Ультраструктура хлоропластів листків шпинату та гороху за різних рівнів зв'язаного бікарбонату

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ ХАРЧОВОЇ БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА ГЕНОМІКИ НАН УКРАЇНИ»

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Ультраструктура хлоропластів листків шпинату та гороху за різних рівнів зв'язаного бікарбонату

03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія

Водка Марина Валеріївна

Київ - 2017

АНОТАЦІЯ

Водка М.В. Ультраструктура хлоропластів листків шпинату та гороху за різних рівнів зв'язанного бікарбонату - На правах рукопису.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 - цитологія, клітинна біологія, гістологія. - Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України, м. Київ, 2017.

В дисертаційній роботі представлено результати досліджень перебудов внутрішньої мембранної системи хлоропластів в залежності від різних рівнів мембранозв'язанного бікарбонату під впливом деяких абіотичних стресорів, а саме, органічних (ацетазоламід, етоксизоламід) і неорганічних (іони Cu2+ та Zn2+) інгібіторів карбоангідрази, імітованих кислотних дощів та підвищеної [CO2].. Викладені в роботі результати вказують на структурну роль карбоангідразо-залежної рівноваги СО2/HCO3? в динамічних змінах мембранної системи хлоропласту, тилакоїдної карбоангідрази у балансуванні бікарбонатного пулу в хлоропластах, а також бікарбонатного пулу в підтриманні ультраструктури тилакоїдних мембран.

Ключові слова: Pisum sativum L., Spinacea olearacea L., карбоангідраза, бікарбонат, хлоропласти, фотосинтетичний апарат, тилакоїди, грани, важкі метали, етоксизоламід, ацетозоламід, кислотні дощі, підвищена [CO2].

АННОТАЦИЯ

Водка М.В. Ультраструктура хлоропластов листьев шпината и гороха при разных уровнях связанного бикарбоната - На правах рукописи.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, клеточная биология, гистология. - ГУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики НАН Украины», г. Киев, 2017.

В диссертационной работе представлены результаты исследований перестроения внутренней мембранной системы хлоропластов в зависимости от разных уровней мембраносвязанного бикарбоната под воздействием некоторых абиотичных стрессоров, а именно, органических (ацетазоламид, этоксизоламид) и неорганических (ионы Cu2+ и Zn2+) ингибиторов карбоангидразы, имитированных кислотных дождей и повышенной [CO2].

В условиях эксперимента ингибиторы карбоангидразы вызвали незначительные изменения. Ацетазоламид, оказался более эффективным, чем этоксизоламид в изменении параметров структуры гран в обоих видах растений. Однако, если в шпинате разница незначительна, то показатели гороха демонстрируют более существенную разницу. Тилакоиды гран шпината и гороха почти одинаково реагировали на оброботку ионами тяжёлых металлов набуханием, тогда как люминальное пространство в гранах под влиянием тех же ингибиторов больше расширяется у гороха, чем у шпината. Влияние ионов Zn2+ является самым высоким для обоих исследуемых видов.

Проведённые биохимические исследования показали, что в присутствии 80 мкМ Cu2+ наблюдалась незначительная тенденция к снижению содержания бикарбоната в тилакоидах гороха, в присутствии 120 мкМ Zn2+ он составлял 185 нмоль/мг хлорофилла, или приблизительно 80 % от контрольной величины. Наибольший еффект отмечен в присутствии 500 мкМ АА - содержание бикарбоната достоверно снижалось и составляло 154 нмоль/мг хлорофилла, или приблизительно 70 % от контрольной величины. В сравнении с гидрофильным ацетазоламидом, липофильний этоксизоламид мало влиял на содержание бикарбоната, который достигал 205 нмоль/мг хлорофилла, то есть, 91 % от контрольной величины. Содержание бикарбоната в изолированных хлоропластах шпината составлял 250 нмоль/мг хлорофилла и практически не изменялся после обработки этоксизоламидом. Под действием ацетазоламида, ионов Cu2+ и Zn2+ содержание бикарбоната снижалось в среднем до 80% от контрольной величины.

Ингибиторы карбоангидразы снижали способность хлоропластов удерживать бикарбонат в связанном состоянии, что вызвало ультраструктурные и функциональные изменения тилакоидных мембран.

В диссертационной работе показано влияние кислотных дождей на структуру хлоропластов в листьях гороха и шпината. Характерным признаком этого влияния является потеря регулярности расположения элементов внутренней мембранной системы в четких рядах, как это наблюдается в хлоропластах из контрольных образцов. Теряется плотная упаковка гран вследствие значительного и неравномерного увеличения расстояния между соседними тилакоидами гран, появляется волнистость, особенно в тилакоидах стромы. При обработке листьев гороха смесью кислотных дождей с добавлением ионов меди или цинка общая структура хлоропластов испытывала незначительные изменения по сравнению с контрольными образцами.

В условиях воздействия имитации кислотного дождя и совместного действия ИКД с ионами Cu2+ или Zn2+ толщина тилакоидов гран и ширина люминальных промежутков в хлоропластах гороха и шпината увеличивается по сравнению с контролем. Наибольший эффект наблюдался при воздействии кислотных дождей с добавлением ионов цинка. Карбоангидразная активность препаратов хлоропластов из листьев гороха, обработанных кислотным раствором, была в три раза ниже, чем в контроле. Предполагается, что одной из причин описанных изменений ультраструктуры хлоропластов является накопление в гидрофобной фазе липидного бислоя в результате дегидратации при закислении СО2, который, в свою очередь, благодаря высокой растворимости в липидах, может нарушать структуру тилакоидных мембран. Для эффективного вывода СО2 из липидного бислоя необходима его гидратация в гидрофильном слое, обеспечивающаяся карбоангидразой, активность которой резко снижалась в условиях обработки кислотным дождем. Суммируя полученные нами данные о влиянии кислотных дождей на исследуемые растения, можно утверждать, что кислотные дожди вызывают значительные ультраструктурные изменения в хлоропластах растений, особенно гороха, где нарушается конфигурация расположения элементов их внутренней мембранной системы, из которых образуются массивные конгломераты, происходит набухание мембран и расширение люминальных промежутков в гранах.

В работе также продемонстрированы результаты исследований продувки хлоропластов газом с разной концентрацией СО2, а также продувки N2. Обработка изолированных хлоропластов шпината повышенной [СО2] вызвала некоторые модификации в структуре гран.

Изложенные в работе результаты указывают на структурную роль карбоангидразо-зависимого равновесия СО2/HCO3? в динамических изменениях мембранной системы хлоропласта, тилакоидной КА в балансировании бикарбонатного пула в хлоропластах, а также бикарбонатного пула в поддержании ультраструктуры тилакоидных мембран.

Ключові слова: Pisum sativum L., Spinacea olearacea L., карбоангидраза, бикарбонат, хлоропласты, фотосинтетический аппарат, тилакоиды, граны, тяжёлые металлы, этоксизоламид, ацетозоламид, кислотные дожди, вовышенная [CO2].

SUMMARY

Vodka M.V. Chloroplast ultrastructure of spinach and pea leaves at different levels of bound bicarbonate. - Manuscript.

The thesis for the degree of candidate of biological sciences (speciality 03.00.11 - cytology, cell biology, histology). - Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2017.

The current thesis is dedicated to the investigation of rearrangements in inner chloroplast membrane system according to the different levels of membrane-bound bicarbonate under the influence of some abiotic stressors, namely, organic (acetazolamide, ethoxyzolamide) and inorganic (Cu2+ and Zn2+ ions) carbonic anhydrase inhibitors, simulated acid rain and elevated [CO2].

The results obtained indicate the structural role of carbonic anhydrase-dependent equilibrium of СО2/HCO3? in the dynamic changes in the chloroplast membrane system.

Key words: Pisum sativum L., Spinacea olearacea L., carbonic anhydrase, bicarbonate, chloroplast, photosynthetic apparatus, thylakoid, grana, heavy metals, acetazolamide, ethoxyzolamide, inhibitors, acid rain, elevated [CO2].

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі мебранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Білявська Нінель Олександрівна Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, провідний науковий співробітник відділу мебранології та фітохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кравець Олена Адольфівна ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України», провідний науковий співробітник відділу геноміки та молекулярної біотехнології

кандидат біологічних наук Адамчук-Чала Надія Іванівна Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, науковий співробітник відділу загальної і грунтової мікробіології

Захист відбудеться «10» жовтня 2017 року о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.254.01 в ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а, тел. (044) 343 37 77, е-mail: d26.254.01@ukr.net

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» за адресою: 04123, м. Київ, вул. Осиповського, 2а, тел. (044) 343 37 77

Автореферат розісланий « » вересня 2017р.

Вчений секретар спеціалізованої ради, Баєр Г.Я. кандидат біологічних наук.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Різке зростання вмісту в атмосфері «парникових газів», особливо діоксиду вуглецю, яке спостерігається, починаючи з другої половини XX століття, негативно впливає на довкілля. Щорічні викиди СО2 в атмосферу Землі складають біля 25 млрд. тон.

Ключовим механізмом складної системи метаболічних реакцій, які забезпечують енергетичні потреби рослин, є фотосинтез, у результаті якого відбувається перетворення енергії світла в енергію хімічних зв'язків. Під дією зовнішніх чинників, серед яких виділяється вуглецеве забезпечення, відбувається трансформація фотосинтетичного апарату, в результаті якої може змінюватись енергетичний баланс рослинної клітини.

Фотосинтетична фіксація атмосферного вуглецю здійснюється під час «темнової» фази фотосинтезу за участю рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази (РБФК), водночас CO2 контролює «світлову» фазу, регулюючи електронний транспорт (Kiriziy et al., 2014). Підтримка бікарбонат-вуглекислотної рівноваги значною мірою залежать від активності карбоангідрази (КА), декілька молекулярних форм якої знайдено в хлоропластах. Для вивчення функцій карбоангідрази використовують специфічні інгібітори сульфаніламідної природи - ацетазоламід (АА) та етоксизоламід (ЕА). Функцію карбоангідрази також блокують метали Zn2+ та Cu2+, проте їхній вплив на КА досліджено недостатньо.

Для того, щоб підвищити фотосинтетичну ефективність необхідно встановити, яким чином змінюється енергетичний баланс хлоропластів за різних фізіологічних або стресових навантажень на метаболізм. Адаптація до нових зовнішніх факторів є додатковим навантаженням на енергосистему хлоропласту, оскільки індукція захисних механізмів і біосинтез компонентів, які беруть в цьому участь, вимагають додаткової енергії. Зміна енергетичного балансу клітини за умов існування, що постійно змінюються, поки досліджена ще недостатньо. Визначення наслідків впливу на рослини високих концентрацій атмосферного СО2, зокрема на структурно-функціональну організацію мембран хлоропластів, і пошук шляхів підвищення ефективності використання світлової енергії за несприятливих умов існування рослин є актуальними напрямками сучасних досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем відділу мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України: 2012-2016 рр. Тема №ІІІ-22-7.406 «Особливості енергетичного обміну в рослинних клітинах за різних рівнів вуглецевого забезпечення», Тема №ІІІ-61-12.412 «Клітинні та молекулярні механізми адаптації рослин до несприятливих змін екологічних чинників в природі та експерименті»

Мета і завдання дослідження. Основною метою дослідження було визначення перебудови внутрішньої мембранної системи хлоропластів в залежності від концентрації бікарбонату.

Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

1) З'ясувати вплив інгібіторів карбоангідрази на ультраструктуру хлоропластів листків дослідних рослин (in vivo);

2) Встановити ультраструктурні зміни фотосинтетичного апарату ізольованих хлоропластів, індуковані інгібіторами КА (Zn2+, Cu2+, АА, ЕА) за світлових та темнових умов;

3) З'ясувати вплив кислотних дощів та інгібіторів КА на ультраструктуру хлоропластів листків дослідних рослин;

4) Вивчити вплив різних концентрацій СО2 на ультраструктуру ізольованих хлоропластів

Робоча гіпотеза: Структурно-функціональна організація мембран хлоропластів може залежати від рівня бікарбонату.

Об'єкт дослідження: Структура та функціонування фотосинтетичного апарату за умов зміненого рівня мембранозв'язаного бікарбонату.

Предмет дослідження: Стан тилакоїдів хлоропластів листків гороху та шпинату за умов інгібування КА.

Методи дослідження: трансмісійна електронна мікроскопія, диференційне центрифугування, метод морфометрії, статистичні методи

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше виявлено вплив інгібіторів карбоангідрази - АА і ЕА - на структуру фотосинтетичного апарату, а саме на мембранну систему хлоропластів, що вказує на участь ферменту в утриманні СО2 тилакоїдними мембранами. Уперше встановлено, що іони важких металів порушують ультраструктурну будову хлоропластів листків гороху та шпинату, впливаючи на вміст бікарбонату в тилакоїдних мембранах. Встановлено, що за дії кислотних дощів змінюється ультраструктура мембранної системи хлоропластів. Під впливом підвищеної концентрації СО2 в препаратах ізольованих хлоропластів відбувається розпушення загальної структури гран і набрякання тилакоїдів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розкривають структурну складову механізму токсичної дії Cu2+ та Zn2+, кислотних дощів та підвищеної концентрації СО2, і можуть бути використані при розробці окремих питань стійкості рослин до дії абіотичних факторів.

Результати дисертаційної роботи можуть бути використані у навчальному процесі при викладанні цитології, екології рослин у вищих навчальних закладах, а також при проведенні фундаментальних і прикладних досліджень.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно здійснено інформаційний пошук і аналіз літератури, обґрунтовано мету і завдання досліджень, освоєно відповідні методи і проведено експериментальні дослідження. Інтерпретація і узагальнення результатів, підготовка матеріалів до публікацій проводилася за участю наукового керівника. Дослідження вмісту бікарбонату, активності карбоангідрази та продувка хлоропластів різними концентраціями СО2 проводились спільно з к.б.н. Поліщуком О.В. та аспірантом Хомочкіним А.П. Частка особистої участі здобувача становить понад 70%.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати досліджень, які увійшли до дисертаційної роботи, були представлені на конференції «Біотехнологія ХХІ ст.»- НТУ «КПІ» - Київ - 2012; XX Пущинських читаннях по фотосинтезу та Всеросійській науковій конференції “Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе” - Пущино, РФ - 2012; VII та VIIІ Міжнародних конференціях молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери»- Харків - 2012, 2013; Міжнародній конференції молодих учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології» - Щолкіне - 2013; Науково-практичній конференції «Ботанические чтения» - Ишим, РФ - 2013; 2-ій та 3-ій Міжнародних наукових конференціях з морфології рослин «Сучасна Фітоморфологія» - Львів - 2013, 2014; Науковій конференції молодих дослідників «Теоретичні та прикладні аспекти збереження біорізноманіття» - Умань - 2013; Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання біології, медицини та фармакології» - Дніпропетровськ - 2013; Міжнародній науково-практичній конференції «Проблемы и перспективы исследований растительного мира» - Ялта - 2014; III Міжнародній науково-практичній конференції «Биоразнообразие и устойчивое развитие» - Симферополь - 2014; Міжнародній конференції молодих учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології» - Умань - 2014; Науковій конференції «Біологічні дослідження» - Житомир - 2015; Науковій конференції «Фотосинтез и фотобиотехнология. Фундаментальные и прикладные аспекты» - Пущино, РФ - 2015; VI відкритому з'їзді фітобіологів Причорномор'я - Херсон - 2015; Міжнародній конференції молодих учених «Актуальні проблеми ботаніки та екології» - Полтава - 2015; VІ Міжнародній заочній науково-практичній конференції: «Розвиток науки у XXI столітті» - Харків -2015; V З'їзді біофізиків Росії - Ростов-на-Дону - 2015; II Международной конференции «Наука как движущая антикризисная сила» - Київ - 2015; III Міжнародній науковій конференції «Наука в современном мире» - Київ - 2015.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 31 роботу, серед яких 5 статей у спеціалізованих фахових наукових виданнях, затверджених МОН України, і 26 тез доповідей на наукових конференціях і з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, розділів: огляд літератури, опис об'єктів і методів досліджень, пятьох експериментальних розділів, узагальнення, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 158 сторінках комп'ютерного друку, містить 53 рисунки і 11 таблиць. Список використаних джерел включає 177 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

У огляді літератури наведено аналіз даних щодо ролі карбоангідрази та бікарбонату у функціонуванні фотосинтезу. Подано загальну характеристику, основні форми, біологічні функції карбоангідраз та бікарбонату. Для того, щоб повною мірою підтвердити робочу гіпотезу, було опрацьовано широкий спектр чинників, які можуть впливати на рівень бікарбонату. Проаналізовано відомі дані щодо дії інгібіторів карбоангідрази, впливу важких металів, кислотних дощів та високих концентрацій СО2 на ультраструктуру різних рослин. На основі аналізу даних літератури обґрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи, визначено напрямки та основні завдання роботи.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Підготовка рослинного матеріалу. У роботі використовували рослини гороху Pisum sativum L. та шпинату Spinacea olearacea L., які вирощували в контрольованих умовах. Вибір об'єктів досліджень був обумовлений такими цінними якостями цих культур, як швидкий ріст та невибагливість до умов освітлення, аерації.

Насіння гороху замочували у проточній воді протягом декількох годин. Потім стерилізували у слабкому розчині перманганату калію, промивали у дистильованій воді і розташовували у вологій камері в термостаті при 23 °С. Через 2-3 доби насіння з маленькими корінцями розміщували у скляну ємність, накривали вологим фільтрувальним папером, зверху ємність накривали чохлом з чорного паперу для створення умов вирощування насіння у темряві. Через тиждень рослини переносили у горщики з ґрунтом, який обробляли середовищем Кнопа. Під час дослідження підтримувалась постійна температура 23 ± 1 ?С та постійна освітленість 150 мкмоль квантів/м2•с. Тривалість вирощування рослин гороху - 2 тижні, шпинату - 4-6 тижнів.

Виділення хлоропластів. Щойно зрізані листки гороху або шпинату витримували в холодильнику при 4-6 ?С протягом 2-3 годин. Потім у листків шпинату вирізали жилки і отримані фрагменти подрібнювали у блендері в середовищі виділення наступного складу: 0,4 М сорбітол; 0,05 M трицин-NaOH (pH 7,8); 0,01 M NaCl і 0,01 M аскорбат натрію. Аскорбат натрію готували безпосередньо перед дослідом, змішуючи еквімолярні розчини аскорбінової кислоти і гідрокарбонату натрію. Для подрібнення 100 г листків рослин використовували 300 мл середовища виділення. Отриманий гомогенат фільтрували через два шари полотна, хлоропласти осаджували при 3500 g протягом 7 хв. Потім осад ресуспендували в середовищі зберігання такого складу: 0,1 М сорбітол; 0,01 M NaCl; 0,025 М MgCl2; 0,01 M трис-HCl (pH 7,8-8,0) і центрифугували протягом 1 хв. при 800 g для видалення фрагментів клітинних стінок та інших важких часток. Супернатант центрифугували протягом 7 хв. при 3500 g. Осад хлоропластів суспендували в середовищі зберігання до концентрації 4 мг хл/мл і зберігали в темряві при температурі 20 ?С (Avron, 1960). Відомо, що часткова інактивація ФСII при зберіганні хлоропластів пов'язана з вивільненням ліпопротеїнів і вільних жирних кислот (ВЖК), що викликається активацією ліполітичних ферментів (Constantopoulos, 1968). Для зниження вивільнення ВЖК у середовище додавали 0,2-0,4 М неіонних осмотиків (манітол, сорбитол, сахароза).

Обробка хлоропластів інгібіторами карбоангідрази. В роботі використовували такі інгібітори карбоангідрази: водорозчинний ацетазоламід (N-(5-сульфамоїл-1,3,4-тіадіазол-2-їл)ацетамід) (АА); ліпофільний етоксизоламід (6-етокси-2-бензотіазол-сульфонамід) (ЕА); іони Zn2+ (ZnSO4); іони Cu2+ (CuSO4).

Синтетичні інгібітори АА та ЕА розчиняли в ДМСО до концентрації 100 мМ і додавали в суспензію хлоропластів, доводячи до кінцевої концентрації 500 мкМ, неорганічні інгібітори ZnSO4 - до 200 мкМ, CuSO4 - до 80 мкМ. Вибір концентрацій інгібіторів, а саме металів Zn2+ (ZnSO4), Cu2+ (CuSO4) робили шляхом експериментального підбору, обирали концентрації, які призводили до інгібування росту рослин. На 7-му добу проростання горох пересаджували на розчин з відповідними концентраціями інгібыторыв. Заміри довжини стебла та кореня проводили на третю та п'яту добу обробки металами. З отриманих даних будували криву концентрацій, за допомогою якої визначили, що цинк інгібує ріст та розвиток 50% рослин у концентрації - 200 мкМ, а мідь - 80 мкМ. Препарати інкубували на холоді, контролюючи швидкості фотохімічних реакцій. «Світлові» зразки хлоропластів залишали при освітленності 150 мкмоль квантів/м2•с, а «темнові» зразки залишали в повній темряві на 2 години.

Листки інтактних рослин обробляли тими ж концентраціями інгібіторів. Щойно зрізані листові пластини гороху та шпинату занурювали у чашки Петрі, які були наповнені розчинами інгібіторів, на 2,5 доби при температурі 22 °С та освітленості 150 мкмоль квантів/м2•с. Після цього фрагменти листків гороху та шпинату фіксували для дослідження ультраструктурних змін в хлоропластах методом трансмісійної електронної мікроскопії.

Визначення карбоангідразної активності. Карбоангідразну активність ізольованих хлоропластів дослідних рослин визначали за швидкісю виділення СО2 в реакції дегідратації бікарбонату натрію по методиці, яка розроблена у відділі мембранології та фітохімії Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (Семенихин, 2014). Швидкість реакції визначали по прискоренню потоку СО2 за допомогою інфрачервоного газового аналізатора Q-S151 (Qubit Systems, Канада).

Обробка рослинного матеріалу розчином, що імітує кислотний дощ. Проростки шпинату та гороху одноразово протягом 3 хвилин обприскували з пульверизатору 1 л суміші еквімолярних (0,2 мМ) розчинів NaNO3 та Na2SO4 з рН 5,6 (контрольний варіант) або з рН 2,5 (кислотний варіант). Потім рослини витримували ще 2 доби при температурі 22 °С та освітленості 150 мкмоль квантів/м2•с, після чого зразки листків гороху та шпинату фіксували для дослідження методом трансмісійної електронної мікроскопії.

Продування ізольованих хлоропластів різною концентрацією СО2. Основний вид обробки препаратів полягав у продуванні повітря зі зміненим складом над поверхнею суспензії хлоропластів, що інтенсивно перемішувалася. Обробка у всіх випадках тривала 15 хв при інтенсивному перемішуванні за температури 4 ?С у скляному бюксі об'ємом 20 мл при об'ємі препарату 2 мл. В експериментах здійснювалось 5 варіантів обробки хлоропластів:

1) контроль, без продування, СО2 (320 мкл/л);

2) продування повітрям, позбавленим СО2 (0 мкл/л);

3) продування повітрям з концентрацією СО2 350 мкл/л;

4) продування повітрям з концентрацією СО2 950 мкл/л;

5) продування азотом, тобто у відсутності як СО2, так і О2.

Об'ємна швидкість потоку газу при продуванні препаратів становила 400 мл/хв. Продування повітрям зі зміненою концентрацією СО2 здійснювалось за допомогою СО2-газометричної установки на основі інфрачервоного газоаналізатора S-151 («Qubit systems», Канада). Вилучення СО2 досягалось продуванням атмосферного повітря через 100 мл колонку з аскаритом. Збільшення вмісту СО2 досягалось отриманням СО2 в реакції бікарбонату натрію з оцтовою кислотою. Повітря накачувалось через колонку з аскаритом у резервуар об'ємом 200 л, потім, за необхідності, додавали СО2, періодично перевіряючи концентрацію СО2 в резервуарі. При продуванні препаратів відбувався постійний контроль швидкості потоку газу та концентрації СО2 у ньому (Водка, Поліщук та ін., 2017).

Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктури. Для електронно-мікроскопічного дослідження ультраструктури препаратів хлоропластів шпинату В класу використовували концентровану суспензію після часткової дегідратації на фільтрах (Millipore, США). Препарати суспензії хлоропластів поміщали всередину агарових блоків.

З середньої частини половини листків проростків гороху та шпинату вирізали фрагменти розміром 2?2 мм. Фіксацію зразків проводили 2,5 % глутаровим альдегідом на 0,1 М какодилатному буфері, рН 7,8 (для ізольованих хлоропластів) та рН 7,2 (для листків проростків) протягом 4 год при 4 ?С. Після промивання у тому ж буфері (2 рази по 20 хв.) здійснювали постфіксацію матеріалу розчином 1 % ОsO4 на 0,1 М какодилатному буфері впродовж ночі при 4 ?С. Зневоднення проводили, промиваючи проби в етиловому спирті зростаючої концентрації та ацетоні. Після цього матеріал просочували у суміші епоксидних смол та ацетону, заливали у епон-аралдитну смолу. Потім блоки переносили у термостат для полімеризації при 60 ?С протягом 3 діб (Карде, 1987).

Ультратонкі зрізи хлоропластів або клітин товщиною 80-100 нм виготовляли за допомогою ультрамікротому LKB-V (LKB, Швеція). Зрізи контрастували сумішшю насиченого розчину ураніл-ацетату та 1 % розчину перманганату калію (1:1) протягом 15 хв. у темряві. Ультратонкі зрізи досліджували і фотографували у трансмісійному електронному мікроскопі JEM-1300 (JEOL, Японія) при 80 кв. Зображення зрізів препаратів отримували на плівці для електронної мікроскопії типу EB19H (AGFA, Бельгія). Негативи фотографій хлоропластів переводили в цифровий формат на сканері типу Epson Perfection 3200 Photo scanner та аналізували за допомогою комп'ютерних програм Adobe Photoshop 7.0 та Corel Photo-Paint 11. Морфометричний аналіз зображень хлоропластів проводили за допомогою комп'ютерної програми ImageJ (NIH, США). Для кожного варіанту досліду і контролів аналізували по 30-39 фотографій із загальним збільшенням ?10000, 15000 або 100000. Обробку результатів досліджень проводили за допомогою пакету прикладних програм Microsoft Excel 7,0, BIO8, Statistica 6.0. Розраховували величини середніх і стандартних квадратичних відхилень з урахуванням даних усіх трьох повторів дослідів. Експериментальні дані, наведені в таблицях і графіках, представлено у вигляді середнього арифметичного (M) зі стандартним відхиленням (m), визначеними з урахуванням усіх повторів. Достовірність різниці середніх значень між дослідними та контрольними варіантами оцінювали за допомогою t-критерію Ст'юдента. Різницю вважали статистично достовірною при Р ? 0,05.

бікарбонат шпинат фотосинтетичний кислотний

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив інгібіторів карбоангідрази на хлоропласти листків шпинату та гороху. З метою визначення впливу різних рівнів бікарбонату на структуру фотосинтезуючого апарату рослин досліджували хлоропласти листків двох видів рослин (шпинату та гороху), які обробляли інгібіторами карбоангідрази.

Отримані результати підрахунку розмірів мембран тилакоїдів гран та люмінального простору хлоропластів представлено на рис. 1. На рис. 2 показано вплив інгібіторів КА на структуру хлоропластів та їх гран у листках шпинату. Аналізуючи ультраструктурні дані щодо впливу специфічних інгібіторів карбоангідразної активності, слід зазначити, що гідрофільний препарат, ацетазоламід, виявився більш ефективним, ніж гідрофобний етоксизоламід, в зміненні параметрів структури гран у обох видів рослин, проте якщо у шпинату різниця порівняно з контролем є незначною, показники гороху демонструють більш суттєву різницю (див. рис. 1).



Рис.1. Товщина мембран тилакоїдів гран (а) та ширина люмінального простору (б) хлоропластів з листків гороху та шпинату під впливом інгібіторів карбоангідрази

Рис. 2. Ультраструктура хлоропластів листків шпинату, оброблених інгібіторами карбоангідрази. Контроль (а,б), вплив: АА (в,г), ЕА (д,е), Zn (є,ж), Cu (з,и). Примітка: Г - грана, Пг - пластоглобула, ТГ - тилакоїди грани, ТС - тилакоїди строми

Порівнюючи вплив різних інгібіторів карбоангідрази на загальну структуру хлоропластів та кількісні показники їх гран, слід відмітити, що такі обробки вносили більші зміни в ширину люмінального пропростору у гороху, ніж у шпинату. З наведених даних можна дійти до висновку, що як товстіші тилакоїди гран шпинату, так і тонші тилакоїди гороху майже однаково реагували на обробку іонами важких металів набуханням, тоді як люмінальний простір у гранах під впливом тих же інгібіторів більше розширюється порівняно з контролем у гороху, ніж у шпинату. Також відмічено більш слабкий вплив іонів міді, ніж інших інгібіторів на кількісні параметри компонентів гран хлоропластів у обох видів дослідних рослин. Такі результати для неорганічних інгібіторів, з одного боку, можна пояснити більш низькою доступністю іонів міді у порівнянні з іонами цинку, а з іншого боку, більшим внеском зв'язування іонів міді в апопластному компартменті клітин листків (Vazquez, 1992).

Найбільш поширеною реакцією на дію різних чинників, зокрема і важких металів, є збільшення кількості та розмірів пластоглобул, як це спостерігається і в наших зразках під дією міді. Такий же феномен виявлено у хлоропластах клітин з суспензійної культури Glycine max (Bernal, 2006), листків P. sativum (Doncheva, 2001), Oreganum vulgare (Panou-Filotheou, 2001), Elsholtzia splendens (Peng, 2005), Salix purpurea та Phragmitis australis (Hakmaoui, 2007) після обробки міддю.

Важкі метали можуть провокувати виникнення окислювального стресу (Demidchik, 2014), проявом якого є особливо небезпечне окислення ліпідів, оскільки через «ланцюгові реакції» утворюються вільні радикали. Окислення ліпідів (також відоме як перекисне окислення ліпідів) розглядають як одну з головних ознак окислювального стресу (Farmer, 2013). Не виключено, що саме окислювальний стрес є причиною часткової деградації пластоглобул, яка спостерігається в хлоропластах шпинату.

Отже, обробка листків гороху та шпинату іонами цинку та міді, інгібіторами карбоангідрази, викликала деякі модифікації в структурі хлоропластів, які можна класифікувати як вплив помірного ступеня. Очевидно, що таку помірну реакцію ультраструктури пластид з інтактних листків проростків гороху та шпинату, оброблених іонами важких металів, можна пояснити як короткотривалою експозицією в їх розчинах, так і низьким рівнем надходження цих іонів у клітини листків внаслідок їх активного зв'язування з компонентами клітинних оболонок.

Таким чином, проведені дослідження виявили помірний вплив інгібіторів карбоангідрази на структуру хлоропластів у листках проростків гороху та шпинату, проте не слід вважати, що досліджувані речовини у певних концентраціях досягали саме компонентів фотосинтетичного апарату. Тому наші подальші дослідження ми зосередили на вивченні реакцій ізольованих хлоропластів на інгібітори карбоангідрази.

Вплив інгібіторів карбоангідрази на ізольовані хлоропласти шпинату та гороху. Щоб визначити характер безпосереднього впливу різних за структурою та механізмом дії інгібіторів карбоангідрази на структуру фотосинтетичного апарату рослин, проводили ультраструктурні дослідження препаратів хлоропластів класу В, ізольованих із листків двох видів рослин (S. olearacea L. та P. sativum L.), які відрізняються за вмістом бікарбонату, за темнових та світлових умов проведення експериментів.

Рис.3. Товщина тилакоїдів гран (а) та ширина люмінального простору (б) ізольованих хлоропластів з листків шпинату під впливом інгібіторів карбоангідрази

Відмічено, що товщина мембран тилакоїдів гран у ізольованих хлоропластах з листків шпинату є вищою, ніж у гороху, для всіх досліджуваних інгібіторів КА. Це корелює з даними, отриманими на хлоропластах інтактних листків. Однак відносні показники приросту виявляються вищими у гороху.

Спостерігали найвищий приріст товщини мембран тилакоїдів за світлових умов у порівнянні з темновими умовами під впливом іонів Cu2+ у обох видів. Між тим, найвищі показники товщини мембран тилакоїдів серед інгібіторів у порівнянні з контрольними значеннями за різних умов освітлення мають хлоропласти, оброблені іонами Zn2+, у обох досліджуваних видів. У хлоропластів шпинату іони Cu2+ викликали найменший вплив на цей показник за різних умов освітлення. А у хлоропластів гороху на товщину мембран тилакоїдів слабко впливали ацетазоламід та етоксизоламід. Що стосується ширини люмінального простору, то у ізольованих хлоропластів гороху аналогічна закономірність простежується за різних умов освітлення: найнижчі показники притаманні впливу органічних інгібіторів, а найвищі - іонам важких металів; у хлоропластів шпинату люмінальний простір був найменшим за обох світлових режимів під впливом іонів Cu2+, вплив ацетазоламіду та етоксизоламіду характеризувався проміжними значеннями, тоді як вплив іонів Zn2+ є найвищим для обох досліджуваних видів (див. рис. 3 та 4). Тобто, за цим показником структури гран більш чутливим видом до дії інгібіторів карбоангідрази виявляється горох, ніж шпинат.



Рис.4. Товщина тилакоїдів гран (а) та ширина люмінального простору (б) в ізольованих хлоропластах з листків гороху під впливом інгібіторів карбоангідрази

Отже, можна констатувати, що використання рослин гороху для вивчення ефектів інгібіторів карбоангідрази на структуру гран, де відбуваються зміни концентрації бікарбонату є більш доцільним з огляду на його вищу чутливість, ніж рослин шпинату.

На рис. 5 представлено електронограми ізольованих хлоропластів гороху після дії інгібіторів КА за темнових умов. Найбільший ефект з усіх інгібіторів карбоангідрази викликають іони Zn2+, тоді як іони Cu2+, навпаки, мають найменший вплив на загальну структуру та кількісні показники гранальної системи хлоропластів.



Рис.5. Препарати хлоропластів гороху за темнових умов проведення експерименту. Контроль (а, б), вплив: АА (в г), ЕА (д, е), Cu (є, ж), Zn (з, и). Примітка:Г - грана, Пг - пластоглобула, ТГ - тилакоїди грани, ТС - тилакоїди строми

Проведені біохімічні дослідження показали, що в контрольних хлоропластах гороху вміст бікарбонату становив 225 нмоль/мг хлорофілу, що в молярному співвідношенні відповідає одній молекулі бікарбонату на кожні п'ять молекул хлорофілу, однак після обробки інгібіторами карбоангідрази його вміст знижувався. Вміст бікарбонату в ізольованих хлоропластах шпинату в контролі складав 250 нмоль/мг хлорофілу та практично не змінювався після обробки ЕА; під дією АА спостерігався найбільший ефект, тоді як під впливом іонів Cu2+ та Zn2+ вміст бікарбонату знижувався в середньому до майже 80% від контрольної величини (рис. 6). Таким чином, інгібітори карбоангідрази знижували здатність хлоропластів утримувати бікарбонат у зв'язаному стані, що викликало ультраструктурні та функціональні зміни тилакоїдних мембран.

Рис. 6. Вміст бікарбонату в препаратах ізольованих хлоропластів гороху та шпинату після обробки інгібіторами карбоангідрази

Отримані результати можна пояснити тим, що вуглекислота надходить у суспензію хлоропластів шляхом простої дифузії. Очевидно, що при постійних pH і температурі в темряві концентрації вуглекислоти в суспензії і в газовому об'ємі над суспензією врівноважуються. Освітлення викликає поглинання бікарбонату з розчину, що може бути пов'язане з формуванням трансмембранного протонного градієнта (Полищук и др., 2009). Таким чином, дані електронної мікроскопії свідчать про те, що обробка ізольованих із листків шпинату та гороху хлоропластів класу В інгібіторами карбоангідрази - ліпофільним ЕА, гідрофільним АА, важкими металами Cu2+ і Zn2+ - призводить до змін ультраструктурної організації фотосинтетичних мембран. Величина і спрямованість ефектів залежить від умов освітлення препаратів та виду рослини.

Вплив кислотних дощів на хлоропласти листків гороху та шпинату. Структуру хлоропластів з листків гороху під впливом кислотних дощів (КД) продемонстровано на рис. 7. Характерною ознакою цього впливу є втрата регулярності розташування елементів внутрішньої мембранної системи в чітких рядах, як це спостерігається у хлоропластах з контрольних зразків (рис. 7 а, б). Втрачається щільне пакування гран внаслідок значного і нерівномірного збільшення відстані між сусідніми тилакоїдами гран, виявляється хвилястість, особливо у тилакоїдів строми (рис. 7 в, г). Очевидно, це пов'язано зі значним набуханням усіх мембранних елементів, в результаті якого порушується їх просторова організація. Утворюються масивні конгломерати мембран, збільшується кількість пластоглобул. При обробці листків гороху сумішшю кислотних дощів з додаванням іонів міді або цинку загальна структура хлоропластів зазнавала незначних змін в порівнянні з контрольними зразками (рис. 7 д-ж).

Результати проведених досліджень дозволяють припустити, що сумісна дія кислотного дощу та іонів цинку або міді зменшує негативний вплив окремих факторів на структурно-функціональну організацію фотосинтетичного апарату, можливо, за рахунок підвищення антиоксидантної активності - посилення активності ферментів супероксиддисмутази та каталази, або/чи росту рівня небілкових тіолів. Цей феномен може бути пов'язаним зі зниженням надходження важкого метала у клітину внаслідок закислення апопласту.

Під дією КД та іонів цинку в хлоропластах спостерігали появу великих зерен крохмалю. Вищий вміст крохмалю в стромі хлоропластів дослідних рослин зумовлений затримкою його деградації, що узгоджується з даними інших авторів (Kratsch and Wise, 2000). Можливо, надлишкова кількість продуктів фотосинтезу перетворюється у крохмаль. Зберігання крохмалю, паралельно з іншими ультраструктурними змінами, очевидно, відбувається в результаті дисбалансу між фотосинтезом і експортом його продуктів (Gamalei, 1990).

У хлоропластів з рослин шпинату, вирощених у присутності кислих розчинів та іонів Zn2+ велика кількість крохмалю, яка накопичується в крохмальних зернах, ймовірно, руйнує їх інтактну структуру.

Рис. 7. Ультраструктура листків гороху. Контроль (а, б), вплив КД (в, г), КД+Cu2+ (д, е), КД+Zn2+ (є, ж). Примітка: Г - грана, Пг - пластоглобула, ТГ - тилакоїди грани, ТС - тилакоїди строми, КЗ - крохмальне зерно

За умов впливу імітації кислотного дощу та сумісної дії ІКД з іонами Cu2+ або Zn2+ товщина мембран тилакоїдів гран та ширина люмінального простору у хлоропластах гороху та шпинату збільшується у порівнянні з контролями (рис.8). Найбільший ефект спостерігався при впливі кислотних дощів з додаванням іонів цинку.



Рис. 8. Товщина тилакоїдів гран та ширина люмінального простору хлоропластів з листків гороху та шпинату під впливом кислотних дощів та Cu2+ або Zn2+

Однією з причин описаних змін ультраструктури хлоропластів є накопичення СО2 у гідрофобній фазі ліпідного бішару внаслідок його дегідратації при закисленні. СО2 завдяки високій розчинності в ліпідах, може порушувати структуру тилакоїдних мембран. Для ефективного виведення СО2 з ліпідного бішару необхідна його гідратація в гідрофільному шарі, що забезпечується карбоангідразою, активність якої різко знижувалася за умов обробки кислотним дощем (Полищук и др., 2016).

Підсумовуючи отримані нами дані про вплив кислотних дощів на дослідні рослини, можна стверджувати, що кислотні дощі спричинюють значні ультраструктурні зміни в хлоропластах рослин, особливо гороху, де порушується конфігурація розташування елементів їх внутрішньої мембранної системи, з яких утворюються масивні конгломерати, відбувається набухання мембран і розширення люмінального простору у гранах.

Вплив СО2 на структуру ізольованих хлоропластів шпинату. При продуванні газом з підвищеною [CO2] (950 мкл/л) ізольованих хлоропластів листків шпинату спостерігали зменшення кількості тилакоїдів в гранах, порушення їх пакування, а саме, відрив частини тилакоїдів від тіла гран, особливо на їх термінальних кінцях, нерівномірне і суттєве розширення люмінального простору (рис. 9 є, ж), а також різке збільшення товщини мембран тилакоїдів у порівнянні з контрольними зразками (табл. 1). Пластоглобули великого діаметру утворювали групи або ланцюжки з 2-12 включень, які тісно контактували між собою. Продування N2, за CO2- і O2-обмежуючих умов, не порушувало загальну форму хлоропластів, але кількість тилакоїдів в гранах значно зменшувалася у порівнянні з контролем (рис. 9 з, и); при цьому тилакоїди гран демонстрували набухання; термінальні тилакоїди гран відходили від тіла грани, значно зростали кількість та розміри пластоглобул. При продуванні хлоропластів газом без СО2 спостерігали варіабельність кількості тилакоїдів в гранах (від декількох до десятків), відбувалося незначне порушення пакування тилакоїдів гран, але при цьому структура тилакоїдів виглядала набряклою (рис. 9 в, г).

Рис. 9. Ультраструктура ізольованих хлоропластів з листків шпинату після продування: контроль без продування (а, б), без СО2 (в, г), з 350 мкл/л СО2 (д, е), з 950 мкл/л СО2 (є, ж), з N2 (з, и). Примітка: Г - грана, Пг - пластоглобула, ТГ - тилакоїди грани, ТС - тилакоїди строми

Таблиця 1. Вплив продування на ізольовані хлоропласти з листків шпинату (M±m), n=30

Варіант	Товщина тилакоїдів, 10-9 м	Ширина люмінальних проміжків, 10-9 м	Площа зрізу пластоглобули, 10-10 м2
Контроль	10,62 ± 0,16а	13,47 ± 0,19а	7,57 ± 0,15а
N2	13,50 ± 0,15в	22,84 ± 0,21г	14,25 ± 0,13в
0 мкл/л СО2	11,53 ± 0,21б	18,59 ± 0,11б	8,07 ± 0,18б
350 мкл/л СО2	14,25 ± 0,12г	20,62 ± 0,15в	14,76 ± 0,17г
950 мкл/л СО2	15,62 ± 0,20д	24,48 ± 0,25д	19,22 ± 0,11д

Примітка. Різними літерами в колонках позначено показники, що відрізняються з імовірністю Р?0,05

Товщина тилакоїдів, як і ширина люмінальних проміжків збільшувалися у порівнянні з контролем (див. табл. 1). За умов впливу продування з 350 мкл/л СО2 загальна структура хлоропластів зазнає змін, піддається перебудовам також гранальна система хлоропластів: набрякання тилакоїдів гран та часткове розходження гран внаслідок розширення люмінальних проміжків (рис. 9 д, е). Ширина люмінальних проміжків статистично зростає у порівнянні з контролем (див. табл. 1). Суттєво збільшується розмір пластоглобул.

Як видно з табл. 1, найбільший вплив на виділені хлоропласти листків шпинату мало продування підвищеною [CO2]. Ряд варіантів продування у порядку зменшення їх впливу на кількісні характеристики хлоропластів можна представити наступним чином:

950 мкл/л СО2 > 350 мкл/л СО2 > N2 > 0 мкл/л СО2

Існують різні відомості про вплив підвищеної концентрації CO2 на фотохімічну активність та швидкість фотосинтетичної фіксації CO2 (Гончарик и др., 2014). Набухання або порушення тилакоїдів, спричинене збільшенням концентрацій CO2 істотно варіювало залежно від терміну експозиції в CO2, виду рослини або стадії розвитку. На клітинах інтактних рослин було встановлено, що підвищена концентрація CO2 впливала на стромальні та гранальні тилакоїди хлоропластів. Griffin et al. (2001) вивчали тилакоїди у трав'янистих (Glycine max, Abutilon theophrasti) і деревних (Piper auritum, Pinus radiata, Epipremnum pinnatum, Acer rubrum, Liquidambar styraciflua, Cercis canadensis) рослин, що розвивалися за різних умов збагачення CO2. Досліджувався вплив високої концентрації CO2 (1000 ppm) на ультраструктуру листків Pfaffia glomerata (Saldanha et al., 2014). В цій роботі показано, що хлоропласти рослин, які росли при 360 ppm, мали достатньо диференційовані стопки гран та тилакоїди строми. Однак при 1000 ppm в хлоропластах листків спостерігалося зменшення кількості гран та набрякання мембран тилакоїдів. Отримані нами дані підтвердили, що обробка ізольованих хлоропластів шпинату підвищеною [CO2] призводить до помітних перебудов структури листків та фотосинтетичного апарату рослин.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі досліджено тилакоїдну систему гран хлоропластів у листках гороху, шпинату та в суспензії ізольованих з них хлоропластів за різних рівнів мембранозв'язаного бікарбонату під впливом деяких абіотичних стресорів. Виявлено закономірності впливу інгібування карбоангідрази на ультраструктуру мембран хлоропластів. Встановлено участь карбоангідрази в підтриманні структури гранальної системи хлоропластів.

1. Встановлено структурну гетерогенність реакцій хлоропластів з інтактних листків у двох видів рослин на дію інгібіторів карбоангідрази. Така гетерогенність може бути пов'язана зі структурними відмінностями хлоропластів листків гороху та шпинату.

2. Вперше досліджено сумісний вплив темноти/освітлення та інгібіторів карбоангідрази на структуру ізольованих хлоропластів гороху та шпинату: зафіксовано збільшення порівняно з контролями товщини тилакоїдів гран та ширини їх люмінальних проміжків в темноті і посилення цих ефектів освітленням.

3. Інгібітори карбоангідрази впливали на гранальну систему інтактних та ізольованих хлоропластів та знижували здатність хлоропластів утримувати бікарбонат у зв'язаному стані, що викликало ультраструктурні та функціональні зміни тилакоїдних мембран.

4. Кількісні показники структурних параметрів гранальної системи інтактних та ізольованих хлоропластів показали, що за ступенем впливу на структуру тилакоїдів гран досліджені інгібітори карбоангідрази розміщуються в такій послідовності: іони цинку > ацетазоламід > етоксизоламід > іони міді.

5. Кислотні дощі порушують ультраструктуру хлоропластів, викликаючи суттєві зміни в мембранній системі, а також впливають на деякі ланки функціонування фотосинтетичного апарату та інгібують карбоангідразну активність.

6. Обробка ізольованих хлоропластів шпинату підвищеною [CO2] викликала значні модифікації в структурі гран. Це дозволяє припустити, що надлишок СО2 впливає на активність карбоангідрази і таким чином обмежує фотосинтез рослин.

7. Проведені дослідження виявили вплив інгібіторів карбоангідрази, імітованих кислотних дощів та підвищеної [CO2] на структуру гранальної системи хлоропластів шпинату та гороху. Отриманi данi можуть вказувати на структурну роль карбоангідразозалежної рівноваги СО2/HCO3? в динамічних змінах мембранної системи хлоропласту.

СПИСОК ОСНОВНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Водка М.В., Поліщук О.В., Білявська Н.О., Золотарьова О.К. Реакція фотосинтнтичного апарату шпинату на дію важких металів, інгібіторів карбоангідрази//Доп. НАН України. - 2013. - № 10. - С. 152-158 (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

2. Водка М.В., Полищук А.В., Белявская Н.А Золотарева Е.К. Действие тяжелых металлов на фотосинтетический аппарат и активность карбоангидразы хлоропластов гороха//Вісн. Харків. націон. аграрн. ун-ту. Сер. Біологія. - 2013 - вип. 3 (30) - С. 46-55. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

3. Polishchuk O.V., Vodka M.V., Belyavskaya N.A., Khomochkin A.P., Zolotareva E.K. The effect of acid rain on ultrastructure and functional parameters of photosynthetic apparatus in pea leaves//Cell and Tiss. Biol. - 2016. - V. 10, №3. - Р. 250-257. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

4. Семеніхін А.В., Водка М.В., Поліщук О.В. Кофакторна та структурна роль CO2 в хлоропластах // Укр. ботан. журн. - 2016. - Т. 73, №3. - C. 290-297. (Здобувач здійснила аналіз даних літератури, взяла участь у написанні та підготовці статті до друку).

5. Водка М.В., Поліщук О.В., Білявська Н.О., Золотарьова О.К. Вплив СО2 на структуру ізольованих хлоропластів шпинату // Вісн. Харків. націон. аграрн. ун-ту. Сер. Біологія. - 2017. - вип. 1 (40). - С. 50-60. (Здобувач провела дослідження, взяла участь в опрацюванні експериментальних даних та написанні статті).

6. Водка М.В., Білявська Н.О. Вплив важких металів на фотосинтетичний апарат хлоропластів шпинату//Біотехнологія ХХІ: Тези доп. ІV Всеукраїнської н-пр. конференції. - НТУ «КПІ», 2012 - С. 164-165.

7. Водка М.В., Белявская Н.А., Подорванов В.В., Онойко Е.Б., Семенихин А.В. Влияние тяжелых металлов на тилакоиды хлоропластов шпината//Ботанические чтения: мат-лы науч.-практ. конф. - Ишим: Изд-во ИГПИ им. П.П. Ершова. - 2012- С. 88-90.

8. Водка М.В., Золотарёва Е.К., Белявская Н.А., Полищук А.В. Влияние ингибиторов карбоангидразы на содержание связанного бикарбоната и ультраструктуру тилакоидных мембран// ХХ Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Разнообразие путей электронного транспорта и углеродного метаболизма при фотосинтезе» - Пущино. - 2012- С.16.

9. Водка М.В., Полищук А.В., Семенихин А.В., Белявская Н.А. Влияние ионов меди и цинка на структуру тилакоидных мембран изолированных хлоропластов шпината// Труды Международ. науч. конф. «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (19-21 июня 2012 г., Минск, Беларусь). Часть 2. - С. 157-159.

10. Водка М.В., Белявская Н.А., Полищук А.В., Онойко Е.Б. Перестройка тилакоидной системы хлоропластов под действием ингибиторов карбоангидразы// Труды Международ. науч. конф. «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (19-21 июня 2012 г., Минск, Беларусь). Часть 1. - С. 203-206.

11. Водка М.В., Белявская Н.А., Золотарёва Е.К. Ультраструктурные изменения тилакоидных мембран хлоропластов шпината под действием ингибиторов карбоангидразы// IV Съезд биофизиков России. Симпозиум IV «Новые тенденции и методы в биофизике». Материалы докладов. - Нижний Новгород, 2012. - С. 62.

12. Водка М.В., Полищук А.В. Влияние ингибиторов карбоангидразы на содержание связанного бикарбоната и ультраструктуру тилакоидных мембран//«Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали VII Міжнародної конференції молодих учених (20-23 листопада 2012 р., м. Харків. - Х: ФОП Шаповалова Т. М, 2012. - С. 210.

...