуючи морфологічні ознаки, нами було розраховано коефіцієнти парної і групової спорідненості видів роду Буркун, які закладені в основу ієрархії роду, та побудовано дендрограму (рис. 1).

В основі дендрограми роду знаходиться таксон з найбільшою спорідненістю до досліджуваних видів - M. albus. Найбільшу спорідненість проявили пари видів M. officinalis з M. albus (30%), M. polonicus з M. wolgicus (24%), M. indicus з M. neapolitanus (23%).

В результаті виявлено, що рід розділяється на чотири основні групи (гілки): I - M. albus, M. neapolitanus, M. polonicus; II - M. albus, M. wolgicus; III - M. albus, M. officinalis; IY - M. tauricus, M. arenarius, M. indicus, M. altissimus та M. dentatus. В основі кожної гілки видів знаходиться таксон з найбільшою спорідненістю до них.

Об'єктами хемотаксономічного вивчення стали 7 видів буркунів: підроду Eumelilotus - M. officinalis (1), M. albus (2), M. dentatus (3); підроду Macromelilotus - M. wolgicus (7); підроду Micromelilotus - M. tauricus (8), M. neapolitanus (9), M. indicus (10). Хімічними ознаками буркунів нами були використані сполуки, які входять до складу їх ефірних олій.

Хромато-мас-спектрометричним методом вперше досліджено компонентний склад ефірних олій 7 видів буркунів. В ефірних оліях, отриманих з трави M. officinalis, M. albus, M. indicus, M. dentatus, M. wolgicus, M. tauricus, M. neapolitanus.

Визначено біологічно активні сполуки: ациклічні монотерпеноїди - гераніол, ліналоол та їх естери; моноциклічні монотерпеноїди - терпінен-4-ол; ациклічні сесквітерпеноїди - фарнезен, фарнезол; моноциклічні сесквітерпеноїди - транс--бісаболен, -бісаболен, -сесквіфеландрен, ar-куркумен, -куркумен; біциклічний сесквітерпеноїд - транс--бергамотен, дитерпен - фітол та тритерпен - сквален.

КГС

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Дендрограма роду Буркун флори України за морфологічними ознаками.

Визначені сполуки ефірних олій були використані як хімічні ознаки для хемотаксономічного дослідження. Таким чином, аналізу піддавали 665 позитивних і негативних станів таксономічних ознак. Найбільшу парну спорідненість проявляють пари хемотаксонів M. officinalis з M. albus (35 %), M. dentatus з M. wolgicus і M. neapolitanus (39%), M. wolgicus і M. tauricus (32%). На основі коефіцієнтів парної (КПС) та групової спорідненості (КГС) побудовано дендрограму роду Melilotus за хемоознаками (рис. 2).

КГС

Рис. 2. Дендрограма взаємозв'язків видів роду Буркун на основі хімічних ознак.

Згідно з дендрограмою найбільшу спорідненість з видами досліджуваного континууму має таксон M. neapolitanus (9), який і лежить в основі дендрограми хемотаксонів. Найменша вага притаманна M. albus (2), M. officinalis (1) та M. indicus (10), проте вони мають більше оригінальних хемоознак, зокрема, моно- та сесквітерпеноїди - п-цимен, фарнезол, фарнезилацетон, в-бісаболен.

Найбільшу спорідненість до фармакопейного виду M. officinalis показав M. albus, що створює теоретичне підґрунтя для його подальшого дослідження як джерела БАР. В результаті хемотаксономічного дослідження виявлена основна група таксонів, яка складається з M. neapolitanus (9) і M. tauricus (8), характеристика якої узагальнює хімічний склад БАР континууму видів: наявність кумарину, мелілотової кислоти, бензальдегіду та сквалену.

Було встановлено кореляцію між вмістом окремих сполук і морфологічними ознаками. Так, з наявністю кумарину корелюють (75%) такі ознаки: стебла прямостоячі, листочки обернено-яйцевидні біля нижніх і середніх листків, віночок жовтий (рис. 3).

Розділ 3. Ідентифікація, виділення та встановлення структури біологічно активних речовин з досліджуваних видів буркунів. Якісними хімічними реакціями та хроматографічними методами аналізу в досліджуваних видах ідентифіковано фенольні сполуки: флавоноїди, гідроксикоричні кислоти, кумарини, дубильні речовини, хлорофіли, каротиноїди, сапоніни.

Методом колонкової адсорбційної хроматографії, рехроматографії на поліаміді і силікагелі, препаративної хроматографії на папері та в тонкому шарі сорбенту в індивідуальному стані з буркунів вперше виділено 7 флавоноїдів, 7 гідроксикоричних кислот та 3 кумарини, 2 фенолкарбонові кислоти та циклічний спирт інозитол. Фізико-хімічні властивості сполук, виділених з сировини буркунів, представлено в табл. 1.

Фенолкарбонові та гідроксикоричні кислоти. Речовини 1 - 9 аналізували хроматографічно за допомогою ПХ і ТШХ, за флуоресценцією в УФ-світлі, якісними реакціями з ферум (ІІІ) хлоридом, діазотованою сульфаніловою кислотою з лугом, бромкрезоловим зеленим вони віднесені до фенолкарбонових і гідроксикоричних кислот.

%

Рис. 3. Кореляція кумарину з морфологічними ознаками.

За даними УФ-спектрів, порівнянням фізико-хімічних властивостей з вірогідними зразками речовини ідентифіковано, як: 1 - саліцилова, 2 - галова, 3 - кофейна, 4 - ферулова, 5 - о-гідроксидигідрокорична, 6 - транс-о-кумарова, 7 - хлорогенова, 8 - неохлорогенова, 9 - ізохлорогенова кислоти.

Кумарини. Речовини 10, 11, 12 на підставі якісних реакцій, флуоресценції в УФ-світлі були віднесені до гідроксикумаринів. Присутність в УФ-спектрі інтенсивного максимуму поглинання на ділянці 310-345 нм і наявність в ІЧ-спектрі смуги поглинання при 1710-1730 см-1, яка характерна для валентних коливань карбонільної групи -пірону, дозволяє віднести речовини до похідних кумарину.

Дикумарол виділяли із сировини, яка сушилася повільно і довгий термін зберігалася. Хроматографічно сполуки 10, 11, 12 з блакитною флуоресценцією в УФ-світлі, за значенням Rf та флуоресценцією співпадають з вірогідними зразками кумаринів. На підставі якісних реакцій, флуоресценції в УФ-світлі, вивчення продуктів деструкції кислотою йодидною, даних УФ-, ІЧ-спектрів речовини 10, 11 і 12 були ідентифіковані як кумарин, дикумарол і умбеліферон відповідно.

Флавоноїди. Флавоноїди визначали у спирто-водних витягах, етилацетатних, бутанольних та етилацетатно-спиртових фракціях за допомогою реакцій: ціанідинова проба за Бріантом, реакції з 3% розчином феруму (III) хлориду, плюмбуму ацетатом, реакції Вільсона з борно-лимонним реактивом (на 5-гідроксифлавони і 5-гідроксифлавоноли), реакції з алюмінію хлориду. За хроматографічною рухомістю, флуоресценцією та її зміною в УФ-світлі (354 нм) під впливом реагентів речовини 13, 15, 16 були віднесені до агліконів, а речовини 14, 17, 18 і 19 - до глікозидів.

Таблиця 1

Фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави M. officinalis та M. albus

Примітка*. Система розчинів: 1 - етилацетат - метанол - вода (77:13:10); 2 - хлороформ - етилацетат (4:1); 3 - бензол - етилацетат - мурашина кислота (18:1:1); 4 - 2% розчин оцтової кислоти; 5 - хлороформ - оцтова кислота - вода (13:6:2); 6 - етилацетат - мурашина кислота - вода (10:2:3); 7 - етилацетат - оцтова кислота - мурашина кислота - вода (100:11:11:26).

Результати УФ-спектральних досліджень дозволили попередньо встановити в сполуках 13, 14, 16, 17, 18 та 19 наявність вільних гідроксильних груп в 5, 3' і 4' положеннях; в речовинах 14 і 18 заміщення гідроксилу при С-7; в речовинах 17, 19 заміщення гідроксилу у положенні С-3. За результатами ІЧ-спектрального аналізу, УФ-характеристик виділених флавоноїдів, а також як фізико-хімічними властивостями виділені флавоноїдні сполуки ідентифіковано як: 13 - лютеолін (5,7,3,4'-тетрагідроксифлавон), 14 - цинарозид (7-О--D-глюкопіранозил-5,3',4'-тригідроксифлавон), 15 - кемпферол (3,5,7,4'-тетрагідроксифлавон), 16 - кверцетин (3,5,7,3',4'-пентагідроксифлавон), 17 - ізокверцитрин (3-O-в-D-глюкопіранозил-5,7,3',4'-тетрагідроксифлавон), 18 - кверцетин-7-O-рамнозид, 19 - рутин (кверцетин-3-O-в-D-глюкопіранозил-O-б-L-рамнопіранозид). Вперше з трави б. лікарського виділено інозитол (20) - цис-1,2,3,5-транс-4,6-циклогексанол, ідентифікацію якого проводили за температурою плавлення та хромато-мас-спектрометрично за індексом утримання - 1375 на колонці Carbowax20M. У витягах з трави, одержаних сумішшю розчинників етилацетат з етанолом (8:2) в сумі летких сполук інозитол склав 28,15%; ізопропанолом - 75,50%; 80% етанолом - 89,84%.

Розділ 4. Спектрофотометричне та хромато-мас-спектрометричне визначення якісного складу та кількісного вмісту біологічно активних речовин в досліджуваних видах буркунів. Методом хромато-мас-спектрометрії визначено кумарин і дигідрокумарин в сировині усіх видів буркунів, проте не виявлено в M. dentatus і M. wolgicus, тобто ці види є безкумариновими. Один зразок трави M. dentatus містив незначну кількість кумарину. У цих же видах відсутній кумаран (2,3-дигідробензофуран).

Кількісне визначення суми флавоноїдів проводили з використанням методів прямої та диференційної спектрофотометрії. Вміст флавоноїдів у перерахунку на лютеолін при 330 нм у траві б. лікарського становить 2,280,04%, у траві б. білого - 1,730,02%. Кількісний вміст гідроксикоричних кислот у перерахунку на хлорогенова кислоту в обох видах становить 1,080,03%. Кількісний вміст кумаринів в обох видах буркунів виявився однаковим - 1,060,02%. Вміст поліфенолів у траві б. білого склав 1,500,02%, б. лікарського - 1,530,01%, б. індійського - 1,690,02%. Визначення хлорофілів та каротиноїдів проводили методом скануючої спектрофлуориметрії та спектрофотомерії.

Карбонові, фенолкарбонові, гідроксикоричні та жирні кислоти. Встановлено, що у листі, квітках та плодах буркуну лікарського міститься 9 карбонових і 7 ароматичних кислот; у листі, квітках і плодах буркуну білого - 6 карбонових і 13 ароматичних кислот. В листі буркуну лікарського накопичуються о-гідроксикорична, ванілінова та саліцилова кислоти, у плодах і квітках - бензойна, саліцилова і ванільна кислоти. Цікаво відмітити наявність ізоферулової кислоти у листі і плодах, та відсутність її у квітках. Унікальною є гентизинова кислота. Основними карбоновими кислотами листя є (мг на 1кг сировини) малонова - 10034, бурштинова - 2248 та яблучна - 2521. У буркуні білому домінуючою ароматичною кислотою є саліцилова кислота, найбільше її у квітках. Плоди буркуну білого містить бензойну, фумаролу, саліцилову та о-гідроксикоричну кислоти. Унікальним компонентом листя є 4-гідроксіацетат-3-метоксикорична кислота. Для листя і квіток характерна 2-гідрокси-3-метилглутарова кислота. Для квіток і плодів буркуну білого основними карбоновими кислотами є (мг на 1кг сировини) лимонна - 8120, 15152, малонова - 4295, 8057, щавлева - 2750, 6792 і яблучна - 1267, 1181 відповідно. У плодах буркуну білого значно накопичується бурштинова кислота - 1559.

У квітках б. індійського визначено та ідентифіковано 13 жирних кислот, в листі - 12. У квітках переважають пальмітинова та міристинова кислоти, в листі - ліноленова та пальмітинова.

Амінокислоти. Визначено амінокислотний склад у траві трьох видів: б. індійському, б. лікарському та б. білому. Всього виявлено та ідентифіковано 23 амінокислоти, з яких 10 незамінні. Домінуючими амінокислотами буркунів є: аспарагінова, глютамінова кислоти, аргінін та лейцин. Найбільшу кількість аспарагіну, аспарагінової та глютамінової кислот накопичує б. білий. Б. лікарський накопичує пролін, серин, аспарагінову та глютамінову кислоти. Особливістю б. індійського є накопичення аланіну, серину та г-аміномасляної кислоти.

Дослідження елементного складу б. лікарського та б. білого. З метою з'ясування відповідності вимогам ДФУ (Доповнення 2) щодо вмісту токсичних елементів у сировині, а також з метою розробки МКЯ на сировину, вперше проведено дослідження трави б. лікарського та б. білого методом атомно-емісійної спектрографії. У зразках виявлено 13 елементів: 3 макро- та 10 мікроелементів. Згідно зменшення їх вмісту у сировині встановленно такий ряд: у траві б. лікарського - К> Са > Mg > Fe > Mn > Al > Sr > Cu = Мо >Ni > Со > Pb; у траві б. білого - К> Са > Mg > Fe > Mn = Al > Sr > Cu >Ni > Мо > Со = Pb. Вміст важких металів знаходиться в межах концентрацій допустимих для сировини та харчових продуктів, що відповідає вимогам ДФУ.

Розділ 5. Розробка технології екстрактів буркуну лікарського і буркуну білого, визначення їх хімічного складу та фармакологічної активності. Нами отримано субстанції Мелісепт Л та Мелісепт Б трави б. лікарського та трави б. білого. Проведено вивчення антимікробної, антикоагулянтної, протипухлинної активностї отриманих екстрактів, встановлена їх гостра токсичність.

Мелісепт Л і Мелісепт Б (ліпофільні комплекси) отримували методом перколяції, як екстрагент використовували хлороформ. Вихід густого екстракту Мелісепт Б становить 3,58%, вихід густого екстракту Мелісепт Л - 3,32%. В Мелісепті Л і Мелісепті Б визначені жирні кислоти, хлорофіли, каротиноїди і незначний вміст кумаринів.

Субстанції, що містять комплекси ліпофільно-фенольних сполук б. лікарського - Меліфен Л і б. білого - Меліфен Б отримували методом перколяції, як екстрагент використовували етилацетат. В Меліфені Л і Меліфені Б визначені жирні кислоти (табл. 2.).

Таблиця 2

Компонентний склад жирних кислот Мелісепту Б та Мелісепту Л

Дослідження жирнокислотного складу ліпофільних комплексів Меліфену Л та Меліфену Б проводили методом хромато-мас-спектрометрії, використовуючи як внутрішній стандарт розчин 50 мкг тридекану в гексані, як метилуючий агент 14% розчин бору (ІІІ) хлорид в метанолі, Supelco на хроматографі Agilent Technology 6890N із мас-спектрометричним детектором 5973N. Вміст речовин розраховували відносно внутрішнього стандарту. В Меліфені Л і Меліфені Б хлорофіли, каротиноїди фенолкарбонові і гідроксикоричні кислоти, кумарини, флавоноїди.

Вивчення цитотоксичної дії та гострої токсичності рослинних екстрактів проведено при консультаційній допомозі професора кафедри біологічної та медичної хімії з курсом фізколоїдної та біонеорганічної хімії ІФНМУ Клименка А.О. Цитотоксичну дію рослинних екстрактів на клітини асцитного раку Ерліха у мишей вивчали за методикою Р.А. Шрека. Про цитолітичну дію досліджуваних екстрактів робили висновок на основі процентного вмісту забарвлених еозином (мертвих) клітин. Отримані результати представлено в табл. 3.

Таблиця 3

Цитотоксична дія Мелісепту Л і Мелісепту Б на клітини асцитного раку Ерліха

Як видно з приведених даних (табл. 6) найбільш виражену цитотоксичну дію на ракові клітини завдають густий екстракт буркуна білого Мелісепт Б, який у дозі 100 мг у 23,4 % викликає загибель ракових клітин.

Аналіз антибактеріальної активності Мелісепту Л та Мелісепту Б проводили на базі ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова НАМН України» у лабораторії біохімії мікроорганізмів та поживних середовищ за консультативної допомоги наукового співробітника Н. В. Кашпур. Аналіз показав чутливість до них як грам-позитивної, так і грам-негативної флори. Аналіз антибактеріальної активності Меліфену Л та Меліфену Б показав чутливість до них як грам-позитивної, так і грам-негативної флори, а також Candida аlbicans. На особливу увагу заслуговує антимікробна активність Меліфену Л по відношенню до P. аeruginosa. Зона затримки росту складає 22 мм.

Нами розроблено спосіб одержання сухого екстракту (комплексу полісахаридів) з трави б. білого. Хроматографічно у гідролізаті встановлено моносахариди: арабіноза, галактоза, ксилоза, рамноза, глюкоза, фруктоза, мальтоза та галактуронова кислота. Дослідження антикоагулянтної активності та токсичності сухого водорозчинного комплексу проводили на кафедрі біології, фізіології та анатомії людини НФаУ за консультативної допомоги завідувача кафедри д. фарм. н. професора Малоштан Л.М. Встановлено, що сухий екстракт б. білого достовірно збільшував час зсідання крові, у порівнянні з контрольною групою тварин, і не поступався референс-препарату «Варфарин», що підтверджує його антикоагулянту дію. За результатами досліджень гострої токсичності густих екстрактів Меліфен Л, Меліфен Б, Мелісепт Л та Мелісепт Б за класифікацією К.К. Сидорова та ГОСТ 12.1.007-76 можна віднести до VI класу токсичності - відносно нешкідливі речовини; сухий екстракт до V класу токсичності - практично нетоксичні речовини.

Розробка проектів методів контролю якості на сировину. З метою стандартизації сировини досліджено макро- та мікроскопічних ознаки трави б. білого, встановлено діагностичні ознаки анатомічної будови; визначено числові показники доброякісності сировини: втрата в масі при висушуванні, важкі метали; проведено ідентифікацію кумаринів та гідроксикоричних кислот методом тонкошарової хроматографії. Розроблено проект МКЯ «Буркуну білого трава». Складено опис, ідентифікацію та випробування методом тонкошарової хроматографії, кількісне визначення кумарину.

Морфолого-анатомічне дослідження. Нами було встановлено ряд спільних і відмітних ознак буркунів. Спільними ознаками є: загальна будова стебла та епідерма стебла, наявність простих та головчастих волосків у всіх досліджених буркунах. Для видів підроду Micromelilotus: M. arenarius, M. tauricus, M. neapolitanus та M. indicus характерна наявність двох типів палісадних клітин (високих і низьких) насінної шкірки. Основні відмітності спостерігаються у будові бобів. Боби відрізняються за розмірами, формою та характером поверхні: зморшкуваті (б. польський), сітчасто-комірчасті (б. зубчастий), сітчасто-зморшкуваті (б. високий, б. білий та б. піщаний), поперечно-зморшкуваті (б. лікарський) та поперечно-складчасто-зморшкуваті (б. кримський).

ВИСНОВКИ

Вперше проведено морфолого-таксономічне 10 видів, хемотаксономічне і фармакогностичне дослідження 7 видів роду Melilotus флори України; встановлено вміст гідроксикоричних кислот, кумаринів, дубильних речовин, флавоноїдів, компонентів ефірних олій, органічних кислот, амінокислот, каротиноїдів, хлорофілів, макро- та мікроелементів; визначено перспективні види як джерела отримання БАР, на основі яких отримані фармакологічні лікарські субстанції з антимікробною, протипухлинною та антикоагулянтною дією; розроблено проекти МКЯ на сировину.

1. Вперше проведено морфолого-таксономічне дослідження 10 видів та хемотаксономічне дослідження 7 видів буркунів флори України. На основі хемотаксономічного дослідження виявлено основну групу таксонів, характеристика якої узагальнює хімічний склад БАР роду Melilotus L., складено ієрархічний ряд видів роду. За результатами хемотаксономічного дослідження встановлено перспективний вид буркуну як джерела БАР: б. білий, який потребує поглибленого вивчення.

2. Вперше досліджено якісний та кількісний склад компонентів ефірних олій 7 видів буркунів. Хромато-мас-спектрометричним методом визначено БАР: ациклічні монотерпеноїди - гераніол, ліналоол та їх ефіри; моноциклічні монотерпеноїди - терпінен-4-ол; ациклічні сесквітерпеноїди - фарнезен, фарнезол; моноциклічні сесквітерпеноїди - транс--бісаболен, -бісаболен, -сесквіфеландрен, ar-куркумен, -куркумен; біциклічний сесквітерпеноїд - транс--бергамотен, дитерпен - фітол та тритерпен - сквален.

3. Ідентифіковано та визначено вміст кумаринів, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин. За допомогою хімічних, фізико-хімічних та хроматографічних методів встановлено наявність у досліджуваних видах амінокислот, органічних кислот, ефірної олії, хлорофілів, каротиноїдів, гідроксикоричних кислот та флавоноїдів.

4. З трави б. білого та б. лікарського виділено та ідентифіковано 20 речовин. На основі фізико-хімічних властивостей, продуктів хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ-спектроскопії та порівнянням з вірогідними зразками ідентифіковано: 2 фенолкарбонові кислоти - саліцилова та галова, 7 гідроксикоричних кислот - ізохлорогенова, кофейна, ферулова, хлорогенова, неохлорогенова, о-гідроксикорична та о-кумарова, фенолкарбонова кислота - галова, 3 кумарини - кумарин, дикумарин та умбеліферон, 7 флавоноїдів - лютеолін, кемпферол, кверцетин, кверцетина-7-О-рамнозид, ізокверцитрин, цинарозид та рутин, та циклічний спирт - інозитол.

5. Вперше розроблено технології одержання густих екстрактів: Мелісепт Л, Мелісепт Б, Меліфен Л та Меліфен Б з трави б. лікарського та б. білого, сухого екстракту (комплексу полісахаридів) трави б. білого. Вперше методом хромато-мас-спектрометрії було дослідженно компонентний склад ефірних олій та жирних кислот субстанцій Мелісепт Л, Мелісепт Б. Новизну розроблених оригінальних способів одержання біологічно активних комплексів з трави б. лікарського та трави б. білого підтверджено патентами України на корисну модель.

6. Визначено фармакологічну активність: антимікробну, антифунгальну, протипухлинну та гостру токсичність Мелісепту Л, Мелісепту Б, Меліфену Л, Меліфену Б; антикоагулянтну активність, гостру токсичність полісахаридного комплексу трави б. білого.

7. З метою ідентифікації сировини визначено основні анатомічні діагностичні ознаки 7 видів буркунів; виявлено відмітності між видами роду Melilotus флори України.

8. Розроблено проект МКЯ: «Буркуну білого трава». Складено опис, ідентифікацію та випробування за методом тонкошарової хроматографії, кількісне визначення кумарину і флавоноїдів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Хімічне дослідження ліпофільних біологічно активних речовин трави Melilotus officinalis / А. М. Ковальова, І. В. Грудько, А. М. Комісаренко, О. М. Гриценко // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім. П. Л. Шупика. - 2009. - Вип. 18, кн. 3. - С. 438 445. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

2. Хромато-мас-спектрометричне визначення компонентів ефірної олії буркуну лікарського / А. М. Ковальова, І. В. Грудько, А. М. Комісаренко, О. М. Кошовий // Вісник фармації. - 2009. № 4. С. 12 15. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

3. Ароматичні сполуки коренів буркуну лікарського / А. М. Ковальова, І. В. Грудько, Т. В. Ільїна, С. В. Русанова // Вісник фармації. - 2010. - № 4. С. 59 61. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

4. GC/MS study of the chloroform fraction of Melilotus officinalis / A. M. Kovaleva, I. V. Grud'ko, A. N. Aleksandrov, A. N. Komissarenko // Chemistry of Natural Compounds. 2009. - Vol. 45, № 4. P. 585 586.

5. Ковалева А. М. Биологически активные вещества видов рода Melilotus и их антимикробная активность / А. М. Ковалева, И. В. Грудько, Т. В. Ильина // Сборник научных трудов Пермской фармацевтической академии. - 2011. - С. 43 - 45. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

6. Исследование карбоновых кислот листьев, цветков и плодов донника лекарственного (Melilotus officinalis L.) / И. В. Грудько, А. М. Ковалева, Т. В. Ильина // Український медичний альманах. - 2012. Том 15 - № 5. С. 69 70. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

7. Ковальова А. М. Порівняльна характеристика видів підродів Micromelilotus та Mаcromelilotus роду Melilotus Mill. за компонентним складом ефірних олій та морфологічною будовою / А. М. Ковальова, І. В. Грудько // Збірник наукових праць співробітників НМАПО ім. П. Л. Шупика. - 2012. - Вип. 21, кн. 4. С. 289 296. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

8. Ковальова А. М. Порівняльна характеристика видів підроду Eumelilotus роду Melilotus Mill. за компонентним складом ефірних олій та морфологічною будовою / А. М. Ковальова, І. В. Грудько // Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики. - 2012. №3 (10) - С. 7 10. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

9. Грудько И. В. Хромато-масс-спектрометрическое определение компонентов эфирных масел донника белого донника крымского и донника волжского / И. В. Грудько, А. М. Ковалева, Я. С. Колесник // Problems and ways of modern public health development : мaterials digest of the XVI International Scientific and Practical Conference, Kiev, London, December 21 - 26, 2011. - Kiev, 2011. C. 177 179. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

10. Грудько И. В. Карбоновые кислоты листьев, цветков и плодов донника белого / И. В. Грудько, А. М. Ковалева, Т. В. Ильина // Problems and ways of modern public health development : мaterials digest of the XХ International Scientific and Practical Conference, Kiev, London, August 16 - 23, 2012. - Kiev, 2012. C. 111 - 113. (Особистий внесок - участь у постановці завдань дослідження, визначення якісного складу та кількісного вмісту основних груп БАР, математична обробка результатів, написання статті).

11. Патент на корисну модель № 70295, МПК А61К 36/71, 135/00 А61P 31/04. Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з антимікробною дією / Грудько І. В., Кашпур Н. В., Ковальова А. М., Комісаренко А. М., Ільїна Т. В., Абдулкафарова Е. Р., Очкур О. В., Горяча О. В., Волянський А. Ю. (Україна). № u 2011 12458; заявл. 24.10.2011; опубл.11.06.2012, Бюл. №11. 6 с. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних дослідженнях, обробці одержаних результатів, оформленні патенту)