Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Національний фармацевтичний університет

УДК 615.451.16:577.15/.17:582.736

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

ВИВЧЕННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН GLEDITSIA TRIACANTHOS ТА ОТРИМАННЯ СУБСТАНЦІЙ НА ЇХ ОСНОВІ

ДУЧЕНКО МАРИНА АНАТОЛІЇВНА

Харків - 2012

АНОТАЦІЯ

Дученко М. А. Вивчення біологічно активних речовин Gleditsia triacanthos та отримання субстанцій на їх основі. - На правах рукопису.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. Національний фармацевтичний університет, Харків, 2012.

Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення гледичії колючої з дослідженням основних груп біологічно активних речовин. Виділено і встановлено структуру 42 речовин, з них із листя - 27, зі стулок - 15. Вперше з гледичії колючої виділено 26 фенольних сполук. Методом ВЕРХ визначено кількісний вміст 9 флавоноїдів. За вмістом переважають глікозиди мірицетину та апігеніну. Визначено 16 амінокислот, 11 жирних кислот, 40 летких сполук, 15 макро- та мікроелементів. У листях гледичії колючої встановлено кількісний вміст органічних та жирних кислот, аскорбінової кислоти, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, алкалоїдів та полісахаридів, антраценпохідних - у стулках. Вперше встановлено оптимальний термін заготівлі листя гледичії колючої на основі даних вивчення динаміки накопичення гідроксикоричних кислот, флавоноїдів та дубильних речовин. Встановлені морфолого-анатомічні ознаки листя та бобів гледичії колючої. Розроблена технологія одержання сухого екстракту з листя гледичії колючої, який виявляє протизапальну, знеболюючу та гіпотензивну дію. Розроблені проекти МКЯ “Гледичії колючої листя”, “Гледичії колючої листя сухий екстракт”.

Ключові слова: гледичія колюча, фармакогностичне вивчення, біологічно активні речовини, екстракт, фармакологічна активність.

листя гледичія колючий кислота

АННОТАЦИЯ

Дученко М. А. Изучение биологически активных веществ Gleditsia triacanthos и получение субстанций на их основе. - - На правах рукописи.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2012.

Впервые проведено комплексное фармакогностическое изучение гледичии обыкновенной и исследование основных групп биологически активных веществ (БАВ). Качественными реакциями и хроматографическими методами анализа, трехмерной флюоресцентной спектроскопией, хромато-масс-спектрометрией, атомно-адсорбционной спектроскопией установлено наличие полисахаридов, аминокислот, органических кислот, сапонинов, алкалоидов, оксикоричных кислот, кумаринов, флавоноидов, антраценпроизводных, дубильных веществ, жирных кислот, летучих веществ, хлорофиллов и каротиноидов. Определено количественное содержание органических кислот, аскорбиновой кислоты, оксикоричных кислот, флавоноидов, дубильных веществ, алкалоидов в листьях, антраценпроизводных - в створках бобов. Впервые изучена динамика накопления БАВ в листьях гледичии обыкновенной и определены оптимальные сроки заготовки сырья. Впервые установлены качественный состав и количественное содержание аминокислот в листьях и створках бобов. В листьях выявлено 16, а в створках 12 свободных аминокислот. Изучен элементный состав органов гледичии обыкновенной, обнаружено 15 элементов, из них 7 - макро-, 7 - микро-, 1 - ультрамикроэлемент. Методом хромато-масс-спектрометрии изучен качественный состав и количественное содержание летучих компонентов эфирного масла листьев гледичии обыкновенной, из обнаруженных 46 веществ идентифицировано 40.

Из листьев и створок бобов гледичии обыкновенной выделены и установлена структура 42 веществ: из листьев - 27, из створок - 15. На основании физико-химических свойств веществ, продуктов их химических превращений, данных УФ-, ИК-, ПМР-спектроскопии, сравнения с достоверными образцами впервые из листьев гледичии обыкновенной выделено 18 веществ, из створок бобов - 8. Впервые методом ВЭЖХ определено количественное содержание 9 индивидуальных флавоноидов в листьях гледичии обыкновенной. По содержанию преобладают гликозиды мирицетина и апигенина.

Впервые изучены полисахариды листьев гледичии обыкновенной. Установлено содержание водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, установлен их мономерный состав, определено содержание кислых и восстанавливающих сахаров. Впервые получены липофильные экстракты из листьев и створок бобов гледичии обыкновенной. Изучен их качественный состав и количественное содержание жирных кислот, хлорофиллов и каротиноидов.

С целью идентификации и стандартизации нового лекарственного растительного сырья определены основные морфолого-анатомические диагностические признаки листьев гледичии обыкновенной. Изданы методические рекомендации “Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки робінії звичайної (Robinia pseudoacacia L.) та гледичії звичайної (Gledіtsіa trіacanthos L.)”.

Разработана технология получения сухого экстракта из листьев гледичии обыкновенной. Проведено определение острой токсичности, противовоспалительной, анальгезирующей и гипотензивной активности. На моделях карагинанового отека, сухой экстракт листьев гледичии обыкновенной в дозах 50 и 100 мг/кг проявляет выраженный противовоспалительный эффект и превышает препарат сравнения диклофенак натрия в дозе 10 мг/кг на 15,2 и 27,3 % соответственно. Экстракт гледичии обыкновенной проявляет анальгезирующий эффект, но по силе действия уступает диклофенаку натрия, а по гипотензивной активности превышает действие референс-препарата - папаверина гидрохлорида. Способ получения защищен патентом Украины 96069, бюл. № 18/).

По результатам исследований разработаны 2 проекта МКК “Гледичии обыкновенной листья”, “Гледичии обыкновенной листьев экстракт сухой”.ществ, продуктов их химических превращений, данных УФ-, ИК-, ПМР-спектроскопиитов эфирного масла лис

Ключевые слова: гледичия обыкновенная, фармакогностическое изучение, биологически активные вещества, экстракт, фармакологическая активность.

ANNOTATION

Duchenko M. А. The study of biologically active substances of Gleditsia triacanthos and creation of substances based on them. - A Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of pharmaceutical science on specialty 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. National University of Pharmacy, Kharkiv, 2012.

The pharmacognostic study of major groups of biologically active substances of Gleditsia trіacanthos was carried out for the first time. 42 compounds were isolated as individuals, among them from leaves - 27, from valves - 15 and their structure was determined. 26 phenolic compounds from Gleditsia trіacanthos were isolated for the first time. Assay by HPLC method of 9 flavonoids was carried out. The content matter is dominated by glycosides of myricetin and apigenin. 16 Amino acids, 11 fatty acids, 40 volatile compounds, 15 macro- and micronutrients were determined. Assay of organic and fatty acids, ascorbic and hydroxycinnamic acids, flavonoids, tannins, alkaloids and polysaccharides in leaves of Gleditsia trіacanthos, antraquinone derivatives in valves were established. The optimal harvest time of leaves of Gleditsia trіacanthos was found for the first time on the basis of studying the dynamics of accumulation of hydroxycinnamic acids, flavonoids and tannins. Morphological and anatomical features of leaves and beans of Gleditsia trіacanthos were established. The technology of obtaining dry extract from the leaves of Gleditsia trіacanthos was developed. Extract shows anti-inflammatory, analgesic and hypotensive activities. The projects of quality control procedures “Gleditsia trіacanthos leaves”, “Gleditsia trіacanthos leaves dry extract” were developed.

Keywords: Gleditsia trіacanthos, pharmacognostic study, biologically active substances, extract, pharmacological activity.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакогнозії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, заслужений діяч науки і техніки України, професор Ковальов Володимир Миколайович, Національний фармацевтичний університет, професор кафедри фармакогнозії.

Офіційні опоненти:

доктор фармацевтичних наук, професор Мазулін Олександр Владиленович, Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри фармакогнозії, фармацевтичної хімії та технології ліків факультету післядипломної освіти;

кандидат фармацевтичних наук, старший науковий співробітник Котов Андрій Георгійович, ДП “Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів”, провідний науковий співробітник відділу Державної фармакопеї.

Захист відбудеться “21” грудня 2012 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “19” листопада 2012 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор В.А. Георгіянц

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Досвід багатьох поколінь доводить, що рослинний світ є невичерпним джерелом лікарських засобів, які використовуються у народній медицині для лікування різних захворювань. Тому пошук, дослідження біологічно активних речовин (БАР) рослин і створення на їх основі лікарських засобів є актуальною проблемою сучасної фармації. Доцільним рішенням її може бути вивчення лікарських рослин, які широко розповсюджені або культивуються на території України і мають достатню сировинну базу.

Нашу увагу привернула гледичія колюча (Gleditsia triacanthos L.), яка відноситься до родини бобових (Fabaceae). Це дерево походить з Північної Америки, яке завезли до нас у минулому столітті. На Україні її широко культивують як декоративну рослину. Лікарською сировиною гледичії колючої є лушпиння плодів і молоде листя, зібране у період розпускання. Молоде листя виявляє спазмолітичну дію, розширює кровоносні судини, знижує кров'яний тиск, активізує дихальний центр. Його застосовують при гіпертонії, бронхіальній астмі, спастичних колітах та хронічному холециститі. Галенові препарати стулок плодів виявляють послаблюючу дію.

Аналіз літературних джерел показав, що більш детально вивчений хімічний склад бобів та стулок гледичії колючої. Склад біологічно активних сполук листя гледичії колючої досліджений недостатньо, проведені фармакологічні дослідження є неповними, а відомостей про анатомічну будову досліджуваної сировини у доступній літературі не знайдено.

Отже дослідження, спрямовані на вивчення біологічно активних речовин листя та стулок гледичії колючої, розробка нових субстанцій рослинного походження, стандартизація сировини та отриманих субстанцій, а також створення на їх основі лікарських засобів є актуальними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії “Фармація” МОЗ та АМН України (Протокол № 54 від 15.10.2008 р.) і є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Національного фармацевтичного університету “Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження” (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було комплексне фармакогностичне дослідження біологічно активних речовин листя та стулок гледичії колючої та створення нових лікарських субстанцій на їх основі.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- проаналізувати і узагальнити сучасні дані літератури щодо ботанічних ознак, географічного розповсюдження, хімічного складу і застосування рослини в медицині та інших галузях народного господарства;

- провести попереднє фітохімічне дослідження на наявність основних груп біологічно активних речовин (БАР) листя та стулок гледичії колючої;

- визначити кількісний вміст основних груп БАР у листі та стулках гледичії;

- виділити в індивідуальному стані природні сполуки та встановити їх структуру;

- вивчити основні анатомо-діагностичні ознаки листя гледичії колючої з метою визначення тотожності сировини;

- розробити та обґрунтувати оптимальну технологію одержання комплексів БАР з листя гледичії колючої;

- провести визначення фармакологічної активності одержаних субстанцій;

- розробити методики контролю якості (МКЯ) на сировину та одержані субстанції.

Об'єкт дослідження. Об'єктом дослідження було комплексне фармакогностичне вивчення листя та стулок гледичії колючої.

Предмет дослідження. Предметом досліджень було виявлення, виділення в індивідуальному стані і встановлення структури БАР (амінокислоти, вуглеводи, ліпофільні речовини, мікро- та макроелементи, флавоноїди, гідроксикоричні та органічні кислоти, кумарини) з листя та стулок гледичії колючої; проведення макро- і мікроскопічних досліджень і визначення основних діагностичних ознак листя, бобів гледичії колючої, розробка технології одержання сумарних комплексів біологічно активних речовин з листя гледичії колючої та встановлення їх фармакологічної активності.

Методи дослідження. Для проведення досліджень використовували наступні методи аналізу: фізичні - визначення втрати в масі при висушуванні, розчинності, температури плавлення; фізико-хімічні - хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбенту, колонкову хроматографію на поліамідному сорбенті і препаративну хроматографію на папері, спектрофотометрію в ІЧ-, УФ- та видимих областях спектра, ¹Н-ЯМР-спектроскопію, хромато-мас-спектрометрію, атомно-адсорбційну спектроскопію, тривимірну скануючу спектрофлуориметрію, газорідинну хроматографію, високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ); хімічні - проведення якісних реакцій, реакцій ацетилювання, метилювання, лужного, кислотного та ферментативного гідролізу; гравіметричний, комплексонометричний та перманганатометричний методи кількісного хімічного аналізу; технологічні - вибір екстрагенту, співвідношення сировина:екстрагент, часу та температури екстракції; мікроскопічні - вивчення мікропрепаратів з поверхні та поперечних зрізів листя та стебла; фармакологічні дослідження проводили in vivo. Для обробки результатів експерименту використовували статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне фармакогностичне вивчення листя та стулок гледичії колючої. Науковий інтерес представляють нові дані з вивчення якісного складу та кількісного вмісту амінокислот, макро- та мікроелементів, летких компонентів ефірної олії, полісахаридів, ліпофільних речовин (хлорофілів, каротиноїдів, жирних кислот), карбонових кислот, алкалоїдів, тритерпенових сполук, фенольних сполук (флавоноїдів, антраценпохідних, гідроксикоричних кислот, кумаринів, дубильних речовин).

Вперше методом хромато-мас-спектрометрії досліджений якісний склад та кількісний вміст летких компонентів ефірної олії листя гледичії колючої, з виявлених 46 речовин ідентифіковано 40.

Вперше у досліджуваних органах гледичії колючої визначено вміст і проведено аналіз полісахаридів, амінокислот, жирних кислот, хлорофілів та каротиноїдів. Вивчено динаміку накопичення БАР у листях та стулках гледичії в залежності від терміну заготівлі сировини.

З листя та стулок гледичії колючої виділено та ідентифіковано структуру 42 речовин, з них 27 з листя та 15 зі стулок: 5 гідроксикоричних кислот (хлорогенова, неохлорогенова, ізохлорогенова, ферулова та кавова), 4 кумарини (умбеліферон, умбеліпренін, скополетин, ізоскополетин), 10 флавонолів та їх глікозидів (кверцетин, ізорамнетин, мірицетин, мірицетин-3-О-рутинозид, мірицетин-3-О-глюкозид, рутин, кверцетин-3-О-генціобіозид, ізокверцитрин, ізорамнетин-3-О-генціобіозид, ізорамнетин-3-О-глюкозид), 7 флавонів та їх глікозидів (апігенін, апігенін-7-О-глюкозид, лютеолін, вітексин, сапонаретин, орієнтин, гомоорієнтин), 1 алкалоїд (тріакантин).

Вперше з листя гледичії виділено 19 речовин, зі стулок - 8. Методом ВЕРХ визначеного кількісний вміст 9 індивідуальних флавоноїдів у листях. За вмістом переважають глікозиди мірицетину та апігеніну.

Проведено вивчення анатомічної будови листя, бобів гледичії колючої та встановлені діагностичні ознаки сировини та місця локалізації фенольних сполук.

Вперше розроблена технологія одержання комплексу біологічно активних речовин з листя гледичії колючої, проведено стандартизацію сировини, сухого екстракту та досліджено його фармакологічну активність.

Новизна дослідження підтверджена патентом України на винахід “Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною дією” (№96069, бюл. № 18/2011).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена технологія одержання комплексу біологічно активних речовин з листя гледичії колючої з вираженими фармакологічними властивостями: протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною, дає змогу раціонального використання вітчизняних сировинних ресурсів, є екологічною та легко відтворюваною на підприємствах фармацевтичної галузі України.

За результатами досліджень розроблено проекти МКЯ: “Гледичії колючої листя”, “Гледичії колючої листя екстракт сухий”. Видані методичні вказівки “Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки робінії звичайної (Robinia pseudoacacia L.) та гледичії звичайної (Gledіtsіa trіacanthos L.)”.

Результати досліджень впроваджені у навчальний процес кафедр медичної ботаніки, хімії природних сполук і фармакогнозії НФаУ, Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я. Горбачевського, Запорізького державного медичного університету, Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, Івано-Франківського державного медичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова, Донецького державного медичного університету ім. М. Горького, Київського медичного університету Української асоціації народної медицини, Національного медичного університету ім. О. О. Богомольця, Луганського державного медичного університету, Одеського національного медичного університету, Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Усі наукові результати, подані в дисертації, отримані автором особисто. Дисертантом з науковим керівником поставлено мету дослідження та встановлено шляхи її реалізації, а саме: проаналізовані та узагальнені дані літератури стосовно ботанічної характеристики, розповсюдження, хімічного складу та використання рослин роду гледичія; встановлені основні групи БАР: флавоноїди, кумарини, гідроксикоричні кислоти, антраценпохідні, амінокислоти, полісахариди, органічні кислоти, ліпофільні сполуки, компоненти ефірної олії, дубильні речовини, сапоніни, алкалоїди, визначено їх кількісний вміст; визначено динаміку накопичення основних груп БАР у сировині та оптимальні терміни її заготівлі; визначені числові показники листя гледичії колючої; виділено і встановлено будову 41 речовини фенольної природи, 1 алкалоїду; вивчена морфолого-анатомічна будова листя, бобів гледичії колючої; розроблено технологію отримання сухого екстракту листя гледичії колючої; розроблені проекти МКЯ на листя гледичії колючої та сухий екстракт, видані методичні вказівки “Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки робінії звичайної (Robinia pseudoacacia L.) та гледичії звичайної (Gledіtsіa trіacanthos L.)”.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено та обговорено на науково-практичних конференціях різного рівня: Всеукраїнський конгрес “Сьогодення та майбутнє фармації” (м. Харків, 2008 р.); ювілейна науково-практична конференція з міжнародною участю “Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи”, присвячена пам'яті к.ф.н., доц. М. І. Борисова (м. Харків, 2009 р.); ІІІ науково-практична конференція з міжнародною участю "Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів" (м. Тернопіль, 2009 р.); VII международный Симпозиум по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (г. Москва, 2009 г.); Міжнародна науково-практична конференція “Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства” (г. Шымкент, 2009 г.); VII Національний з'їзд фармацевтів України “Фармація України. Погляд у майбутнє” (м. Харків, 2010 р.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 13 наукових робіт, у тому числі 5 статей у наукових фахових виданнях, 1 методичні рекомендації, 4 тез доповідей, 1 патент.

Структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 200 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, 5 розділів власних досліджень, загальних висновків, списку використаних літературних джерел, додатків. Робота ілюстрована 39 таблицями, 37 рисунками. Бібліографія включає 203 літературних джерел, у тому числі 90 іноземних видань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика, хімічний склад, фармакотерапевтичні властивості, народногосподарське значення рослин роду Гледичія (огляд літератури). В огляді літератури наведено ботанічну характеристику, дані про хімічний склад, застосування у медицині та народному господарстві рослин роду Гледичія. Проведений аналіз літературних даних за темою дисертаційної роботи показав, що гледичія колюча широко культивується на території України, має багатий хімічний склад та знаходить широке застосування у народній, науковій медицині та народному господарстві. Найбільш вивченою сировиною гледичії колючої є боби, частково - стулки. Хімічний склад листя гледичії колючої досліджений недостатньо, поведені фармакологічні дослідження є неповними, що створило передумови для їх комплексного фармакогностичного вивчення та більш ретельного дослідження біологічно активних речовин з подальшим створенням на їх основі нових лікарських субстанцій.

Якісне та кількісне визначення біологічно активних речовин гледичії колючої. Об'єктами дослідження були листя і стулки бобів гледичії колючої, яка культивується в Україні. Сировину для досліджень заготовляли з дерев, які ростуть у Ботанічному саду ХНУ ім. В. Н. Каразіна, у Харківській та Вінницькій областях. Сировину заготовляли протягом 2007 - 2011 рр. Листя заготовляли з травня по жовтень. Стулки бобів збирали з вересня по листопад.

Відомо, що молоде листя гледичії використовували в якості сировини для одержання алкалоїду тріакантину. Нами було проведене визначення кількісного вмісту тріакантину у молодих листях, заготовлених у травні, і листях, заготовлених у період листопаду (вересень), оскільки сировиною для дослідження було листопадне листя. Вміст тріакантину у молодому листі гледичії колючої становить 0,995±0,028% і зменшувався у вересні до 0,41%.

Дослідження елементного складу гледичії. Вперше методом атомно-емісійної спектрографії із фотографічною реєстрацією на приладі ДФС-8 вивчено елементний склад листя і стулок плодів гледичії колючої. У досліджуваній сировині встановлено наявність 15 елементів, з яких 7 - макроелементи, 7 - мікроелементи і 1 - ультрамікроелемент. Для вмісту знайдених елементів спостерігалася така закономірність: для листя - Ca>Si>K>Mg>P>Al>Fe>Na> Sr>Mn>Zn>Cu>Pb>Ni>Mo, для стулок плодів - K>Ca>P>Mg>Si>Na>Fe>Al> Mn>Sr>Cu>Zn>Ni>Mo>Pb. Можна відмітити у листі високий вміст кальцію (1940 мг/100г), кремнію (755 мг/100 г), калію (580 мг/100 г), магнію (580 мг/100г), фосфору (175 мг/100 г); у стулках плодів - калію (1470 мг/100 г), кальцію (395 мг/100г), фосфору (167 мг/100 г); магнію (145 мг/100г).

Вперше методом хромато-мас-спектрометрії досліджений якісний склад та кількісний вміст летких компонентів ефірної олії листя гледичії колючої (рис. 1). У результаті виявлено 46 речовин, з яких ідентифіковано 40. За вмістом переважають сполуки: октан (35,71%), сквален (10,30%), б-туйон (1,98%), гептакозан - 3,09%, тетракозан - 3,04%, гексакозан - 2,49%, пентакозан - 2,29%, фітол (1,49%), ліналоол (0,72%), в-туйон (0,40%), камфора (0,23%), б-терпінеол (0,22%), 1,8-цинеол (0,20%), п-цимен (0,18%).

Рис. 1. Хроматограма ефірної олії листя гледичії колючої.

Особливий науковий інтерес представляють біологічно активні сполуки: дитерпеновий спирт фітол (1,49%) та ациклічний тритерпеноїд сквален (10,30%), які проявляють протизапальну та протипухлинну дію.

Визначення кількісного вмісту фенольних сполук гледичії колючої. Вперше проведено визначення вмісту основних груп діючих речовин у листі та стулках бобів гледичії в залежності від фази вегетації рослини (табл. 3, рис. 2): гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, антраценпохідних, дубильних речовин.

Таблиця 3

Вміст груп БАР у листі та стулках гледичії колючої в залежності від фази вегетації рослини

Примітка: * - комплексонометричний метод, ** - антраценпохідні.

Як видно з табл. 3 та рис. 2, вміст гідроксикоричних кислот і флавоноїдів у листі гледичії в період з червня по вересень є майже стабільним і коливається у межах 0,1-0,52%, максимум накопичення дубильних речовин спостерігається у червні і поступово знижується до вересня на 50%. Вміст гідроксикоричних кислот у стулках становить 3,94±0,07%, флавоноїдів - 0,69±0,03% і дубильних речовин - 10,67±0,30%. Враховуючи отримані результати визначення вмісту БАР у листі гледичії колючої в різні терміни заготівлі ми вважаємо доцільним заготівлю листя проводити в серпні - вересні у період листопаду, але можливо збирати і протягом літа у період повного розкриття листової пластинки.

Дослідження ліпофільних речовин. З метою комплексного використання гледичії колючої було проведено дослідження найбільш перспективної сировини - листя і стулок плодів. Відомо, що в номенклатурі лікарських засобів природного походження особливе місце займають препарати, що містять ліпофільні сполуки. Серед цих речовин особливий інтерес з фармакологічної точки зору представляють токофероли, каротиноїди, жирні кислоти тощо, тому дослідження ліпофільних речовин має практичний інтерес. В експерименті подрібнену сировину (листя та стулки) вичерпно екстрагували хлороформом в апараті Сокслета. Відсотковий вміст ліпофільних фракцій склав для листя гледичії 3,30±0,13%, для стулок - 3,88±0,11%. Якісний склад ліпофільних фракцій листя та стулок гледичії колючої вивчали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) та тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в УФ- та видимому діапазонах спектра (рис. 3).

Примітка: Emission - довжина хвилі випромінювання, нм; Excitation - довжина хвилі збудження, нм.

Так, в усіх екстрактах спостерігається серія максимумів у областях збудження л_exc=280-700 нм і випромінювання л_em=660-730 нм, яка характерна для суміші хлорофілів А і Б; максимуми в областях збудження л_exc=360-400 нм і випромінювання л_em=450-500 нм свідчать про наявність каротиноїдів; максимуми в областях збудження л_exc=250-350 нм і випромінювання л_em=460-530 нм відповідають за випромінювання агліконів флавоноїдів. Спектрофотометрично у ліпофільних екстрактах визначено вміст суми хлорофілів (у перерахунку на хлорофіл А) та суми каротиноїдів (у перерахунку на в-каротин). Найбільший вміст хлорофілів відмічається у листі (499,54 мг%), а каротиноїди в усіх досліджуваних зразках містяться у слідових кількостях.

Вперше методом газорідинної хроматографії у ліпофільних фракціях листя та стулок плодів гледичії колючої було ідентифіковано 9 жирних кислот, зі стулок - 11 жирних кислот (табл. 4). Значний вміст у ліпофільній фракції листя гледичії мають ессенціальні кислоти (б-ліноленова та лінолева), які є обов'язковим компонентом клітинних мембран, на їх долю припадає 44,76%, з них на б-ліноленову - 29,16%, лінолеву - 15,70%. Друге місце у кількісному відношенні посідала насичена пальмітинова кислота. Міристинова, стеаринова, бегенова, лігноцеринова, олеїнова кислоти містились у меншій кількості, їх сума складає 21,66% загального фонду жирних кислот. Найбільша кількість у ліпофільній фракції зі стулок плодів гледичії містилось насичених кислот: бегенової (28,33%) та пальмітинової (25,85%), у меншій кількості - арахідонової (1,99%), гексакозанової (2,25%), міристинової (2,65%), стеаринової (8,57%). Частка лігноцеринової кислоти склала 16,66% і вміст олеїнової, ерукової, ліноленової кислот коливався у межах 3,45-5,84%.

Таблиця 4

Результати якісного та кількісного визначення жирних кислот у ліпофільних фракціях з листя та стулок гледичії колючої

Також, визначено показники сировини: втрата в масі при висушуванні в листях гледичії колючої склала 6,86±0,14%, у стулках - 10,53±0,23%, загальна зола у листях - 9,72±0,34%.

Виділення біологічно активних речовин з листя та стулок гледичії колючої та встановлення їх структури. Для виділення біологічно активних речовин і розділення їх на індивідуальні компоненти використовували методи рідинної екстракції, колонкової адсорбційної хроматографії на поліамідному сорбенті, рехроматографії, дробової кристалізації, препаративної хроматографії на папері та у тонкому шарі сорбенті. Структуру речовин встановлювали на основі фізико-хімічних властивостей, хімічних перетворень, даних ІЧ-, УФ-, ПМР-спектрів, ВЕРХ та порівняння з достовірними зразками. З листя і стулок гледичії колючої виділено та ідентифіковано 42 речовини (табл. 5), з листя гледичії колючої виділено та встановлено структуру 27 речовин, зі стулок - 15, з них: 5 гідроксикоричних кислот, 4 кумарини, 3 флавоноли, 7 флавонолових глікозидів, 2 флавони, 5 флавонових глікозидів та 1 алкалоїд.

Морфолого-анатомічна характеристика листя та бобів гледичії колючої. З метою стандартизації нового виду лікарської сировини проведено морфолого-анатомічне вивчення листя і бобів гледичії колючої та встановлені основні діагностичні ознаки сировини та місця локалізації фенольних сполук. Спеціальними ознаками, які можуть мати діагностичне значення при встановленні якості листя гледичії є наступні елементи будови: форма клітин верхньої та нижньої епідерми; тип продихового апарату; тип будови листкової пластинки; наявність кристалоносної обкладинки провідних пучків, тип провідних пучків, тип трихом, їх розміщення, форма.

Основними ознаками бобів є: форма клітин епідерми; наявність великої кількості кам'янистих клітин та запасаючої тканини.

За допомогою мікрохімічних реакцій встановлено, що місцями локалізації фенольних сполук у листі гледичії є: клітини паренхіми, епідерми, трихоми, також клітини серцевини рахісу. Запасні цукри (крохмаль) накопичуються у клітинах серцевини рахісу, клітинах серцевинних променів, у запасаючій тканині.

Отримані результати використані для розробки МКЯ на листя гледичії. Видані методичні рекомендації “Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки робінії звичайної (Robinia pseudoacacia L.) та гледичії звичайної (Gledіtsіa trіacanthos L.)”.

Розробка технології одержання біологічно активної субстанції з листя гледичії колючої, стандартизація та дослідження її фармакологічної активності. Вперше розроблена технологія одержання комплексу біологічно активних речовин з листя гледичії колючої (патент України винахід № 96069), досліджена його фармакологічна активність, проведена стандартизація сировини та субстанції.

Вивчення фармакологічної активності екстракту листя гледичії колючої вивчали на базі експериментальної фармакологічної лабораторії кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова під керівництвом зав. кафедри біологічної хімії, д.м.н., проф. Волощук Н. І.

Проведено визначення гострої токсичності, протизапальної, знеболюючої та гіпотензивної активності. На моделях карагенінового набряку сухий екстракт листя гледичії колючої у дозах 50 і 100 мг/кг виявляє виражений протизапальний ефект і перевищує препарат порівняння - диклофенак натрію у дозі 10 мг/кг на 15,2 і 27,3% відповідно, а на моделі формалінового набряку дещо поступається дії референс-препарату.

Екстракт гледичії проявляє більш виражений знеболюючий ефект, проте за силою дію він поступається диклофенаку натрію, а за гіпотензивною дією перевищує референс-препарат - папаверину гідрохлорид, що підтверджується його здатністю знижувати артеріальний тиск у сонній артерії щурів на 10,8% у порівнянні з вихідним рівнем. Попереднє введення б-адреноміметика мезатону підвищує гіпотензивний ефект препарату; зменшення артеріального тиску складає 25,9%. За класифікацією К. К. Сидорова екстракт листя гледичії колючої відноситься до VI класу токсичності, LD₅₀ при внутрішньочеревинному введенні щурам складає більше 1000 мг/кг (відносно нешкідливі речовини).

Розроблений спосіб одержання субстанції з вираженими фармакологічними активностями: протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною, дає змогу раціонального використання вітчизняних сировинних ресурсів, є економічним, безпечним і легко відтворюваним на підприємствах фармацевтичної галузі України.

За результатами проведених досліджень розроблені проекти МКЯ “Гледичії колючої листя”, “Гледичії колючої листя сухий екстракт”.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене теоретичне узагальнення та вирішення наукової задачі, що виявляється у комплексному фармакогностичному вивченні гледичії колючої з дослідженням основних груп біологічно активних речовин. Розроблена нова лікарська субстанція на основі БАР листя гледичії колючої, проведено її стандартизацію та досліджено біологічну активність.

1. Якісними реакціями і хроматографічними методами аналізу встановлена наявність у листі та стулках гледичії колючої різних груп БАР: полісахаридів, амінокислот, органічних кислот, сапонінів тритерпенової групи, алкалоїдів, гідроксикоричних кислот, кумаринів, флавоноїдів, антраценпохідних, дубильних речовин, жирних кислот, хлорофілів та каротиноїдів. Визначено вміст органічних кислот, аскорбінової кислоти, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, дубильних речовин, алкалоїдів у листі, антраценпохідних - у стулках.

2. Вперше проведено дослідження динаміки накопичення фенольних сполук: гідроксикоричних кислот, флавоноїдів та дубильних речовин у листях гледичії колючої та встановлені оптимальні терміни заготівлі сировини.

3. Вперше встановлено якісний склад та кількісний вміст вільних та зв'язаних амінокислот у листях і стулках гледичії колючої. В листях було виявлено 16, а у стулках 12 вільних амінокислот. У кількісному відношенні серед незамінних амінокислот у листях переважають лізин, лейцин, треонін і фенілаланін. Серед замінних амінокислот домінують глутамінова та аспарагінова кислоти, гліцин, серин та аланін. Слід відмітити, що стулки плодів містять значно меншу кількість амінокислот у порівнянні з листям. Досліджено елементний склад органів гледичії колючої. Виявлено наявність 15 елементів, з яких 7 - макро-, 7 - мікро- та 1 - ультраелемент. Методом хромато-мас-спектрометрії досліджений якісний склад і кількісний вміст летких компонентів ефірної олії листя гледичії колючої: з виявлених 46 речовин ідентифіковано 40.

4. Вперше проведено вивчення полісахаридів листя гледичії колючої. Досліджений кількісний вміст та мономерний склад полісахаридного комплексу, пектинових речовин, вміст відновлюючих і кислих цукрів. У водорозчинному полісахаридному комплексі відмічається значний вміст кислих цукрів (до 20,83%), що дає підставу прогнозувати його високу фармакологічну активність.

5. Вперше одержані ліпофільні екстракти з листя та стулок гледичії колючої. Вивчено їх якісний склад та кількісний вміст жирних кислот, хлорофілів та каротиноїдів. У ліпофільному екстракті з листя ідентифіковано 9 жирних кислот, з них на частку есенціальних кислот (б-ліноленової та лінолевої) припадає 44,76%, у стулках - 11 жирних кислот.

6. Методом розподільного фракціонування у системах рідина-рідина, адсорбційної, препаративної хроматографії на поліаміді, силікагелі та папері з листків та стулок гледичії колючої виділено та ідентифіковано 42 речовини. Структура речовин встановлена на основі фізико-хімічних властивостей, хімічних перетворень, даних ІЧ-, УФ-, ПМР-спектроскопії та порівнянням з достовірними зразками. З листя гледичії колючої виділено та встановлено структуру 27 речовин: 5 гідроксикоричних кислот, 4 кумаринів, 17 флавоноїдів, 1 алкалоїду. Зі стулок виділено та встановлено структуру 15 речовин: 4 гідроксикоричних кислот, 4 кумаринів, 7 флавоноїдів.

Вперше з листя гледичії колючої виділено 19 речовин: гідроксикоричні кислоти: неохлорогенова, ізохлорогенова, ферулова, кавова; кумарини: умбеліпренін, умбеліферон, скополетин, ізоскополетин; флавоноїди: ізорамнетин, мірицетин, мірицетин-3-О-рутинозид, мірицетин-3-О-глюкозид, кверцетин-3-О-генціобіозид, ізокверцетрин, ізорамнетин-3-О-генціобіозид, ізорамнетин-3-О-глюкозид, апігенін, апігенін-7-О-глюкозид, вітексин.

Зі стулок гледичії колючої виділено 8 речовин: гідроксикоричні кислоти: ізохлорогенова, ферулова, кавова; кумарини: умбеліпренін, умбеліферон, скополетин, ізоскополетин; флавоноїди: вітексин.

Вперше методом ВЕРХ визначено кількісний вміст 9 індивідуальних флавоноїдів у листях гледичії колючої. За вмістом переважають глікозиди мірицетину та апігеніну.

7. З метою стандартизації сировини визначені основні морфологічні та анатомічні діагностичні ознаки листя та стулок гледичії колючої. Видані методичні рекомендації “Відмінні макро- та мікроскопічні ознаки робінії звичайної (Robinia pseudoacacia L.) та гледичії звичайної (Gledіtsіa trіacanthos L.)”.

8. Вперше розроблена технологія одержання комплексу біологічно активних речовин з листя гледичії колючої (патент України на винахід № 96069). Проведено визначення гострої токсичності, протизапальної, знеболюючої та гіпотензивної активності. На моделях карагенінового набряку сухий екстракт листя гледичії колючої у дозах 50 і 100 мг/кг виявляє виражений протизапальний ефект і перевищує препарат порівняння - диклофенак натрію на 15,2 і 27,3% відповідно. Екстракт гледичії проявляє знеболюючий ефект, проте за силою дії він поступається диклофенаку натрію, а за гіпотензивною дією перевищує референс-препарат - папаверину гідрохлорид. Розроблений спосіб одержання субстанції з вираженими фармакологічними активностями: протизапальною, знеболюючою та гіпотензивною, дає змогу раціонального використання вітчизняних сировинних ресурсів, є економічним, безпечним і легко відтворюваним на підпр...