Фармакогностичне дослідження видів роду Artemisia L. флори України

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ВИДІВ РОДУ ARTEMISIA L. ФЛОРИ УКРАЇНИ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

ОЧКУР ОЛЕКСАНДР ВАСИЛЬОВИЧ

Харків 2014

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор Ковальова Алла Михайлівна, професор кафедри фармакогнозії, Національний фармацевтичний університет,

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор Мазулін Олександр Владиленович, завідувач кафедри фармакогнозії, фармацевтичної хімії та технології ліків ФПО, Запорізький державний медичний університет

кандидат фармацевтичних наук, доцент Дармограй Роман Євдокимович, завідувач кафедри фармакогнозії і ботаніки, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького

Захист відбудеться “16” травня 2014 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “14” квітня 2014 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

професор В. А. Георгіянц

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним з важливих завдань фармакогнозії є пошук нових рослинних джерел біологічно активних речовин (БАР) серед видів флори України, що мають достатню сировинну базу, та створення на їх основі лікарських засобів. Внаслідок великого поширення серед інфекцій антибіотикорезистентних штамів патогенних мікроорганізмів надзвичайної ваги набуває пошук антибактеріальних засобів рослинного походження, які відрізняються від синтетичних препаратів уповільненим розвитком резистентності до них у мікроорганізмів через різноманітність хімічного складу даних засобів. У зв'язку з цим цінними джерелами БАР є види роду Полин (Artemisia L.) родини Айстрові (Asteraceae).

Рід Полин нараховує у світовій флорі близько 500 видів та більше 30 видів у флорі України. Єдиним офіцинальним видом є полин гіркий (Artemisia absinthium L.), який входить до Державної Фармакопеї України та Європейської Фармакопеї. Дослідження БАР видів роду Полин характеризується певною фрагментарністю. З наукових першоджерел відомо, що БАР полинів представлені гідроксикоричними кислотами, кумаринами, флавоноїдами, псевдоалкалоїдами, ароматичними терпеноїдами, моно-, сесквітерпеноїдами та сесквітерпеновими лактонами. Рослини роду Полин широко застосовуються у офіційній та народній медицині як стимулюючі апетит, жовчогінні, протигельмінтні, антималярійні, протипухлинні, протизапальні та антимікробні засоби.

Широкий спектр та біологічна дія БАР видів роду Полин створюють передумови для комплексного дослідження сировини видів роду з метою розробки субстанцій з антибактеріальною активністю. Саме тому фармакогностичне дослідження, вивчення антибактеріальних та токсичних властивостей представників роду Artemisia L. флори України є актуальним завданням сучасної фармацевтичної науки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у відповідності з планом проблемної комісії «Фармація» МОЗ та АМН України (Протокол № 54 від 15.10.2008 р.), вона є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Національного фармацевтичного університету «Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження» (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є пошук нових сировинних джерел БАР серед представників роду Artemisia L. флори України та їх фармакогностичне дослідження, створення на їх основі фармакологічно активних субстанцій для подальшого введення до номенклатури вітчизняних офіцинальних лікарських рослин.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

· проаналізувати та узагальнити дані наукових першоджерел про склад БАР, фармакологічну активність та народногосподарське значення видів роду Полин;

· провести порівняльне фітохімічне та хемотаксономічне дослідження видів роду Artemisia L. флори України з метою встановлення перспективних об'єктів для подальшого комплексного фармакогностичного дослідження;

· ідентифікувати та визначити вміст основних БАР у сировині досліджуваних видів;

· визначити основні технологічні параметри одержання субстанцій, що виявляють антибактеріальну активність, ідентифікувати та визначити вміст основних БАР в одержаних субстанціях;

· визначити морфолого-анатомічні діагностичні ознаки сировини досліджуваних видів;

· розробити проекти МКЯ на рослинну сировину нових видів роду Полин.

· встановити антимікробну активність та токсичність одержаних субстанцій.

Об'єкт дослідження. Фармакогностичне дослідження трави 14 видів роду Полин флори України.

Предмет дослідження. Виявлення та ідентифікація БАР, визначення їх вмісту в сировині видів роду Полин та одержаних субстанціях; встановлення морфолого-анатомічних діагностичних ознак сировини досліджуваних видів; визначення основних технологічних параметрів одержання субстанцій з сировини; дослідження антимікробної активності одержаних субстанцій.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань були застосовані методи аналізу: товарознавчі - встановлення показників якості сировини; фізичні - визначення втрати в масі при висушуванні, загальної золи, розчинності, температури плавлення; фізико-хімічні - хроматографія на папері (ПХ) та в тонкому шарі сорбенту (ТШХ), газорідинна хроматографія (ГРХ), високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ), спектрофотометрія в УФ- та видимій областях спектру, атомно-емісійна спектрофотометрія, газова хромато-мас-спектрометрія (ГХ-МС), тривимірна скануюча спектрофлуориметрія; хімічні методи якісного та кількісного аналізу; технологічні - вибір екстрагенту, встановлення співвідношення сировина - екстрагент, терміну і температури екстракції; хемотаксономічні, мікроскопічні - вивчення мікропрепаратів з поверхні та поперечних зрізів. Фармакологічні дослідження проводили in vivo та in vitro з використанням стандартних методик. Статистичну обробку результатів експериментів проводили згідно з вимогами ДФУ.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше на основі результатів фізико-хімічного аналізу у 14 видах полинів ідентифіковано 292 речовини: 10 ароматичних та 16 аліфатичних карбонових кислот, 10 гідроксикоричних кислот, 5 кумаринів, 6 флавоноїдів, 176 терпеноїдів та їх дериватів, 17 вуглеводнів та їх похідних, 22 амінокислоти, 28 жирних кислот, 2 хлорофіли.

Вперше на основі результатів вивчення компонентів ефірних олій проведено порівняльний хімічний та хемотаксономічний аналіз 14 видів роду Artemisia L. флори України. Ідентифіковано та встановлено вміст 191 компоненту ефірних олій, серед яких терпеноїди та їх похідні, ароматичні сполуки тощо. Встановлено хімічний профіль ефірних олій дослідженого континууму видів, який характеризується такими сполуками, як ациклічний терпеноїд ліналоол, моноциклічний монотерпеноїд терпінен-4-ол, біциклічні монотерпеноїди: 1,8-цинеол, б-туйон; ароматичний терпеноїд евгенол; сесквітерпеноїди: б-бісаболол, б-копаєн, спатуленол, каріофіленоксид, сальвіаль-4(14)-єн-1-он, тритерпен сквален; терпеноїдний кетон гексагідрофарнезилацетон.

Проведено комплексне фармакогностичне дослідження трави 5 видів роду Полин флори України - п. звичайного, п. гіркого, п. австрійського, вперше - п. лікарського та п. естрагону. Визначено основні анатомо-діагностичні ознаки та числові показники якості сировини. Вперше у траві п. естрагону ідентифіковано розмаринову та п-кумарову кислоти, у траві п. лікарського - кумарин, у траві п. австрійського - 6,8-диметокси-7-гідроксикумарин. Вперше у траві п. гіркого та загалом у видах роду Полин ідентифіковано аутемілін. З трави п. звичайного, п. австрійського та п. лікарського виділено та встановлено структуру 11 речовин - 3 гідроксикоричних кислот: кофейної, ферулової та хлорогенової; фенолкарбонової кислоти - саліцилової; 6 флавоноїдів: апігеніну, лютеоліну, артемізетину, кверцетину, ізокверцитрину, рутину; гідроксикумарину - скополетину. полин фармакологічний хемотаксономічний фітохімічний

Розроблено технологічні схеми та одержано 13 субстанцій з антимікробною активністю: з трави п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону одержано ліпофільні (ЛК) та фенольні (ФК) комплекси; вперше з трави п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського - модифіковані густі екстракти (МГЕ).

Вперше за допомогою методу ГХ-МС досліджено компонентний склад трави, ЛК та ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону і МГЕ п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського. Компонентний склад ЛК представлений терпеноїдами, аліфатичними вуглеводнями та їх похідними, вищими жирними кислотами та їх естерами, хлорофілами, каротиноїдами; компонентний склад ФК - ароматичними сполуками, фенолкарбоновими та гідроксикоричними кислотами, кумаринами, флавоноїдами, терпеноїдами, жирними кислотами та їх естерами; компонентний склад МГЕ - терпеноїдами, ароматичними сполуками, жирними кислотами та їх естерами, купрум-порфіринами.

За результатами товарознавчих, морфолого-анатомічних та фітохімічних досліджень розроблено проекти МКЯ «Полину звичайного трава» та «Полину австрійського трава».

Вперше встановлено антимікробну активність одержаних субстанцій та встановлено кореляційні зв'язки між вмістом основних БАР, які містяться у субстанціях, та їх антимікробною дією. Вперше встановлено цитостатичну дію ФК п. гіркого. Визначено гостру токсичність ЛК та ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону.

Новизну досліджень підтверджено патентами України на винахід «Спосіб одержання засобу з антимікробною активністю з рослинної сировини» (№ 104173, Бюл. № 1 від 10.01.2014) та «Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії» (№ 104174, Бюл. № 1 від 10.01.2014).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено основні технологічні параметри одержання з сировини п'яти видів полинів субстанцій з антимікробною активністю: ЛК та ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону, МГЕ п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського.

Розроблено проекти МКЯ «Полину звичайного трава», «Полину австрійського трава».

Виявлені популяції та місця зростання виду A. absinthium L., ефірні олії яких не містять туйону.

Результати досліджень впроваджено в навчальний процес до модулю «Фармацевт-фармакогност» Казахського національного медичного університету ім. С. Д. Асфендіярова, кафедри фармакогнозії і хімії Південно-Казахстанської державної фармацевтичної академії, кафедри фармації Івано-Франківського національного медичного університету, кафедри фармакогнозії і ботаніки Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького, кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно:

- здійснено критичний аналіз наукових першоджерел щодо складу БАР, фармакологічної активності та народногосподарського значення видів роду Полин;

- проведено порівняльне фітохімічне та хемотаксономічне дослідження 14 видів роду Полин флори України з метою встановлення перспективних об'єктів для комплексного фармакогностичного дослідження;

- проведено виявлення, ідентифікація та визначення вмісту БАР у сировині п. гіркого, п. звичайного, п. австрійського, п. лікарського та п. естрагону;

- розроблено основні технологічні параметри одержання ЛК та ФК з трави п. гіркого, п. звичайного, п. австрійського, п. лікарського і п. естрагону та МГЕ з трави. гіркого, п. звичайного і п. австрійського;

- досліджено якісний склад та вміст основних БАР в одержаних субстанціях;

- визначено морфолого-анатомічні діагностичні ознаки трави п. гіркого, п. звичайного, п. австрійського, п. лікарського та п. естрагону;

- розроблено проекти МКЯ «Полину звичайного трава», «Полину австрійського трава».

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи опубліковано в матеріалах науково-практичних конференцій та обговорено на наукових форумах різного рівня: Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2010, 2011, 2012, 2013); Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010, 2012, 2013); VII Національному з'їзді фармацевтів України «Фармація України. Погляд у майбутнє» (Харків, 2010); IV Національному з'їзді фармакологів України (Харків, 2010); Научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Пермской государственной фармацевтической академии «Актуальные проблемы науки фармацевтических и медицинских вузов: от разработки до коммерциализации (Пермь, 2011); Научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, 2011, 2013); Всеукраїнській науково-практичній конференції «ХV Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених» (Тернопіль, 2011); XVI Международной научно-практической конференции «Проблемы и пути развития современного здравоохранения» (Одесса, Киев, Лондон, 2011); VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012); ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених та студентів «Здобутки та перспективи розвитку фармацевтичної та медичної галузі в сучасному світі» (Луганськ, 2012); VII Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Калининград, 2013); Х Международном симпозиуме по химии природных соединений (Ташкент, Бухара, 2013); І Міжнародній науково-практичній internet - конференції «Теоретичні та практичні аспекти дослідження лікарських рослин» (Харків, 2014).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 41 наукову працю, в тому числі 13 статей у вітчизняних та закордонних фахових виданнях, 2 патенти України, 26 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукових першоджерел, чотирьох розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, списку використаних наукових першоджерел, додатків. Обсяг основного тексту складає 143 сторінки. Робота ілюстрована 41 таблицею, 14 рисунками, 7 схемами. Бібліографія містить 173 літературних джерел, з них 102 кирилицею та 71 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, мету, наукову новизну та практичне значення дисертаційної роботи.

Розділ 1. Сучасний стан вивчення роду Artemisia L. Огляд наукових першоджерел. Аналіз наукових першоджерел вказує, що види роду Полин широко розповсюджені у флорі України, містять різноманітні БАР, здавна використовуються в народній медицині, харчовій та парфумерній промисловості, виявляють різноманітну фармакотерапевтичну дію. Однак було встановлено, що хімічний склад рослин вивчено несистематично, відсутні комплексні дослідження БАР більшості видів роду Полин флори України. З урахуванням широкого розповсюдження, значної сировинної бази, біологічної активності сполук перспективним є проведення фітохімічних та фармакологічних досліджень ряду видів полинів та створення на їх основі нових лікарських засобів.

Розділ 2. Об'єкти та методи дослідження. Попередня ідентифікація біологічно активних речовин. Визначено об'єкти, вказано методи дослідження, реактиви та прилади, які застосовували під час попереднього дослідження трави 14 видів роду Полин, комплексного фармакогностичного та фармакологічного дослідження трави п. гіркого, п. звичайного, п. австрійського, п. лікарського, п. естрагону та одержаних з них ефірних олій та субстанцій.

Об'єктами порівняльного фітохімічного і хемотаксономічного дослідження стали 14 видів роду Полин (Artemisia L.), що відносяться до трьох підродів. Підрід Artemisia Less.: A. vulgaris L. (п. звичайний) - секція Artemisia; A. abrotanum L. (п. лікарський) та A. annua L. (п. однорічний) - секція Abrotanum; A. caucasica Willd. (п. кавказький), A. austriaca Jacq. (п. австрійський) та A. absinthium L. (п. гіркий) - секція Absinthium. Підрід Dracunculus Bess.: A. dracunculus L. (п. естрагон) - секція Dracunculus Bess.; A. arenaria DC. (п. пісковий), A. campestris L. (п. польовий), A. marschalliana Spreng. (п. Маршаллів) та A. scoparia W. (п. віниковий) - секція Campestres Korobkov. Підрід Seriphidium Rouy: A. nutans Willd. (п. пониклий), A. taurica Willd. (п. таврійський) та A. balchanorum Krash. (п. лимонний) - секція Seriphidium Bess. Сировину для дослідження заготовляли у фази бутонізації та цвітіння рослин на території Харківської, Луганської, Київської, Сумської, Херсонської областей та АР Крим у 2009-2013 рр. Встановлення видової тотожності зразків трави полинів проведено за консультативної допомоги канд. біол. н. Ю. Г. Гамулі, доц. кафедри ботаніки та екології рослин Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.

У траві досліджуваних видів роду Полин за допомогою хімічних та фізико-хімічних методів попередньо ідентифіковано сполуки первинного (цукри, карбонові кислоти, амінокислоти) та вторинного (фенолкарбонові кислоти, гідроксикоричні кислоти, гідроксикумарини, флавоноїди, дубильні речовини конденсованої групи, сапоніни тритерпенової групи) метаболізму.

Розділ 3. Визначення вмісту біологічно активних сполук у траві, ефірних оліях досліджуваних видів роду Artemisia L. Встановлення перспективних видів на основі хемотаксономічного аналізу. За допомогою методу ГХ-МС досліджено компонентний склад ефірних олій, одержаних з трави п. звичайного, п. лікарського, п. однорічного, п. кавказького, п. гіркого, п. австрійського, п. естрагону, п. піскового, п. польового, п. Маршаллів, п. віникового, п. пониклого, п. таврійського та п. лимонного. Хромато-мас-спектрометричні дослідження проводили за консультативної допомоги провідного інженера лабораторії хроматографії Інституту винограду та вина «Магарач» Б. О. Виноградова. Ідентифіковано та встановлено вміст 191 компоненту ефірних олій, серед яких терпеноїди (моно-, сескві-, ди- та тритерпеноїди) та їх похідні, ароматичні сполуки, жирні кислоти. Найбільший вихід ефірної олії в перерахунку на повітряно-суху сировину отримано з трави п. піскового (1,77%) та п. лікарського (1,31%), найменший - з трави п. віникового (0,01%) та п. звичайного (0,07%). В ефірних оліях трави досліджуваних видів полинів виявлено різну кількість сполук: п. звичайного - 52, п. лікарського - 29, п. однорічного - 46, п. кавказького - 36, п. австрійського - 46, п. гіркого - 61, п. естрагону - 49, п. піскового - 24, п. польового - 48, п. Маршаллів - 39, п. віникового - 46, п. пониклого - 35, п. таврійського - 27, п. лимонного - 32.

На основі хемотаксономічного аналізу 14 видів роду Artemisia L., використовуючи як маркери терпеноїдні та ароматичні сполуки ефірних олій, було встановлено хімічний профіль роду Artemisia L. Виявлено, що рід характеризується наявністю таких сполук, як ациклічний терпеноїд ліналоол; моноциклічний монотерпеноїд терпінен-4-ол; біциклічні монотерпеноїди 1,8-цинеол, б-туйон; ароматичний терпеноїд евгенол; сесквітерпеноїди б-бісаболол, б-копаєн, спатуленол, каріофіленоксид, сальвіаль-4(14)-єн-1-он; тритерпен сквален і терпеноїдний кетон гексагідрофарнезилацетон. Ці сполуки виявлено у представників усіх досліджених секцій, тобто вони є типовими для видів досліджуваного континууму. За нашими розрахунками коефіцієнти оригінальності цих сполук менше або дорівнюють нулю. Найбільшу спорідненість до континууму показав вид A. nutans Willd., який і очолив ієрархічний ряд. Найбільшу хемотаксономічну спорідненість до нього мають A. taurica Willd. та A. abrotanum L. - на рівні 38% та 37% відповідно. Поширеними, тобто такими, що містяться у 28 - 45 % видів, сполуками ефірних олій досліджуваного континууму роду Artemisia L. є моноциклічні монотерпеноїди: б-терпінен, геранілацетат, карвон, лимонен; біциклічні монотерпеноїди в-туйон, борнілацетат, камфора, пінокарвон, транс-пінокарвеол, сабінен, цис-сабіненгідрат; ароматичні терпеноїди: п-цимен, п-цимен-8-ол, тимол, метилевгенол, елеміцин; сесквітерпеноїди: ациклічні - транс-в-фарнезен, неролідол; моноциклічні - гермакрен D; біциклічні - каріофілен, в-селінен, д-кадинен, г-евдесмол, б-кадинол, в-евдесмол, б-евдесмол; терпеноїдний кетон цис-жасмон; дитерпени транс-неофітадієн і фітол, ароматичні сполуки фенілацетальдегід та 2,4-гексадіїнілбензол.

В ефірних оліях досліджуваних видів роду Полин виявлено капілін (1-феніл-2,4-гексадиїн-1-он; 2,4-гексадіїнілбензол), який згідно з сучасними дослідженнями в значній мірі відповідає за антибактеріальну та антифунгальну активність ефірних олій та рослинних екстрактів.

Для секції Abrotanum специфічними є ароматичні терпеноїди елеміцин та п-цимен-8-ол.

Види секції Absinthium характеризуються наявністю таких сполук, як сесквітерпеноїди: гумулен, гермакрен D, -селінен, -кадінен, біциклогермакрен, каріофілен, -бурбонен, -елемен, хамазулен; ароматичні терпеноїди: анетол і тимол; лактон дигідроактинідіолід; дитерпени: транс-неофітадієн і фітол.

Для секції Campestres типовими є ациклічні монотерпеноїди та їх похідні: транс-ліналоолоксид, геранілацетат; моноциклічний терпеноїд лимонен; біциклічні монотерпеноїди хризантенол, хризантенон, вербенол; ароматичний терпеноїд метилхавікол; сесквітерпеноїди: аромадендрен,-хімачален, -бісабололоксид А, -евдесмол, бісаболол В, -кадинол; ароматичний альдегід бензальдегід; дитерпен транс-неофітадієн.

Полини секції Seriphidium переважно синтезують моноциклічний терпеноїд -терпінен; біциклічні терпеноїди: камфору, -туйон, сабінакетон, пінокарвон; ароматичні терпеноїди: п-куменол, п-цимен--ол; терпеноїдний кетон цис-жасмон.

Серед сполук, що виявлені лише в одному з видів досліджуваного континууму роду Artemisia, важливо відзначити терпеноїди - і -пінени, цис--оцимен, лавандулол, бергамотол, лоліолід, цис-п- і транс-п-мента-1,5-дієн-8-ол, вульгарон Б, епі-, цис- і транс-каріофіл-5-ен-12-аль.

Нами були виявлені хемораси видів A. absinthium L., які не містять туйону в ефірній олії (популяції в Харківській та Луганській областях досліджувались протягом 2009-2013 рр.).

Вперше досліджено склад вільних амінокислот трави 10 найбільш поширених видів роду Полин флори України - п. звичайного, п. лікарського, п. однорічного, п. австрійського, п. гіркого, п. естрагону, п. піскового, п. польового, п. Маршаллів та п. пониклого (табл. 1).

Таблиця 1

Вільні амінокислоти трави видів роду Полин, мг/100 г

Ідентифіковано та визначено вміст 22 амінокислот, серед них 9 - незамінні протеїногенні, 10 - замінні протеїногенні, 3 - непротеїногенні. В більшості досліджуваних зразків полинів домінуючими серед вільних амінокислот є пролін, аспарагін, аргінін. Значний вміст вільних амінокислот встановлено у траві п. однорічного (3029,8 мг/100 г), п. гіркого (1810,2 мг/100 г), п. естрагону (1629,3 мг/100 г) та п. польового (1622,1 мг/100 г), найменший - у траві п. піскового (394,7 мг/100 г).

Вперше за допомогою методу ГХ-МС досліджено вміст жирних кислот у траві 10 видів роду Полин - п. звичайного, п. лікарського, п. однорічного, п. австрійського, п. гіркого, п. естрагону, п. піскового, п. польового, п. Маршаллів, п. пониклого. Ідентифіковано та визначено вміст 28 жирних кислот, з них 15 насичених (капронова, нонанова, лауринова, міристинова, пентадеканова, пальмітинова, гептадеканова, стеаринова, арахінова, хенейкозанова, бегенова, трикозанова, тетракозанова, пентакозанова та гексакозанова), 8 мононенасичених (2-гексенова, 3-гексенова, 6-гептенова, 3-октенова, олеїнова, пальмітолеїнова, 11-ейкозенова та 13-докозенова), 2 поліненасичених (лінолева та ліноленова), а також 2 дикарбонових (гексадекадикарбонова та октадекадикарбонова) і 1 гідроксикислота (2-гідроксипальмітинова). Найвищий вміст жирних кислот встановлено у траві п. пониклого (11767,8 мг/кг) та п. естрагону (11148,2 мг/кг), найнижчий - у траві п. звичайного (3555,7 мг/кг). В усіх видах серед насичених кислот домінує пальмітинова, серед ненасичених - лінолева та ліноленова.

У траві досліджуваних 10 видів роду Полин ідентифіковано та визначено вміст 15 аліфатичних (тиглінова, щавелева, 3-метил-2-гідроксивалеріанова, малонова, фумарова, бурштинова, метилбурштинова, глютарова, 3-гідрокси-2-метилглютарова, адипінова, яблучна, суберова, азелаїнова, цитринова, ізоцитринова), бензойної, фенілоцтової, 6 фенолкарбонових (саліцилова, 3,4,5-триметоксибензойна, п-гідроксибензойна, ванілінова, бузкова, гентизинова), 2 нафталінкарбонових (6-метокси-2-нафталіноцтова та її ізомер) та 4 гідроксикоричних (п-кумарова, дигідроксикорична, ферулова, п-метоксикорична) кислот.

На основі проведених фітохімічних, хемотаксономічних досліджень та наявних сировинних ресурсів видів роду Полин флори України як перспективну для подальшого поглибленого фармакогностичного та фармакологічного дослідження було визначено сировину 5 видів полинів - п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону. Встановлено вміст сполук первинного та вторинного метаболізму у траві цих видів. Визначено вміст аскорбінової кислоти, суму органічних кислот сировини, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот та флавоноїдів, амінокислот, ефірної олії, карбонових кислот (табл. 2).

Таблиця 2

Вміст БАР у траві досліджуваних видах полину

Виявлено, що у траві п. звичайного вміст гідроксикоричних кислот найвищій - 2,13 %; найвищий вміст флавоноїдів виявлено у траві п. звичайного та п. естрагону - по 1,60 %.

У траві п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону за допомогою методу ВЕРХ встановлено вміст 17 речовин - 4 флавоноїдів, 10 гідроксикоричних кислот, 3 кумаринів. Хлорогенову кислоту виявлено у траві всіх досліджуваних видів; неохлорогенову, 4-кофеїлхінну, 3,4-дикофеїлхінну та 4,5-дикофеїлхінну кислоти - у траві п. гіркого та п. звичайного; 3,5-дикофеїлхінну кислоту - у траві п. гіркого, п. звичайного та п. австрійського; ізокверцитрин - у траві п. гіркого, п. звичайного та п. лікарського; лютеолін - у траві п. лікарського, п. австрійського та п. естрагону; апігенін, рутин, розмаринову кислоту та скополетин - у траві п. лікарського та п. естрагону; п-кумарову, ферулову, кофейну кислоти та умбеліферон - у траві п. естрагону; кумарин - у траві п. лікарського. Вперше для трави п. естрагону ідентифіковано розмаринову та п-кумарову кислоти, для трави п. лікарського - кумарин.

За допомогою препаративної хроматографії на папері та в тонкому шарі з трави досліджуваних видів полину виділено та ідентифіковано 11 речовин (табл. 3).

Таблиця 3

Фізико-хімічні характеристики виділених та ідентифікованих сполук з досліджуваних об'єктів

Примітка: пг - п. гіркий, пз - п. звичайний, па - п. австрійський, пл - п. лікарський, пе - п. естрагон.

Серед виділених речовин ідентифіковано 6 флавоноїдів: апігенін (5,7,4¹-тригідроксифлавон), лютеолін (5,7,3¹,4¹-тетрагідроксифлавон), кверцетин (3,5,7,3¹,4¹-пентагідроксифлавон), ізокверцитрин (3-О--D-глюкопіранозид кверцетину), рутин (3-О--D-глюкопіранозидо-О--L-рамнозид кверцетину) та артемізетин (3,7,3¹,4¹-тетраметокси-5-гідроксифлавон); фенолкарбонова кислота - саліцилова; 3 гідроксикоричні кислоти: кофейна, ферулова та хлорогенова; гідроксикумарин скополетин.

Розділ 4. Визначення оптимальних технологічних параметрів одержання субстанцій трави видів роду Полин, дослідження їх біологічно активних речовин та розробка проектів МКЯ на рослинну сировину. Визначено оптимальні технологічні параметри одержання ЛК та ФК трави п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону, а також МГЕ з трави п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського. Оптимальними екстрагентами є хлороформ, суміш етилацетат - етанол 96% (8:2) та етанол 80%. Для отримання ЛК подрібнену повітряно-суху сировину вичерпно екстрагували хлороформом в умовах рециркуляції екстрагента у замкненому циклі впродовж 20-24 годин при 55-60 ⁰С з подальшим видаленням екстрагента. Для отримання ФК знежирений хлороформом та висушений шрот після отримання ЛК вичерпно екстрагували сумішшю етилацетат - етанол 96 % (8:2) впродовж 46-50 годин при 70-75°⁰С з подальшим видаленням екстрагента. Вихід ЛК склав від 3,45 % (п. звичайний) до 5,40 % (п. лікарський), вихід ФК - від 3,25% (п. лікарський) до 8,90 % (п. австрійський). Визначено вміст основних груп БАР ЛК та ФК полинів (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст основних БАР у ліпофільних та фенольних комплексах

Технологія МГЕ передбачає одержання густого спиртового екстракту методом перколяції етанолом 80% з подальшим розчиненням одержаного екстракту у гексані, обробкою водним розчином купруму сульфату, у процесі якого атоми магнію в молекулах хлорофілів заміщуються на атоми купруму з утворенням купрум-порфіринових комплексів, та упарюванням до видалення екстрагента. Вихід МГЕ складає 2,35% (п. гіркий), 2,21% (п. австрійський), 3,22% (п. звичайний).

За допомогою методу ГХ-МС досліджено компонентний склад ЛК та ФК трави п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону і МГЕ п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського. Компонентний склад ЛК представлено терпеноїдами, аліфатичними вуглеводнями та їх похідними, вищими жирними кислотами та їх естерами; компонентний склад ФК - флавоноїдами, гідроксикоричними кислотами, кумаринами, терпеноїдами, ароматичними сполуками, жирними кислотами та їх естерами; компонентний склад МГЕ - ароматичними сполуками, терпеноїдами, купрум-порфіриновими комплексами, жирними кислотами та їх естерами. З використанням методів хроматографії у ЛК та ФК вперше ідентифіковано аутемілін - у ЛК п. гіркого та 6,8-диметокси-7-гідроксикумарин - у ФК п. австрійського; крім того, виявлено артемізин, г-ситостерол - у ФК п. звичайного та ЛК п. австрійського, ахілін та аустрицин - у ЛК п. австрійського, тритерпеноїди б- та в-амірини - у ЛК п. звичайного, герніарин - у ЛК п. естрагону.

За допомогою методу атомно-емісійної спектрофотометрії у траві п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону визначено 15 макро- та мікроелементів; встановлено, що за вмістом важких металів сировина відповідає вимогам ДФУ.

В результаті морфолого-анатомічного дослідження вегетативних та генеративних органів п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону встановлено основні діагностичні ознаки. Види диференціюються за такими ознаками, як будова квітки: тичинкові квітки диску (п. естрагон); опушення квітколожа (п. звичайний); будова листової пластинки, розмір та форма клітин епідермісу, наявність ефіроолійних залозок, неспеціалізованих паренхімних клітин, схізогенних вмістилищ і волосків: Т-подібні волоски (п. звичайний, п. гіркий, п. австрійський); будова стебла на поперечному зрізі. Визначено числові показники якості сировини. За результатами морфолого-анатомічних та фітохімічних досліджень розроблено проекти МКЯ «Полину звичайного трава», «Полину австрійського трава»: згідно з вимогами ДФУ рекомендовано стандартизувати сировину за морфолого-анатомічними ознаками, результатами ТШХ, показниками втрати в масі при висушуванні, загальної золи, вмісту домішок, за вмістом ефірної олії, гідроксикоричних кислот та флавоноїдів.

Розділ 5. Дослідження антимікробної, антифунгальної активності та гострої токсичності субстанцій трави видів роду Полин. Дослідження антимікробної та антифунгальної активності ЛК, ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону, МГЕ п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського і гострої токсичності ЛК та ФК п. звичайного, п. гіркого та п. австрійського проводили на базі ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України» при консультативній допомозі молодшого наукового співробітника Н. В. Кашпур. Дослідження проводили методом дифузії в агар, використовуючи 1% (МГЕ), 2% та 5% (ЛК та ФК) розчини спиртові 96% і штами Staphylococcus aureus 15923, Escherichia coli 25922, Pseudomonas aeruginosa 2789, Bacillus subtilis 6633, Proteus vulgaris 4636, Candida albicans 885-563 (табл. 5).

Таблиця 5

Антимікробні та антифунгальні властивості ЛК та ФК трави полинів

Примітка: «-» - зона затримки росту відсутня або має діаметр до 10 мм

Встановлено антимікробну активність стосовно штамів Staphylococcus aureus 15923 та Bacillus subtilis 6633 практично усіх досліджених ЛК та ФК. Відносно штаму Pseudomonas аeruginosa 2789 найбільшу дію виявив ЛК п. естрагону; щодо штамів Escherichia coli 25922 та Proteus vulgaris 4636 більшість ЛК та ФК виявили середню та слабку дію. Відносно штаму Candida albicans 885-563 високу дію показали ЛК і ФК п. звичайного, інші комплекси - низьку, ЛК і ФК п. естрагону були неактивні. МГЕ п. гіркого, п. звичайного та п. австрійського у порівнянні з відповідними ЛК та ФК були менш активними щодо бактеріальних штамів, проте виявили більшу дію по відношенню до штаму Candida albicans 885-563.

Визначено кореляційні зв'язки між вмістом основних БАР у ЛК та ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону і рівнем їх антимікробної активності (рис.1, 2).

Рис. 1 Кореляція між вмістом БАР у ліпофільних комплексах і рівнем їх антимікробної активності

Рис. 2 Кореляція між вмістом БАР у фенольних комплексах і рівнем їх антимікробної та протигрибкової активності

Встановлені коефіцієнти кореляції вказують на те, що антимікробну дію ЛК щодо Staphylococcus aureus та Proteus vulgaris обумовлено терпеновими фенольними сполуками, що входять до складу комплексів; антимікробну активність ФК щодо Pseudomonas аeruginosa та Bacillus subtilis обумовлено сумою флавоноїдів та гідроксикоричних кислот, а також сумою терпенових спиртів та ароматичних сполук.

Методом пасажів проведено дослідження процесу формування резистентності штамів S. aureus 25923, E. coli 25922 та C. albicans 885-653 до ЛК та ФК п. гіркого, п. звичайного та п. австрійського. Встановлено, що формування резистентності штамів до досліджуваних комплексів, оцінене за збільшенням мінімальних бактеріо- та фунгістатичних концентрацій, відбувається достовірно повільніше за формування їх резистентності до тест-препаратів (хлорофіліпт, гентаміцин, ністатин).

Досліджено вплив ЛК та ФК п. гіркого, п. звичайного і п. австрійського на адгезивні та протилізоцимні властивості мікроорганізмів та встановлено, що досліджувані комплекси виявили виражені протиадгезивні властивості та помітно інгібували протилізоцимну активність використаних тест-культур мікроорганізмів.

При консультаційній допомозі професора кафедри біологічної та медичної хімії з курсом фізколоїдної та біонеорганічної хімії ІФНМУ А. О. Клименка методом контактного впливу на клітини асцитної карциноми Ерліха встановлено цитотоксичну активність ФК п. гіркого на рівні 16,3±0,35% загибелі ракових клітин.

За результатами вивчення гострої токсичності субстанцій встановлено, що ЛК та ФК п. звичайного, п. лікарського, п. гіркого, п. австрійського та п. естрагону належать до V класу токсичності - практично нетоксичні речовини.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та практичне вирішення наукової задачі, яка полягає у пошуку нових джерел БАР серед рослин роду Полин флори України. Шляхом комплексного фармакогностичного та хемотаксономічного дослідження 14 видів роду визначено хімічний профіль видів роду, встановлено найбільш перспективні як джерела БАР види: п. звичайний, п. австрійський, п. гіркий, п. лікарський, п. естрагон; з трави даних видів одержано ліпофільні та фенольні комплекси; з трави п. звичайного, п. австрійського та п. гіркого - модифіковані густі екстракти; встановлено антимікробну активність одержаних екстрактів; досліджено цитотоксичну активність фенольного комплексу п. гіркого; досліджено гостру токсичність ліпофільних та фенольних комплексів п. звичайного, п. австрійського, п. лікарського, п. естрагон та п. гіркого; розроблено проекти МКЯ трави п. звичайного та п. австрійського.

1. Вперше на основі результатів фізико-хімічного аналізу у 14 видах полинів ідентифік...