Отримання штамів-продуцентів роду Clostridium з підвищеним рівнем синтезу бутанолу

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Енергетичні та екологічні кризи спонукають переглянути питання ефективного використання природних відновлювальних ресурсів (Abd-Alla et al., 2015). Мікробіологічна конверсія відновлювальних ресурсів біосфери з метою одержання корисних продуктів, зокрема біопалива, наразі є однією з нагальних проблем біотехнології. Анаеробні бактерії родини Clostridiaсeae відомі як продуценти одного з видів біопалива - бутанолу, однак мікробіологічний синтез бутанолу під час класичного ацетон-бутанол-етанольного (АБЕ процес) бродіння на сьогодні є економічно невигідним. Для створення рентабельного ацетонобутилового бродіння, потрібні високопродуктивні штами, які б використовували доступну, поновлювану і дешеву сировину - відходи сільського господарства або рослинну біомасу (Menon et al., 2015).

Промислове виробництво бутанолу на основі мікробіологічного синтезу з'явилося на початку ХХ століття і було пов'язано (як супутній процес) з виробництвом ацетону (Linggang et al., 2013). Процес проходив з використанням харчової сировини - кукурудзяного борошна як субстрату, бактеріями Clostridium acetobutylicum з отриманням ацетону, бутанолу та етанолу у співвідношені 3:6:1 (Sreekumar et al., 2015). У класичній АБЕ-ферментації на початкових етапах бактерії C. acetobutylicum продукували масляну, пропіонову, молочну та оцтову кислоти (стадія утворення кислоти), згодом водневий показник знижувався і починалась стадія продукування бутанолу, ацетону, етанолу (стадія утворення спиртів). Збільшення попиту на бутанол та різкий ріст нафтохімічного виробництва призвели до того, що біотехнологічний процес отримання бутанолу став економічно недоцільним і був замінений більш ефективним хімічним синтезом. В останні роки поновився інтерес до мікробіологічного процесу отримання бутанолу не лише як сировини при виробництві пластиків, фарб і лаків та застосуванні у друкарстві, фармацевтиці, але і як альтернативного палива (DeJaco et al., 2016). Сьогодні на біопаливо приходиться лише 2% від всіх видів палив, які використовуються. За прогнозами об'єми використання біопалива на ринку пального в найближчі десять років сягне 30% (Solecki et al., 2013).

Дослідження останніх років пов'язані з пошуком нових продуктивних штамів-продуцентів бутанолу та використанням нехарчової сировини як субстрату (Shang-Tian et al., 2005; Bruant et al., 2010). Тому, пошук, створення та ідентифікація нових штамів-продуцентів бутанолу, оптимізація етапів культивування з використанням нехарчової сировини як субстрату є актуальною проблемою. У даній роботі використовували, як сировину, дротовидне просо Panicum virgatum L., компоненти дротовидного проса - целюлозу, арабіногалактан і лігнін та технічний гліцерин і скоп.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України» в рамках відомчих тематик відділу промислової та харчової біотехнології «Створення ефективних штамів-продуцентів бутанолу, здатних до ферментації біосировини з підвищеним виходом цільового продукту» (2007-2012 р.р., № державної реєстрації 0111U001489); «Удосконалення технології біобутанолу з використанням альтернативних субстратів та вітчизняних штамів-продуцентів» (2013-2017 р.р., № державної реєстрації 0113U005527).

Мета та завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи - виділити та відселекціонувати штами-продуценти бутанолу роду Clostridium та розробити теоретичні основи біотехнологічного процесу отримання бутанолу.

Для досягнення поставленої мети сформульовано такі завдання:

- виділити із природних джерел штами-продуценти бутанолу;

- дослідити фізіологічні та культурально-морфологічні властивості виділених штамів-продуцентів;

- провести ідентифікацію виділених штамів-продуцентів за допомогою секвенування гена 16S рРНК;

- здійснити порівняльну оцінку продуктивності виділених штамів-продуцентів з існуючими;

- здійснити культивування отриманих штамів на нехарчовому субстраті;

- за допомогою хімічного мутагенезу отримати штам з підвищеним продукуванням бутанолу;

- дослідити фізіологічні та культурально-морфологічні властивості отриманих селекційних штамів та оптимізувати умови культивування селекційного штаму;

- підвищити накопичення бутанолу за культивування на нехарчовій сировині за допомогою проміжних речовин АБЕ процесу (масляної, оцтової та молочної кислот).

Об'єкт дослідження - мікробіологічний синтез бутанолу.

Предмет дослідження - зміна рівня синтезу бутанолу штамами роду Clostridium за допомогою селекції і оптимізації умов культивування.

Методи дослідження - мікробіологічні (антибіотикочутливість, морфологічні властивості штамів), фотоелектроколориметричні (визначення концентрації масляної кислоти), газова хроматографія (визначення концентрації розчинників), спектрофотометричні (визначення концентрації біомаси бактерій), молекулярно-генетичні (виділення ДНК, ПЛР-аналіз), хімічний мутагенез та статистичне оброблення результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Виділено та відібрано нові штами-продуценти бутанолу роду Clostridium. Визначено нуклеотидну послідовність гена 16S рРНК штаму IFBG C6H та проведено його філогенетичний аналіз. Послідовність гена 16S рРНК штаму ІМВ В-7407 (IFBG C6H) зареєстровано в базі даних GenBank (реєстраційній номер KU682660). Показано, що використання культуральної рідини після культивування на нехарчовій сировині як додатку до ензиматичного середовища, збільшує накопичення бутанолу на 25% для штаму IFBG C6H та на 35% для штаму IFBG C7P. Для отриманих штамів-продуцентів бутанолу визначено оптимальні параметри культивування.

Практичне значення одержаних результатів. Отримано штами-продуценти бутанолу роду Clostridium, які внесено до «Колекції штамів мікроорганізмів та ліній рослин для сільськогосподарської та промислової біотехнології» ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки НАН України». Культура ІМВ В-7407 (IFBG C6H) депонована в «Національному Депозитарії мікроорганізмів» Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Отримано за допомогою багатостадійної селекції штами-продуценти бутанолу для біоконверсії нехарчової сировини. Проведено інтенсифікацію синтезу бутанолу за допомогою хімічного мутагенезу та отримано стійкий штам роду Clostridium, який продукував на 45% більше бутанолу на нехарчовій сировині (біомасі дротовидного проса Panicum virgatum L.) в порівнянні з вихідним штамом. Попередня підготовка субстрату та оптимізація умов культивування дозволили збільшити продукування бутанолу селекційним штамом у 5 разів, у порівнянні з вихідним штамом. Встановлено, що використання зворотної барди в концентрації до 60% від об'єму ферментаційної суміші не впливало на синтез бутанолу, що дозволило суттєво зменшити відходи виробництва та витрати води. Отримані результати є науковим підґрунтям для отримання промислових штамів-продуцентів бутанолу.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем проведено аналіз літературних джерел, підготовано та написано наукові статті, сформульовано висновки щодо результатів роботи. Проведено експерименти з виділення, очищення та ідентифікації нових продуцентів бутанолу, їх мутагенез, молекулярно-біологічні дослідження та визначення фізіолого-біохімічних особливостей. Спільно з керівником проведено вибір об'єктів і напрямку досліджень, розроблено структуру дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації були представлені на ХІІ конференції молодих вчених «Наукові, прикладні та освітні аспекти фізіології, генетики, біотехнології рослин і мікроорганізмів» (м. Київ, Україна, 2012 р.); 15-му Міжнародному європейському біотехнологічному конгресі “New biotechnology” (м. Стамбул, Турція, 2012 р.), Міжнародному конгресі «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (м. Москва, Росія, 2013 р.), конференції-конкурсі молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2013» (м. Київ, Україна, 2013 р.), другій конференції молодих вчених 2013 року «Биология растений и биотехнология» (м. Київ, Україна, 2013 р.); міжнародній науковій конференції «Біологічні ресурси і новітні біотехнології виробництва біопалива»(м. Київ, Україна, 2014 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, у тому числі 7 статей у наукових фахових виданнях, що рекомендовано МОН України, 8 тез доповідей наукових конференцій.

1. Матеріали і методи досліджень

бутанол мікробіологічний культуральний

Для досліджень використовували мікроорганізми, виділенні з ґрунтів та мулів водойм і мулу очисних споруд м. Києва; біомасу дротовидного проса Panicum virgatum L. (отриману з Національного ботанічного саду ім. М. М. Гришка), компоненти дротовидного проса після автогідролізу (целюлоза, арабіногалактан та лігнін); гліцерин («Макрохім») та скоп Обухівського ЦПК.

Для визначення кількості мікроорганізмів (КУО) в зразках було використано поживне середовище бобово-пептонний агар (БПА) на основі бобового екстракту (Слісаренко, 1984). Для виділення спорових і знешкодження неспорових мікроорганізмів, всі зразки ґрунтів та мулів перед розсівом були піддані термічній обробці, яку проводили протягом 10 хв на водяній бані за температури 80С.

Як селективне використовували середовище Ешбі (Слісаренко, 1984). Для виявлення клостридіальних культур у колбу об'ємом 50 мл вносили 1 г кожної проби (ґрунту або мулу) та 30 мл середовища Ешбі. Засіяні колби поміщали до ексикатора.

Як тестові використовували два середовища: середовище Виноградського (Слісаренко, 1984) та середовище із скибок картоплі, натертих крейдою (Слісаренко, 1984). Чашки стерилізували протягом години за тиску 1 атм. Середовище Виноградського (об'єм 30мл) розливали у колби місткістю 50 мл, додавали 1 г відібраних зразків та вносили до ексикатора.

Для отримання окремих колоній було створено модифіковане агаризоване середовище Виноградського (МАВ) такого складу: дистильована вода - 1 л, глюкоза - 20 г, K2HPO4 - 1 г, MgSO4 - 0,5 г, NaCl - 0,01 г, FeSO4 - 0,01 г, MnSO4 - 0,01 г, CaCO3 - 20 г, дріжджовий екстракт - 2 г, вітамін В1 - 0,01 г, вітамін В12 - 0,01 г, тіамін гідрохлорид - 0,25 г, параамінобензойна кислота - 0,001 г, агар - 30 г. Середовище стерилізували протягом 30 хв за тиску 1 атм.

Для визначення властивості культур до збродження целюлози використовували середовище Омелянського (Слісаренко, 1984). Для визначення здатності штамів до збродження гліцерину використовували середовище наступного складу (г/л): гліцерин - від 30 до 180, дріжджовий екстракт - 1,0; (NH4)2SO4 - 0,6; (NH4)2HPO4 - 1,6; рН 6,5. Середовище стерилізували протягом 30 хв за тиску 1 атм. Як ензиматичне використовували середовище наступного складу (г/л): меляса - 55,0; (NH4)2SO4 - 0,6; (NH4)2HPO4 - 1,6; CaCO3 - 10,0; рН - 6,2. Середовище стерилізували протягом 30 хв за тиску 1 атм.

Для приготування заторів (кукурудзяного, картопляного, з дротовидного проса, тирси, скопу) брали наважки по 50,0 г відповідної речовини на літр води, та стерилізували протягом 2 год за тиску 2 атм (Слюсаренко, 1984). Для визначення оптимальної концентрації сировини аналізували затори з дротовидного проса, що містили наважки від 20,0 до 100,0 г/л.

Культивування мікроорганізмів на твердих середовищах проводили у анаеростаті «АЭ 01» (Росія) в атмосфері азоту. Анаеростат поміщали у термостат за температури 35±1С.

Для виявлення у культуральній рідині масляної кислоти використовували якісну реакцію отримання маслянокислого заліза. Наявність етанолу, ацетону та бутанолу в культуральній рідині визначали за допомогою газового хроматографа («Кристалл-5000 люкс») з полум'яно-іонізаційним детектором і набивною колонкою довжиною 3м, фаза - карбовакс 1500 на хроматоні N-A-W-DMSC (0,20-0,25 мм). Температура колонки 602C, випарювача 16050С, співвідношення потоків азот-водень-повітря 1:1:10.

Для виділення ДНК клітини бактерій брали з однодобової культури, отриманої на м'ясо-пептонному агарі, збагаченому (ЗМПБ) за температури 31±10С. ДНК виділяли за стандартною процедурою для грампозитивних бактерій (Wilson et al., 2001). Для більш ефективного лізису клітин додавали 1% лізоциму (Fermentas) (10 мг/мл). Виділену ДНК досліджували за допомогою горизонтального електрофорезу та ПЛР (Edwards et al., 2004). Електрофоретичне розділення виділеної ДНК проводили в 1%-му агарозному гелі в Трис-ацетатній буферній системі. Молекулярну масу фрагментів ДНК визначали за їх електрофоретичною рухливістю, використовуючи ДНК маркер (1kb Fermentas SM1163).

Ампліфікацію гена 16S рРНК здійснювали за допомогою універсальних праймерів (Fermentas, Латвія) 27f та 907r (27F 5'-AGAGTTTGATGGCTCAG-3'; 907r 5'-CCGTCAATTCCATTTGAGTTT-3') та 27f і 1492r (27F 5'-AGAGTTTGATGGCTAG-3'; 1492r 5'-TACGGTTACCTTGTTACGACT T-3'). ПЛР проводили на ампліфікаторі «Mastercycler personal 5332» (Eppendorf). Реакційна суміш складалася з однократного ПЛР-буфера з сульфатом амонію, 0,2 мкМ відповідних праймерів, 200 мкМ кожного з дезоксинуклеотидтрифосфатів, 0,5 од. Taq-полімерази (Fermentas, Латвія), 2,0 мМ хлориду магнію (Fermentas, Латвія), 10-50 нг ДНК-проби. Загальний об'єм реакційної суміші дорівнював 0,0002 мл.

Після ампліфікації генів нуклеотидну послідовність отриманого амплікону визначали за допомогою секвенатора «ABI PRISM 310 Genetic Analyser» (Applied Biosystems, США). Результат секвенування отримували шляхом порівняння прямої та зворотньокомплементарної послідовностей з використанням програми CLC Main Workbench (CLC bio). Гомологічні послідовності відбирали з бази даних GenBank. Молекулярно-філогенетичний аналіз здійснено за допомогою методу максимальної правдоподібності. Для з'ясування систематичного положення досліджуваних штамів зі спорідненими було проведено вирівнювання відповідних нуклеотидних послідовностей в програмі ClustalW та побудовано дендрограму філогенетичних зв'язків в програмі MEGA6.

Для отримання мутантних штамів із підвищеним накопиченням бутанолу використовували хімічний мутагенез (мутаген N-нітро-N-нітрозогуанідин (NTG). Для цього добову культуру IFBG C6H, вирощену на ЗМПБ, осаджували за швидкості 18000g протягом 20 хв за температури 20С. Осаджені клітини промивали один раз за допомогою пептозного (ПТ) буферу (пептон - 0,1 г, натрій хлор - 8,5 г, дистильована вода - 1 л). Клітини, з розрахунку 6Ч104 КУО/мл, переносили на свіже ЗМПБ, яке містило 50 мкг/мл NTG. Після інкубації протягом 15 хв оброблені клітини були відмиті тричі за допомогою ПТ буферу для видалення залишку NTG. Отримані мутанти були перенесені на свіже ЗМПБ для вирощування протягом 7 годин. Далі культуру промивали три рази за допомогою ПТ буферу для видалення залишків глюкози. Отримані культури переносились на агаризовані затори із дротовидного проса (50 г/л біомаси дротовидного проса, 30 г/л агару). Після 72 годин культивування отримані колонії було вивчено та проаналізовано. Колонії з найбільшою зоною просвітлення (найбільша амолітична активність) були перенесені на затори із дротовидного проса.

Статистичну обробку даних здійснювали, використовуючи програму Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 3 повтореннях. Різницю між двома середніми величинами вважали вірогідною при р<0,05 (Лакин, 1980).

2. Результати досліджень та їх обговорення

Виявлення мікроорганізмів збудників маслянокислого бродіння. Для виявлення мікроорганізмів - збудників маслянокислого бродіння та його різновиду, ацетонокислого бродіння, було досліджено 5 зразків ґрунту та 4 зразки мулу водойм міста Києва (табл. 1).

Проби зразків ґрунту та мулу були відповідно оброблено (Слюсаренко, 1984) та досліджено протягом першої доби. Для визначення кількості мікроорганізмів у кожному зразку було приготовано і висіяно на БПА суспензії відповідного розведення з ґрунту та мулу. Для накопичення культур маслянокислих бактерій зразки висівали на БПБ та протягом 168 год вели спостереження за зразками. Активне газоутворення відмічено в пробі IFBG C9Б, IFBG C6Н та IFBG C4В; незначне - в пробі IFBG C8З. В усіх пробах наявне помутніння середовища та специфічний запах, характерний для масляної кислоти.

Для отримання анаеробних азотфіксаторів зразки ґрунтів та мулів було розсіяно на тестове середовище Виноградського та термостатовано в ексикаторі за температури 30 0С протягом 168 год. Активне газоутворення та помутніння середовища спостерігали у пробах зразків IFBG C2М, IFBG C7Р, IFBG C3U, незначне - в IFBG C1М. В усіх пробах виявлено помутніння середовища та запах масляної кислоти.

Таблиця 1. Місця відбору зразків

Для визначення належності відібраних культур бактерій до клостридіального типу проведено фарбування живих препаратів за допомогою розчину Люголя. Клітини бактерій роду Clostridium містили гранульозу (Слюсаренко, 1984), крахмалоподібну речовину, яка при дії йоду забарвлювалась у синій колір (рис. 1).

Рис. 1. Морфологія культури IFBG C9Б, темним забарвлена гранульоза, збільшення 400

За допомогою цитологічного аналізу, встановлено, що у досліджених зразках представлено клітини бактерій клостридіальної форми, які в своєму складі містять гранульозу. В усіх зразках спостерігали один або більше видів мікроорганізмів, що мали форму паличок та були добре рухливі. У багатьох зразках було виявлено суміші культур, які надалі розділяли методом граничних розведень (Слюсаренко, 1984).

Для перевірки наявності маслянокислих та ацетонобутилових бактерій всі проби було перенесено на натерті крейдою скибки картоплі. Колонії маслянокислих бактерій на поверхні картоплі мали випуклу форму, жовтий колір і пухирці газу всередині. Аналізуючи форму, розміри, характер краю, забарвлення, структуру, консистенцію та поверхню колоній, зроблено висновок, що в усіх зразках виявлено різні штами маслянокислих бактерій.

Для очищення культур та отримання поодиноких колоній було модифіковано та агаризовано середовище Виноградського з урахуванням всіх потреб для бактеріального росту. Через 72 год культивування було отримано характерні колонії білого, сірого або жовтого кольору; у формі двояковипуклої лінзи, клаптика вати або “літачка”, із зоною прояснення навколо колонії (рис. 2).

Рис. 2. Колонії IFBG C4В, IFBG C9Б, IFBG C6Н на середовищі МАВ

Для встановлення чистоти та належності культур до роду клостридій було проведено цитологічне дослідження мікроорганізмів з отриманих колоній з використанням метиленового синього. Морфологія типового зразка представлена на рис. 3. В усіх зразках спостерігали палички з заокругленими кінцями, розташовані поодинці, попарно або у вигляді ланцюжка. Спори були розташовані термінально або субтермінально.

Рис. 3. Культура IFBG C9Б пофарбована метиленовим синім, збільшення 900

Для виявлення продуцентів бутанолу було проведено культивування всіх відібраних зразків на цукровмісному середовищі. Отримана культуральна рідина була перевірена на наявність бутанолу, ацетону та етилового спирту за допомогою газової хроматографії. У зразках IFBG C6Н, IFBG C7Р було виявлено бутанол та етанол. Кількість бутанолу становила 1,5 та 1,2 г/л, відповідно. Культуральна рідина зразку IFBG C1М містила етанол без бутанолу. Ацетон виявлено у незначних кількостях.

Ідентифікація штамів. У результаті проведених досліджень було відібрано два продуценти бутанолу (IFBG C6Н, IFBG C7Р) та проведено їх ідентифікацію культурально-морфологічними методами в декілька етапів. Першими етапом було фарбування спор. Спори фарбували за методом Пешкова (Слюсаренко, 1984). Забарвлення спор було блакитним або синім, забарвлення цитоплазми молодих клітин було рожевим або червоним. Зразки мали однакове розташування спор - субтермінальне. Спори мали овальну форму і “роздували” клітину. Другим етапом було дослідження джгутиків. Джгутики добової культури фарбували за методом Лефлера в модифікації Пешкова (Слюсаренко, 1984). Виявлено, що бактерії мали перитрихіально розташовані джгутики. Третім етапом було вивчення здатності культур до розрідження желатини. Для дослідження властивості клостридіальних культур до розрідження желатини, штами культивували на м'ясо-пептонній желатині. Порівняно з контролем зразок IFBG C7Р не розріджував желатину, а IFBG C6Н - розріджував (на желатині утворювався кратер лійкоподібної форми). У результаті ідентифікації бактерій за визначником бактерій Берджі (Хоулт та спів., 1980) виявлено, що культури IFBG C6Н та IFBG C4В належать до роду Clostridium.

Для встановлення філогенетичних зв'язків між штамом IFBG C6Н та іншими представниками роду Clostridium було здійснено філогенетичний аналіз на основі послідовностей генів 16S рРНК з бази даних GenBank. У роботі було застосовано два методи побудови філогенетичного дерева на основі нуклеотидного вирівнювання - метод "Максимальної правдоподібності" (Maximum likelihood, англ) та "Приєднання сусідів" (Neighbour joining, англ) (Tamura, 2013). Для вибору оптимальної структури філогенетичного дерева в першому методі на основі знання про частоти нуклеотидних замін, вираховують критерій правдоподібності, що є максимальним за такої структури дерева і моделює походження нуклотидних замін у досліджуваних послідовностях. В іншому методі - приєднання сусідів, на відміну від попереднього, структура філогенетичного дерева не моделюється, а вираховується на основі подібності між нуклеотидними послідовностями. Філогенетичне дерево, побудоване за допомогою методу приєднання сусідів показано на рис. 4. За допомогою методу Maximum likelihood отримано аналогічні результати.

Отримані результати підтверджують належність штаму IFBG C6H до роду Clostridium. Показано, що подібність секвенованих фрагментів 16S рРНК штаму IFBG C6H з фрагментами C. pasteurianum ATCC 6013 склала 99%. Таким чином, за допомогою молекулярно-філогенетичного аналізу послідовності гена 16S рРНК штаму IFBG C6H встановлено, що виділений штам належить до виду C. pasteurianum. За фізіологічними та культурально-морфологічними властивостями штам IFBG C6H було віднесено до виду C. acetobutylicum і депоновано в «Національному Депозитарії мікроорганізмів» Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України як C. acetobutylicum ІМВ В-7407. Враховуючи складність таксономії клостридій (Jonson et al., 1997; Keis et al., 1995; Wilkinson et al., 1995) та невідповідність культурально-морфологічних та фенотипічних особливостей штаму молекулярно-філогенетичному аналізу, штам C. acetobutylicum ІМВ В-7407 (IFBG C6H) було рекласифіковано на C. pasteurianum IFBG C6H.

Рис. 4. Дендрограма філогенетичних зв'язків штаму IFBG C6H

Ідентифікація нових штамів-продуцентів - це перший крок на шляху подальшого розроблення біотехнологічного процесу отримання біопалива з основними технологічними етапами - збільшенням накопичення бутанолу та використанням дешевої поновлювальної сировини.

Дослідження фізіологічних та біохімічних властивостей штамів-продуцентів бутанолу. Обсяги накопичення бутанолу при використанні різних джерел вуглецю можна збільшити за рахунок оптимізації метаболічних шляхів синтезу. Для встановлення джерел вуглецю, які входять до складу біомаси дротовидного проса Panicum virgatum L. (switchgrass) досліджено та визначено його компоненти. Основними компонентами біомаси дротовидного проса Panicum virgatum L. були целюлоза (35%), геміцелюлоза (29%) та лігнін (26%).

Для визначення здатності до зброджування різних компонентів біомаси дротовидного проса Panicum virgatum L. культури IFBG C6Н та IFBG C7Р було внесено в синтетичні середовища, що містили цукри, які входять до складу геміцелюлоз (рис. 5, а). Показано, що отримані штами можуть зброджувати манозу, глюкозу, целюлозу, арабінозу, ксилозу. Максимальне накопичення бутанолу (1,9 г/л) було отримано при використанні ксилози як джерела вуглецю для культивування штаму IFBG C6Н та при використанні целюлози штамом IFBG C7Р (1,3 г/л).

Одним із факторів, що впливає на ріст мікроорганізмів та їх фізіологічну активність є температура культивування мікроорганізмів (Пирог та спів., 2009). Досліджено вплив зміни температури культивування на накопичення бутанолу для штамів IFBG C6Н та IFBG C7Р (рис. 5, б). Показано, що підвищення температури з 28 до 360С призводить до підвищення накопичення бутанолу в обох штамів, подальше підвищення температури до 380С зменшувало вміст бутанолу у культуральній рідині. Подальші дослідження проводилися за температури 35 ±10С.

Рис. 5. Залежність концентрації бутанолу в культуральній рідині від: а - джерела вуглецю; б - температури культивування; в - водневого показника; г - тривалості культивування

Відомо, що рН середовища суттєво впливає на накопичення бутанолу (Пирог та спів., 2009), тому було проаналізовано вплив рН середовища на синтез бутанолу досліджуваними штамами (рис. 5, в). Встановлено, що максимальне накопичення бутанолу у культуральній рідині досліджуваними бактеріями відбувалося при рН 7,0 для штаму IFBG C6Н і становило 3,5 г/л, а для штаму IFBG C7Р - рН 6,0 і становило 2,5 г/л. Відмічено, що коливання рН від 5,0 до 7,0 несуттєво впливало на накопичення бутанолу штамом IFBG C7Р.

У зв'язку з тим, що процес АБЕ є біфазним, суттєвий вплив на накопичення бутанолу має тривалість культивування (Linggang et al., 2013). Було досліджено накопичення бутанолу IFBG C6Н та IFBG C7Р у культуральній рідині протягом різного часу (рис. 5, г). Показано, що оптимальною тривалістю культивування було 72 год. Подальше культивування виявилося недоцільним (кількість бутанолу не збільшувалась).

Відомо, що склад сировини є одним із основних факторів, що впливають на культивування штамів-продуцентів (Пирог та спів., 2009), тому було проведено порівняльне культивування як на класичних субстратах (кукурудзяний та картопляний затори) так і на нехарчових (затор з тирси, дротовидного проса та скопу) (рис. 6). Показано можливість отримання невеликих кількостей бутанолу на альтернативних субстратах за допомогою штамів IFBG C6Н та IFBG C7Р (1,7 та 0,8 г/л, відповідно) у порівнянні з класичними субстратами - кукурудзяним (2,3 та 1,6 г/л, відповідно) та картопляним (1,9 та 1,2 г/л, відповідно).

Рис. 6. Залежність концентрації бутанолу у культуральній рідині від складу поживного середовища

Виходячи з літературних джерел (Biebl et al., 2001) та отриманих результатів щодо подібності (99%) секвенованих фрагментів 16S рРНК штаму IFBG C6H і фрагментів C. pasteurianum ATCC 6013 було проведено культивування з використанням гліцерину, як основного субстрату для виду C. pasteurianum (рис.7).

За результатами дослідження було показано, що найбільше накопичення бутанолу (10,0 г/л) у культуральній рідині штаму IFBG C6H було за концентрації гліцерину 100,0 г/л. Проте, найбільша біоконверсія субстрату спостерігалася за концентрації гліцерину 50,0 г/л (накопичення бутанолу - 8,0 г/л). Отримані дані показують можливість використання гліцерину як субстрату для отримання бутанолу.

Для дослідження продуктивності штамів-продуцентів IFBG C7P та IFBG C6H визначено накопичення бутанолу в культуральній рідині в порівнянні з накопиченням цієї сполуки існуючими штамами-продуцентами (табл. 2).

Рис. 7. Вплив концентрації гліцерину на накопичення спиртів штамом IFBG C6Н

Таблиця 2. Синтез ABE продуктів різними штамами-продуцентами роду Clostridium

З таблиці 2 видно, що виділені штами-продуценти IFBG C7P та IFBG C6H продукували бутанол на середовищі з глюкозою і на всіх інших нехарчових субстратах, як і класичний штам C. acetobutyricum АТСС 824. На середовищі з глюкозою штам IFBG C6H накопичував більшу кількість бутанолу порівняно з штамами C. beijerinckii NCIMB 8052 та C. saccharoperbutylacetonicum N1-4, але меншу кількість, ніж штам C. pasteurianum АТСС 6013. Штами IFBG C7P та IFBG C6H зброджували ксилозу, арабінозу та целюлозу, на відміну від C. pasteurianum АТСС 6013, і зброджували гліцерин, на відміну від C. beijerinckii NCIMB 8052. Отримані дані свідчать про те, що досліджувані штами-продуценти, у порівняні з існуючими, можуть зброджувати широкий спектр сировини з високим продукуванням бутанолу. Виходячи з викладеного вище, штами IFBG C7P та IFBG C6H можуть бути основою для подальших досліджень з метою розроблення комерційної схеми виробництва бутанолу.

Через те, що штами могли зброджувати целюлозу в подальшому було проведено культивування на середовищі з додаванням целюлозовмісної сировини - фільтрувального паперу (рис. 8).

Рис. 8. Біоконверсія фільтрувального паперу (Н - IFBG C6H, Р - IFBG C7P, В - IFCG C4В, К - контроль)

Отримані дані показали, що біоконверсія нехарчової сировини (фільтрувального паперу) для штаму IFBG C6H склала близько 90%, для штаму IFBG C7P - 60%, а для IFCG C4В - 30%. При культивування на такій сировині усі штами виробляли оцтову та масляну кислоти у концентрації 4,0 г/л та майже не продукували спирти. Оскільки масляна та оцтова кислоти є попередниками спиртів у АБЕ процесі, культуральну рідину після ферментації було використано як додаток до ензиматичного мелясного середовища. У результаті проведеного дослідження було показано, що використання культуральної рідини після культивування нехарчової сировини, як додатку до ензиматичного середовища, збільшило вихід бутанолу для штамів IFBG C6H і IFBG C7P на 25% і 35%, відповідно.

Подальші дослідження були спрямовані на підвищення рівня накопичення бутанолу та отримання продуктивних мутантних штамів за допомогою хімічного мутагенезу. Як вихідний для мутації було обрано штам IFBG C6H.

Хімічний мутагенез. Для отримання мутантного штаму з підвищеним накопиченням бутанолу добову культуру обробляли мутагеном NTG у концентрації 50 мкг/мл протягом 30 хв. Після оброблення культури IFBG C6H мутагеном залишилось близько 1% живих клітин для відбору мутантів. Після висівання живих клітин на агаризоване середовище із дротовидного проса отримано 556 колоній бактерій. Усі колонії було проаналізовано та відібрано сім із них з найбільшою зоною прояснення навколо колоній (рис.9).

Рис. 9. Накопичення бутанолу мутантними та вихідним штамами на біомасі дротовидного проса

Накопичення бутанолу мутантними штамами у культуральній рідині при культивуванні на нехарчовій сировині (дротовидному просі) було різноманітним. Один із штамів (IFBG 1М) взагалі не продукував спиртів. Інший мутантний штам (IFBG C6H 5М) накопичував на 45% більше бутанолу, ніж вихідний штам. Це був найвищий показник продукції бутанолу серед отриманих штамів. Показано, що накопичення бутанолу у культуральній рідині після ферментації не змінювалось протягом 10 пересівів, що свідчило про стабільність штаму.

Штам IFBG C6H 5М, у порівнянні з вихідним штамом, мав аналогічну морфологію та фарбування за Грамом. Проте мутантний штам набув здатності до використання трегалози та аскуліну як субстрату.

Важливим фактором, який впливає на культивування мікроорганізмів є підготовка субстрату та його концентрація (Пирог та спів., 2009). Було проведено дослідження впливу концентрації біомаси дротовидного проса на продукування бутанолу. За результатами дослідження показано, що оптимальна концентрація біомаси дротовидного проса у ензиматичному середовищі склала 60,0 г/л, при збільшенні концентрації біомаси дротовидного проса у культуральній рідині концентрація бутанолу зменшувалась, хоча кількість мікроорганізмів збільшувалась.

Через те, що підготовка субстрату впливає на накопичення кінцевого продукту (Пирог та спів, 2009) було проведено дослідження залежності концентрації бутанолу від ступеня подрібнення вихідної сировини. Показано, що зі зменшенням розміру частинок дротовидного проса до 200 меш, концентрація бутанолу у культуральній рідині зростала прямо пропорційно. Дана залежність була отримана, як для мутантного, так і для вихідного штамів з кінцевим накопиченням бутанолу у культуральній рідині 2,5 г/л та 1,2 г/л, відповідно. Проведено дослідження культивування на різних компонентах дротовидного проса після вибухового автогідролізу. Показано можливість ферментації усіх отриманих компонентів з різним виходом бутанолу. Найбільше накопичення бутанолу спостерігалось при використанні целюлози і залишкової водної фази з цукрами .

Для порівняння продуктивності штамів IFBG C6H (вихідний штам) та IFBG C6H 5М (мутантний штам) було проведено культивування з урахуванням попередньої оптимізації технологічних параметрів. Отримані дані представлено на рис. 10.

Рис. 10. Накопичення розчинників на заторі з дротовидного проса

Оптимізація технологічних параметрів дала змогу підвищити накопичення цільового продукту для вихідного і для мутантного штамів на 20% і 50%, відповідно. При цьому, концентрація ацетону підвищувалась несуттєво (менше 1%), а етанолу не змінювалась.

На основі отриманих даних мутантний штам IFBG C6H 5М було вибрано як перспективний для подальших досліджень з інтенсифікації накопичення бутанолу.

Інтенсифікація накопичення бутанолу за культивування на нехарчовій сировині. Оскільки АБЕ бродіння є одним із різновидів маслянокислого бродіння, то для інтенсифікації накопичення бутанолу було проведено дослідження з використанням попередників синтезу спиртів, таких як молочна, оцтова та масляна кислоти (Xiao et al., 2012). Відповідні кислоти було додано на початку культивування до затору з дротовидного проса. Культивування було проведено спочатку з додаванням кожної кислоти окремо, а потім суміші кислот.

Отримані дані свідчать, що використання попередників синтезу, таких як молочна, масляна та оцтова кислоти, підвищувало накопичення бутанолу. Незначне стимулювання накопичення бутанолу спостерігалось при внесенні оцтової кислоти (до 3,7 г/л) та молочної кислоти (до 3,9 г/л) порівняно з контролем (3,5 г/л). Значне підвищення в 1,7 раза концентрації бутанолу спостерігалось при використанні суміші всіх трьох попередників, при цьому конверсія цукрів збільшувалась майже в двічі з 0,32 до 0,58. Додавання попередників до ензиматичного середовища не впливало на накопичення біомаси та питому швидкість росту. Слід відмітити, що співвідношення біомаси до спожитого субстрату зменшувалось з 0,38 до 0,29, відповідно. Така зміна кінетичних параметрів при використанні попередників свідчить про підвищення накопичення бутанолу за рахунок конверсії субстрату.

Для визначення оптимальної концентрації попередників синтезу було проведено культивування з різним співвідношенням їх концентрацій. Оптимальним було використання суміші молочної, оцтової та масляної кислот у співвідношенні 1:1:3, відповідно. Додавання попередників синтезу до затору кислот у такому співвідношенні підвищувало концентрацію бутанолу на 17%.

Важливою проблемою технології отримання бутанолу є відходи виробництва (Пирог та спів., 2009). Утилізація (упарювання) ацетонобутилової барди досить витратна. Для здешевлення процесу отримання бутанолу було запропоновано ацетонобутилову барду, одержану в процесі бродіння, повертати в процес культивування (рис. 11).

Рис. 11. Синтез бутанолу штамом IFBG C6H 5М на заторі дротовидного проса з використанням ацетонобутилової барди

Було показано, що використання зворотної барди в концентрації до 60% від об'єму ензиматичного середовища суттєво не впливало на синтез бутанолу штамом IFBG C6H 5М. При підвищенні концентрації барди у середовищі накопичення бутанолу лимитувалось. Такий результат дав можливість повернути до ензиматичного середовища 60% барди.

Таким чином, розроблено теоретичні основи біотехнологічного процесу отримання бутанолу бактеріями роду Clostridium. За допомогою хімічного мутагенезу отримано стійкий штам, який продукував на 45% більше бутанолу на нехарчовій сировині (біомасі дротовидного проса Panicum virgatum L.) в порівнянні з вихідним штамом. Попередня підготовка субстрату, додавання проміжних речовин та оптимізація умов культивування дозволили в 5 разів збільшити продукування бутанолу мутантним штамом, у порівнянні з вихідним.

Висновки

У роботі отримано нові штами-продуценти бутанолу роду Clostridium, вивчено їх характеристики та біологічні особливості, запропоновано методи підвищення накопичення бутанолу, показано можливість використання нехарчової сировини як субстрату та розроблено теоретичні основи біотехнологічного процесу отримання бутанолу.

1. Виділено дев'ять штамів маслянокислих бактерій з природних джерел (ґрунтів та мулів водойм м. Києва) та відібрано, за допомогою хроматографічного аналізу, два штами, які продукували бутанол.

2. Показано, що за фізіологічними та культурально-морфологічними властивостями отримані штами належать до роду Clostridium.

3. Визначено нуклеотидну послідовність гена 16S рРНК штаму IFBG C6H та побудовано філогенетичне дерево. Встановлено, що виділений штам належить до виду C. pasteurianum.

4. За оцінкою продуктивності виділених штамів встановлено, що штами IFBG C7P та IFBG C6H можуть зброджувати широкий спектр сировини з високим накопиченням бутанолу у порівнянні з існуючими штамами.

5. Показано можливість отримання бутанолу за допомогою штамів IFBG C6Н та IFBG C7Р на нехарчових субстратах - дротовидному просі (1,7 та 0,8 г/л, відповідно) і за допомогою штаму IFBG C6Н на гліцерині - 10,0 г/л.

6. За допомогою хімічного мутагенезу отримано штам IFBG C6H 5М, який продукував на 45% більше бутанолу, в порівнянні з вихідним штамом, при культивуванні на біомасі дротовидного проса Panicum virgatum L.

7. Показано, що оптимізація умов культивування (температури, рН, тривалості культивування, підготовки субстрату) підвищила синтез бутанолу в 2 рази.

8. Виявлено, що додавання проміжних речовин АБЕ бродіння у процесі культивування на біомасі дротовидного проса Panicum virgatum L. збільшувало накопичення бутанолу штамом IFBG C6H 5М на 17%.

Література

1. Тігунова О.О. Нові штами-продуценти біобутанолу. І. Виділення та ідентифікація / Тігунова О. О., Шульга С. М. // Biotechnol. Acta. - 2013. - Т.6, №1. - С. 97-104. (Дисертантка разом із співавторами виконала експериментальну частину, брала участь в написанні статті).

2. Тігунова О.О. Нові штами-продуценти біобутанолу. ІІ. Ферментація лігноцелюлозної сировини / Тігунова О. О., Шульга С. М. // Biotechnol. Acta. - 2014. - Т.7, №4. - С. 54-60. (Дисертантка разом із співавторами виконала експериментальну частину, брала участь в написанні статті).

3. Тігунова О. О. Використання мутантним штамом C. acetobutylicum лігноцелюлозної сировини як субстрата / Тігунова О. О., Шульга С. М. // Микробиология и биотехнология. - 2015. - №3. - С. 35-44 (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

4. Тігунова О. О. Нові штами-продуценти бутанолу. ІІІ. Способи підвищення накопичення бутанолу з біомаси дротоподібного проса Рanicum virgatum L. / Тігунова О.О., Шульга С.М. // Biotechnol. Acta. - 2015. - Т.8, №4. - С. 65-68. (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

5. Прийомов С.І. Філогенетичний аналіз штаму-продуценту бутанолу порівнянням послідовностей гена 16 S рРНК / Прийомов С.І., Тігунова О.О // Електроний журнал «Наукові доповіді НУБіП України» № 57 (Грудень), 2015. http://nd.nubip.edu.ua/2015_8/index.html (Дисертантка разом із співавторами брала участь у плануванні та проведенні експерименту, опрацювала та проаналізувала дані, брала участь в написанні статті).

6. Шульга С.М. Лігноцелюлоза як альтернативна сировина для одержання біобутанолу / Шульга С. М., Тігунова О. О., Блюм Я. Б. // Biotechnol. Acta. - 2013. - Т.6, №2. - С. 9-20. (Дисертантка разом із співавторами проаналізувала літературу та брала участь в написанні статті).

7. Tigunova O. A. Biobutanol as an alternative type of fuel / O. Tigunova, S. Shulga Blume Y. B.// Cytol Genet. - 2013. - 47(6). - Р. 366-382 (Дисертантка разом із співавторами проаналізувала літературу та брала участь в написанні статті).

8. O.Tigunova Obtaining of new butanol producers. / O. Tigunova, S. Shulga // Abstracts of 15th European Congress on Biotechnology, Istanbul, Turkey, 23-29 September 2012. - vol. 29, issue S. - р. S43.

9. Шульга С.М.Виділення та ідентифікація продуцентів біопалива / Шульга С. М., Тігунова О. О. // Тези конференції «Наукові, прикладні та освітні аспекти фізіології, генетики, біотехнології рослин і мікроорганізмів». - Київ, 2012. - С. 313-314.

10. Шульга С.М. Синтез бутанолу штамом C. acetobutylicum на альтернативних субстратах біопалива / Шульга С. М., Тігунова О. О. // Материалы 7-го Международного конгресса «Биотехнология: состояние и переспективы развития». - Москва, 2013. - с. 272.

11. Тігунова О.О.Виділення та ідентифікація нових вітчизняних штамів-продуцентів біобутанолу / Тігунова О. О., Шульга С. М. // Тези конференції-конкурсу молодих учених «Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2013». - Київ, 2013. - С. 23.

12. Тігунова О.О. Метаболічні особливості нових штамів-продуцентів бутанолу / Тігунова О. О. // Друга конференція молодих учених «Біологія рослин та біотехнологія» (Київ, 23-24 грудня 2013 р). - Київ, 2013. - С.96.

13. Тігунова О.О. Підвищення виходу бутанолу мутантного штаму C. аcetobutylicum на нехарчовій сировині. / Тігунова О. О., Шульга С. М. // Матеріали міжнародної наукової конференції «Біологічні ресурси і новітні біотехнології виробництва біопалива». - Київ, 2014. - С. 142-148.

14. Шульга С.М. Лігноцелюлоза як альтернативна сировина для одержання біобутанолу. / Шульга С. М., Тігунова О. О., Блюм Я. Б. // Матеріали міжнародної наукової конференції «Біологічні ресурси і новітні біотехнології виробництва біопалива». - Київ, 2014. - С. 200-204.

15. Шульга С.М. Бутанол - альтернативний вид біопалива. / Шульга С. М., Тігунова О. О., Блюм Я. Б. // Матеріали міжнародної наукової конференції «Біологічні ресурси і новітні біотехнології виробництва біопалива». - Київ, 2014 -. С 204-208.

Размещено на Allbest.ru