Молекулярно-біотехнологічні засади визначення типу сорту, статі та ураження Agrobacterium Tumefaciens хмелю звичайного

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Серед пріоритетних напрямів розвитку науки в ХХІ столітті біотехнологія визнана однією з основних. У зв'язку з ростом чисельності населення та активним зменшенням площ сільськогосподарських угідь, особливого значення набувають агробіотехнології, зокрема молекулярні біотехнології на основі молекулярних маркерів.

Хмелярство - важлива складова економіки багатьох країн світу, в т.ч. і України. Хміль звичайний Humulus lupulus L. є джерелом найбільш специфічної, незамінної та найдорожчої сировини для пивоваріння, але завдяки наявності унікальних біоактивних компонентів хміль використовують також у харчовій, медичній та фармакологічній промисловості.

Важливість галузі хмелярства для економіки України вимагає використання сучасних молекулярних біотехнологій для створення конкурентоспроможних сортів, що в свою чергу потребує розширення в Україні фундаментальних досліджень з геноміки хмелю. Створення високопродуктивних та високоякісних сортів обумовлено, зокрема, можливістю виявлення типу сорту на ранніх етапах онтогенезу у зразків, які у подальшому залучатимуться у селекційний процес, а також виявлення статі зразків та детекція збудника бактеріального раку рослин Agrobacterium tumefaciens.

При попередньому тестуванні зразків хмелю звичайного за даними ознаками виключається накопичення зайвого (баластного) садивного матеріалу. Тому розробка молекулярно-біотехнологічних підходів визначення типу сорту, статі та ураження A. tumefaciens хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) є актуальною та має як наукове, так і практичне значення.

Необхідним є ефективне розмноження селекційного матеріалу хмелю звичайного, вільного від фітопатогенів, зокрема, збудника бактеріального раку рослин A. tumefaciens. Використання для цих цілей хіміо- та термотерапії не забезпечує повного позбавлення від збудників, метод апікальних меристем є трудомістким. Розробка та використання молекулярно-біотехнологічних підходів для детекції фітопатогенів дозволяє проводити раннє та надійне виявлення ураження A. tumefaciens та подальше культивування in vitro здорового матеріалу.

Найціннішою частиною хмелю звичайного є шишки завдяки наявності комплексу специфічних смол, поліфенольних сполук, ефірних олій і біологічно активних речовин, які мають не тільки смакові і ароматичні, але і антибіотичні, антиокислювальні та лікувальні властивості. Головна мета селекції хмелю звичайного полягає в покращенні вмісту та якості вторинних метаболітів, що акумулюються в лупулинових зернах шишок. Тому актуальним є дослідження поліморфізму генів, пов'язаних з біосинтезом цих речовин, та використання молекулярних маркерів цих генів у селекції хмелю (для добору за допомогою маркерів, marker-assisted selection, MAS).

У промислових цілях культивують жіночі рослини хмелю звичайного. Чоловічі рослини використовують тільки в селекції для проведення гібридизації. Визначення статі рослин хмелю за фенотиповими ознаками провадиться на другий рік росту. Тому важливим для селекційної практики є питання раннього тестування статі зразка перед розмноженням.

Таким чином, розробка біотехнологічних підходів добору здорових зразків хмелю звичайного для подальшого клонального мікророзмноження та їх комплексної оцінки за складом і рівнем цінних вторинних метаболітів, статтю та наявністю захворювання на бактеріальний рак рослин на основі дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму певних генів та локусів геному хмелю звичайного є актуальною як з точки зору теоретичного аналізу, так і практичної значимості. Дані біотехнологічні підходи обумовлюють підвищення ефективності селекції хмелю звичайного через скорочення витрат праці, коштів, матеріалів, площ під посів в теплицях або у польових умовах та часу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі загальної та молекулярної генетики Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення (до квітня 2012 р. - відділ молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві) за завданнями «Розробити сучасні біотехнологічні методи оцінки різноманіття генофонду хмелю України з метою ідентифікації генотипів, їх збереження і використання у селекційному процесі» НТП 20 «Хміль» (№ держреєстрації 0109U001140) та «Маркування генів агрономічно важливих ознак хмелю звичайного та розробка біотехнологічних прийомів одержання нових сомаклонів» ПНД 23 «Сільськогосподарська біотехнологія 2011-2015 рр.» (№ держреєстрації 0111U006105).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в розробці молекулярно-біотехнологічних засад комплексної оцінки зразку хмелю за типом сорту, статтю, наявністю ураження A. tumefaciens та доборі вільного від A. tumefaciens садивного матеріалу з певними характеристиками.

Для досягнення поставленої мети визначено такі задачі:

1) молекулярно-генетичне та біоінформатичне дослідження поліморфізму генів вірулентності і патогенності (virD2 та ipt) Ті-плазміди A. tumefaciens; генетичний халконсинтаза хмель

2) добір зразків сортів хмелю звичайного, вільного від A. tumefaciens, в умовах in vitro;

3) біоінформатичне дослідження поліморфізму генів, що кодують халконсинтази chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, з бази даних GenBank Національного центру біотехнологічної інформації (National Centre for Biotechnology Information, NCBI);

4) дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму генів, що кодують халконсинтази, сортів хмелю звичайного української селекції;

5) виявлення зв'язку поліморфізму генів, що кодують халконсинтази, та типу сорту хмелю звичайного;

6) молекулярно-генетичний аналіз регіонів статевих хромосом, валідація статеспецифічних маркерів в колекції сортів та чоловічих зразків хмелю звичайного української селекції;

7) доповнення генетичних ідентифікаційних формул сортів хмелю звичайного української селекції, в яких відображено алельний склад мікросателітних локусів, даними щодо генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps.

Об'єкт дослідження: молекулярно-біотехнологічні особливості оцінки хмелю звичайного за типом сорту, статтю та наявністю ураження бактеріальним раком.

Предмет дослідження: поліморфізм генів, що кодують халконсинтази, і локусів, пов'язаних зі статтю, сортів хмелю звичайного та генів вірулентності і патогенності Ті-плазміди A. tumefaciens.

Методи дослідження: метод апікальних меристем використовували для введення в культур in vitro зразків хмелю звичайного; біоінформатичні методи (вирівнювання нуклеотидних послідовностей, анотація генів, кластерний аналіз) використовували для дослідження нуклеотидних послідовностей, отриманих з бази даних GenBank NCBI; молекулярно-генетичні методи (екстракція та очищення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), гель-електрофорез продуктів ампліфікації) використовували для дослідження поліморфізму ізольованої ДНК; математичні методи: бутстреп-аналіз, дослідження залежності між ознаками за коефіцієнтом рангової кореляції Спірмана використовували для подальшого дослідження нуклеотидних послідовностей, отриманих з бази даних GenBank NCBI, побудови дендрограм та визначення залежності між поліморфізмом генів, що кодують халконсинтази (chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps), та типом сорту хмелю звичайного; мікробіологічний метод (ізоляція культури клітин на живильному середовищі) використовували для виділення чистої культури A. tumefaciens; мікроскопію (фарбування клітин за Грамом) використовували для первинної візуальної ідентифікації клітин збудника бактеріального раку рослин A. tumefaciens.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проаналізовано поліморфізм різних регіонів всіх генів, що кодують халконсинтази, chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps у сортів хмелю звичайного української селекції; здійснено анотацію генів chs2, chs3 та chs4 хмелю звичайного; розроблено підхід для оцінювання типу сорту хмелю звичайного за допомогою молекулярних маркерів; досліджено можливість визначення статі за даними поліморфізму мікросателітного локусу HlAGA7 та регіону Y-хромосоми у зразків хмелю звичайного української селекції; проведено валідацію молекулярних маркерів для виявлення збудника бактеріального раку рослин A. tumefaciens.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено молекулярно-біотехнологічні засади для виявлення типу сорту, статі зразка та наявності збудника бактеріального раку рослин у хмелю звичайного для подальшого культивування in vitro.

Апробація результатів дослідження. Результати дослідження представлено на VI Міжнародній конференції «Сучасна біотехнологія сільськогосподарських рослин та біобезпека (Геном рослин VI)» (Україна, Одеса, 2010); VII Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». (Україна, Львів, 2011); VI Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Україна, Алушта, 2011); Перший міжнародній науково-практичній конференції «Стан і перспективи формування сортових рослинних ресурсів в Україні» (Україна, Київ, 2012); Міжнародній науково-практичній конференції «Перспективи розвитку рослинницької галузі в сучасних економічних умовах» (Україна, Скадовськ, 2013); II Міжнародній науково-практичній конференції «Новітні досягнення біотехнології» (Україна, Київ, 2013); IX Міжнародній науковій конференції «Фактори експериментальної еволюції організмів» (Україна, Умань, 2014); Global genome biodiversity network international conference on biodiversity biobanking (Сполучене Королівство Великої Британії та Північної Ірландії, Лондон, 2014); Всеукраїнській науковій конференції молодих вчених «Інновації в сучасній селекції та генетиці сільськогосподарських культур» (Україна, Одеса, 2014).

Публікації. Основні результати дисертаційних досліджень висвітлено у 17 наукових працях, включаючи шість статей (з них пйять статей опубліковано у фахових виданнях), Деклараційний патент України на корисну модель, 9 тез доповідей на наукових конференціях та методичні рекомендації.

1. Огляд літератури

Представлений сучасний стан досліджень з біотехнології хмелю звичайного. Систематизовані дані щодо різноманіття та ролі халконсинтаз у синтезі гірких речовин в шишках хмелю, викладені біохімічні характеристики типів сорту хмелю звичайного, наведена інформація щодо молекулярно-генетичного різноманіття статевих хромосом хмелю та Ті-плазміди A. tumefaciens, наведені методики виявлення бактеріального раку у рослин. Представлено дані щодо молекулярно-генетичної характеристики ядерних генів, які асоційовані з синтезом гірких речовин в шишках хмелю звичайного та статтю, а також плазмідних генів, які асоційовані з проявом бактеріального раку у рослин. Аналіз сучасного стану вивчення проблеми показує, що, незважаючи на значні досягнення в генетичних та молекулярно-генетичних дослідженнях хмелю звичайного та певні успіхи в розробці біотехнологій для вирішення задач селекції та розсадництва хмелю звичайного, залишається відкритим питання залежності рівня гірких речовин від поліморфізму генів, що кодують халконсинтази, та проблеми встановлення статі хмелю на ранніх етапах онтогенезу і виявлення A. tumefaciens в уражених зразках без візуальних симптомів бактеріального раку, чому і присвячено дану дисертаційну роботу.

2. Матеріали і методи досліджень

Матеріалом для досліджень слугували сорти хмелю звичайного селекції Інституту сільського господарства Полісся НААН України жіночої статі: Альта, Зміна, Ксанта, Кумир, Надія, Назарій, Оболонський, Поліський, Промінь, Чаклун (гіркі сорти); Видибор, Гайдамацький, Житомирський 75, Заграва, Клон 18, Оскар, Пивовар, Полісянка, Славянка, Хмелеслав (ароматичні сорти), та зразки хмелю звичайного чоловічої статі: 1з 63-2-3, 1к 64-1-1, 2з 63-2-7, 2к 64-2-5, 3з 65-6-1, 4з 68-3-1, 5к 67-3-1, 6к 67-4-8; штам A. tumefaciens, виділений з корончатого галу на стовбурі зразка хмелю звичайного сорту Альта за методикою Brisset et al. (1991).

Для біоінформатичних досліджень генів, що кодують халконсинтази, використано всі наявні на той час в базі даних GenBank NCBI нуклеотидні послідовності гена chs_H1 - AJ304877, AM263199 (повні сиквенси), AM263200, AM263201, FJ554585 (мРНК); гена chs2 - AB061020 (повний сиквенс), AB061021, FJ554586 (мРНК); гена chs3 - AB061022 (повний сиквенс); гена chs4 - AJ430353 (повний сиквенс), FJ554587 (мРНК); гена vps - AB015430, AB047593, EU685789, EU685790, EU685791, EU685792, EU685793, EU685794, EU685795, EU685796, EU685797, EU685798, EU685799, EU685800, FJ554588 (повні сиквенси).

Для біоінформатичних досліджень Ті-плазміди використано послідовності Ті-плазмід октопінового типу - AF242881.1, NG_034313; агроцинопінового типу - U83987, M91189, Z29717, M91188, DQ058764.1, AE007871.2, CP007228; нопалінового типу - AB016260, M11311, з бази даних GenВank NCBI.

ДНК екстрагували з тканин листя хмелю звичайного у трьох повторюваннях за методикою Okada (2003). ДНК з агробактерій екстрагували за методикою Haas et al. (1991).

Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) проводили в 500 мкл-мікропробірках в термоциклері «Терцик» («ДНК-технология», РФ) з праймерами, послідовності яких відомі з літературних джерел. Розподіл продуктів ампліфікації проводили методом електрофорезу в 2 % агарозному гелі в TBE-буфері за постійної напруженості електричного поля 2,5 В/см та кімнатної температури протягом 2-3 год у апараті для горизонтального гель-електрофорезу («Peqlab Biotechnologie GmbH», Німеччина) або 10 % поліакриламідному гелі (ПААГ) в TBE-буфері за постійної напруженості електричного поля 5,0 В/см та температури 60 оС 3-4 год у апараті для вертикального гель-електрофорезу VE3 («Геликон», РФ). Агарозні гелі фарбували етідіум бромідом. Продукти ПЛР-ампліфікації також розподіляли методом електрофорезу в ПААГ, фарбували з використанням нітрату срібла або етидіум броміду. Отримання відеозображень електрофореграм та оцінку розмірів продуктів ампліфікації проводили за допомогою системи документації і аналізу гелів «Image Master VDS» («AmershamPharmacia Biotech», ОКВ) згідно з інструкцією користувача.

Введення зразків хмелю звичайного в культуру in vitro проводили методом культури клітин in vitro за методичними рекомендаціями (Ковальов та ін., 2009). Апекси виділяли з апікальної верхівки пагона хмелю звичайного, для чого з підземної частини вегетативного пагона вирізали живці з бруньками відновлення. Живці замочували протягом 1-2 тижнів у воді і висаджували у контейнери, заповнені торфом. Посадку проводили так, щоб субстрат повністю покривав весь живець. Пророщували живці при температурі 18-220 С, періодично поливаючи водою так, щоб не пересихав субстрат.

Після того, як пагони досягнули розміру 20-30 см у висоту, з них скальпелем зрізали верхівки розміром 2-3 см. Верхівки промивали в 0,003 % водному розчині Твін 80, потім тканини занурювали на декілька секунд у 70% розчин етилового спирту, промивали стерильною дистильованою водою і переносили (з метою стерилізації у 3 % водний розчин гіпохлориду натрію. Термін стерилізації складав 5-10 хв.

Після стерилізації з верхівкових бруньок скальпелем знімали покривні листочки і бруньку поміщали в стерильну чашку Петрі та за допомогою голок відкривали апікальну меристему. Потім зрізали апекс з примордіями, приблизно розміром 0,5 мм і за допомогою анатомічної голки висаджували його у банки на живильне середовище Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962) з додаванням 0,2 мг/л синтетичного цитокініну - тідіазурону. Банки з апексами культивували при температурі 250 С, відносній вологості повітря 70-80 %, освітленні 3 кЛк і фотоперіоді 16 год. Після двох тижнів культивування проводили пересадку апексів на свіжі середовища. Проводили 5 пасажів регенерації.

Вирівнювання нуклеотидних послідовностей здійснювали локальне за алгоритмом Сміта-Уотермана за допомогою он-лайн програми «blastn» (Ліцензія: не потрібна). Кластерний аналіз поліморфізму генів, що кодують халконсинтази, здійснювали за алгоритмом ClustalW. Пошук сайтів праймування для нуклеотидних послідовностей Ті-плазміди здійснювали за допомогою програми Vector-NTI 11 (у вільному доступі). Побудову дендрограм здійснювали за парногруповим методом кластеризації з арифметичним усередненням (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averaging, UPGMA). Залежність між показником «тип сорту» та поліморфізмом генів, що кодують халконсинтази, визначали за коефіцієнтом рангової кореляції Спірмана.

3. Результати досліджень та їх обговорення

Валідація молекулярних маркерів для детекції бактеріального раку у хмелю та добір здорових зразків для культивування in vitro. З літературних джерел відомо про використання для видової детекції A. tumefaciens ПЛР-аналізу консервативних ділянок генів ipt і virD2 Ті-плазміди. Ефективність цих маркерів показана на октопінових та нопалінових типах агробактерій. Даних щодо ідентифікації агроцинопінових типів A. tumefaciens у літературі не наведено, що робило використання вищенаведених маркерів при виявленні бактеріального раку у рослин неповноцінним.

Проведено вирівнювання послідовностей пар праймерів Cyt F і Cyt R, які фланкують консервативну послідовність гена ipt Ті-плазміди, та Vir A і Vir C, що специфічні до найбільш консервативного регіону гена virD2 Ті-плазміди, відносно нуклеотидних послідовностей всієї бази даних GenBank NCBI. Серед нуклеотидних послідовностей, ділянки яких повністю комплементарні даним парам праймерів, були Ті-плазміди октопінового, нопалінового, агроцинопінового та невстановленого типів. Послідовностей інших плазмід, органел, вірусів або організмів не виявлено. Таким чином, встановлено ефективність та селективність використання молекулярних маркерів генів ipt та virD2 для ідентифікації A. tumefaciens нопалінового, октопінового та агроцинопінового типів. Проте залишались невідомими розміри ділянок, які фланкують пари праймерів Cyt F і Cyt R та Vir A і Vir C у Ті-плазміди агроцинопінового типу. Встановлено консервативність ділянки гена ipt, що фланкується парою праймерів Cyt F і Cyt R та має розмір 427 п. н. Дані результати збігаються з літературними даними. При біоінформатичному аналізі регіону гена virD2 Ті-плазміди, що фланкується парою праймерів Vir A і Vir C, виявлено як описаний фрагмент розміром 224 п. н., так і раніше неописані фрагменти розмірами 338 та 661 п. н.

Проведено молекулярно-генетичний аналіз генів ipt та virD2 Ті-плазміди зразків тотальної ДНК, виділеної з тканин зразків сортів хмелю звичайного української селекції, а саме зразка сорту Альта з візуальними симптомами ураження бактеріальним раком (як контрольного зразка), донорних рослин сортів Клон 18 та Промінь, призначених для введення в культуру in vitro, (10 зразків кожного сорту). За результатом ПЛР-аналізу за генами ipt та virD2 всі зразки сорту Клон 18 ідентифіковано як здорові. Наявність ураження бактеріальним раком рослин встановлено для зразка сорту Альта та однієї рослини сорту Промінь за використанням обох маркерів. Ситуацій, коли при ПЛР-аналізі з використанням однієї пари праймерів A. tumefaciens детектовано, а за іншою парою не детектовано, не спостерігали. Для уникнення псевдонегативних результатів зразки тотальної ДНК, виділеної з тканин хмелю, в яких не виявлено агробактеріальну ДНК, використано для створення сумішей з ДНК A. tumefaciens у співвідношенні 1 : 1, 1 : 5 та 1 : 10 для встановлення рівня чутливості детекції на основі ПЛР-аналізу.

Оптимізовано систему детекції A. tumefaciens, що викликає бактеріальний рак рослин, зокрема хмелю звичайного, за допомогою молекулярних маркерів генів virD2 та ipt. Дана система дозволяє виявити пухлиноутворюючу Ті-плазміду октопінового, нопалінового та агроцинопінового типів. Двоетапна перевірка наявності у тотальній ДНК Ті-плазміди важлива для оцінювання ризику наявності A. tumefaciens у тканині хмелю. Так, при наявності у Ті-плазміді онкогена ipt, але при відсутності регіону virD2, який відповідає за вірулентність, агробактерії не здатні викликати бактеріальний рак рослин, тому за відсутності регіону virD2 наявність A. tumefaciens є припустимою. Використання даного підходу дозволяє уникнути псевдопозитивних результатів при діагностиці бактеріального раку у рослин хмелю звичайного.

Результати ПЛР-тестування донорних рослин хмелю щодо наявності ураження A. tumefaciens дозволили добрати зразки, вільні від A. tumefaciens, для подальшого культивування. Зразки введено в культуру in vitro на середовище Мурасиге-Скуга з додаванням 0,2 мг/л тідіазурону методом культури тканин. Проведено п'ять пасажів. Введено в культуру in vitro 197 зразків 20 сортів хмелю звичайного української селекції; отримані експлантати хмелю звичайного є вільними від A. tumefaciens. Їх рекомендовано для введення в культуру in vivo або для подальших селекційних, біотехнологічних та молекулярно-генетичних досліджень.

Поліморфізм генів, що кодують халконсинтази. В шишках хмелю відома наявність близько 500 поліфенолів, гірких та ароматичних речовин, через наявність яких шишки хмелю використовують в броварництві, медицині, харчовій та парфумерній промисловості. Ключовими ферментами біосинтезу гірких речовин є халконсинтази. Ми дослідили поліморфізм різних ділянок генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, за допомогою біоінформатичних методів на вибірці нуклеотидних послідовностей цих генів з бази даних GenBank NCBI. Виявлено інсерції, делеції та однонуклеотидні заміни в різних ділянках генів.

Здійснено анотацію генів chs2, chs3 та chs4: показано наявність у кожного двох екзонів та інтрону, визначено їх розміри та встановлено позиції сайтів праймування використаних у нашій роботі праймерів (рис. 1). Щодо генів chs_H1 та vps, для яких відома організація, визначено сайти праймування та розміри певних регіонів.

Рис. 1. Схеми організації генів хмелю звичайного: chs2 (позиції 1-1301), відповідно послідовності AB061020 (а); chs3 (позиції 1-1291), відповідно послідовності AB061022 (б); chs4 (позиції 1-2867), відповідно послідовності AJ430353 (в). У прямокутниках позначено назви праймерів та позиції сайтів праймування

Далі поліморфізм різних ділянок генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, досліджували за допомогою ПЛР на вибірці 20 сортів хмелю звичайного української селекції. Аналізували такі регіони: 3'-нетрансльований регіон (3'-НТР), інтрон та екзон 2 гена chs_H1, інтрони генів chs2, chs3, chs4, промотор, інтрон, екзон 2 та ділянка, що включає екзон 1, інтрон і екзон 2, гена vps.

Поліморфізм гена chs_H1 досліджували у 3'-нетрансльованому регіоні (3'-НТР), інтроні та екзоні 2 ( табл. 1).

Таблиця 1. Результати ПЛР-аналізу гена chs_H1 сортів хмелю звичайного

При дослідженні поліморфізму інтрону гена chs2 за допомогою ПЛР з парою праймерів CHS23F/CHS2R виявлено три продукти ампліфікації розмірами 230, 237, 240 п. н.

За результатами ПЛР-аналізу з парою праймерів CHS23F/CHS3R інтрону гена chs3 у сортів хмелю звичайного української селекції виявлений один продукт ампліфікації розміром 232 п. н. При дослідженні поліморфізму інтрону гена chs4 за допомогою ПЛР з парою праймерів CHS4F/CHS4R у сортів хмелю звичайного української селекції виявлений один продукт ампліфікації розміром 223 п. н.

За допомогою ПЛР-аналізу досліджено поліморфізм гена vps у промоторі, інтроні, екзоні 2 та ділянці, що включає екзон 1, інтрон і екзон 2 (табл. 2).

Таблиця 2. Результати ПЛР-аналізу гена vps сортів хмелю звичайного

При порівнянні поліморфізму досліджених генів у сортів української селекції з вибірками сортів світової колекції встановлено, що для сортів хмелю звичайного української селекції характерні інші кількість та розмір фрагментів ампліфікації, ніж описані для сортів світової колекції (табл. 3). За рівнем та типами поліморфізму сорти української селекції відрізнялися від сортів з інших еколого-географічних груп (північноамериканської та європейської зародкових плазм), що пов'язано, можливо, з використанням при селекції даних сортів специфічних зразків, зокрема чоловічих форм складного селекційного походження та місцевих дикорослих зразків.

Таблиця 3. Порівняння поліморфізму генів, що кодують халконсинтази, сортів хмелю звичайного української селекції та світової колекції

Примітка: 1 ? наші дослідження; 2 ? Patzak et al. (2007); 3 ? Matousek et al. (2002); 4 ? Bassil et al. (2008); 5 - Castro et al. (2008); « - » ? дослідження не проводили.

Зв'язок між поліморфізмом генів, що кодують халконсинтази, та типом сорту хмелю звичайного. За кількістю гірких речовин, а саме когумулону в складі б-кислот, колупулону в складі в-кислот, та співвідношенням кількості в-кислот до б-кислот сорти хмелю поділяють на гіркі та ароматичні. Ми здійснили кластерний аналіз даних молекулярно-генетичних досліджень поліморфізму різних регіонів генів, що кодують халконсинтази, які наведено вище. На дендрограмі (рис. 3) сорти згрупувалися в два кластери за своїм типом: до кластеру I увійшли всі гіркі сорти, до кластеру II - всі ароматичні.

Рис. 2. Генетичне різноманіття сортів хмелю звичайного української селекції, основане на поліморфізмі генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps. I, II - кластери

Достовірність зв'язку між поліморфізмом генів, що кодують халконсинтази, та типом сорту хмелю звичайного обраховували за коефіцієнтом рангової кореляції Спірмана, який становив р = 0,881. Критична точка Тkp = 0,190. |p| > Tkp - нульова гіпотеза не підтверджується, ранговий кореляційний зв'язок між ознаками значущий. Критична точка двосторонньої критичної області t(б, к) =1,734. Довірчий інтервал r = (0.79; 0.97). Отже, зв'язок між показником «тип сорту» та поліморфізмом генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps хмелю звичайного є прямим, значущим та в межах довірчого інтервалу.

Таким чином, встановлено зв'язок між поліморфізмом генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, та показником «тип сорту». Показано можливість використання молекулярних маркерів, за допомогою яких виявлено поліморфізм вищенаведених генів, для ідентифікації ароматичного або гіркого типу сорту.

Доповнення генетичних ідентифікаційних формул сортів хмелю звичайного. Для ДНК-типування сортів хмелю звичайного та їх реєстрації у вигляді генетичних ідентифікаційних формул розроблено панель 13 мікросателітних маркерів (Сиволап та ін., 2010). В ідентифікаційній формулі сорту буква означає досліджений локус, нижній індекс - розміри фрагментів ампліфікації даного локусу в п. н. (у випадку гомозиготного стану вказують один фрагмент). Літери англійського алфавіту А, В, С, D, E, F, G, H, I, J, K, L, М означають локуси 11а59, 7а82, 3a88, 5-2, HlGA29, HlGA4, HlGA9, HlGT4, HlGT5, HlGT9, HlGA3, HlGT1, HlGT2, відповідно. За результатами наших досліджень формули доповнено даними аналізу генів, що кодують халконсинтази, яким надано такі коди: N - 3'-нетрансльований регіон, O - інтрон (позиції 592-884), P - інтрон (позиції 634-834), Q - екзон 2 гена chs_H1; R - інтрон гена chs2; S - інтрон гена chs3; T - інтрон гена chs4; U - промотор, V - інтрон, W - екзон 2, X - ділянка, що включає екзон 1, інтрон і екзон 2, гена vps. Наприклад, ідентифікаційна формула сорту Альта така:

A194B198C194D186E186F228,230G201H195I204J200K150L262M212,220N247,267O248,264P218Q580R230,240S232T223U188V211W402X917,1303.

Молекулярно-генетичний аналіз регіонів статевих хромосом хмелю звичайного. Ефективність відомих з літератури молекулярних маркерів має бути перевірена на іншій вибірці зразків для виключення псевдорезультатів, тобто необхідно здійснити валідацію маркерів. Jakse et al. (2008) встановлено, що для чоловічих зразків характерна наявність «чоловічоспецифічних» фрагментів 165 або 210 п. н. мікросателітного локусу HlAGA7 (для європейської або азіатської та американської зародкової плазми, відповідно), тоді як у зразків жіночої статі ампліфікуються інші «нечоловічоспецифічні» фрагменти. Нами здійснено ПЛР-аналіз сортів хмелю української селекції за мікросателітним локусом HlAGA7 (рис. 3, табл. 4). Фрагментів розмірами 165 або 210 п. н., які описані як чоловічоспецифічні, не виявлено.

Рис. 3. Електрофоретичні профілі продуктів ампліфікації локусу HlAGA7 у зразків хмелю звичайного (а) чоловічої статі колекційних номерів 3з 65-6-1 (1), 2к 64-2-5 (2), 1к 64-1-1 (3), 2з 63-2-7 (4), 1з 63-2-3 (5), 5к 67-3-1 (6), 6к 67-4-8 (7), 4з 68-3-1 (8) та (б) жіночої статі сортів Надія (1), Оскар (2), Клон 18 (3), Оболонський (4), Хмелеслав (5), Кумир (6), Ксанта (7), Житомирський 75 (8). М - маркер молекулярної маси pUC19 DNA/MspI. К - негативний контроль (ПЛР-суміш без ДНК)

Таблиця 4. Поліморфізм сортів та чоловічих зразків хмелю звичайного української селекції за мікросателітним локусом HlAGA7

Отже, розглядати певні фрагменти ампліфікації мікросателітного локусу HlAGA7 як маркери статі неможливо, що спонукало до пошуку іншого статеспецифічного маркера та його валідації. За літературними даними для визначення статі можливо використовувати маркер, розроблений для детекції регіону Y-хромосоми; результатом ПЛР-аналізу буде наявність / відсутність фрагмента ампліфікації при тестуванні чоловічого / жіночого зразків, відповідно. На основі чоловічоспецифічного RAPD-фрагменту OPJ9 розроблено STS-маркер, специфічний до Y-хромосоми (Patzak et al., 2002). При ПЛР-аналізі за даним маркером в зразках чоловічої статі відбувається ампліфікація фрагмента розміром 1150 п. н., тоді як в зразках жіночої статі продукти ампліфікації відсутні. Даний маркер обрано нами для оцінки можливості його використання як статеспецифічного у вибірці зразків хмелю звичайного української селекції. При ПЛР-аналізі 28 зразків хмелю звичайного за STS-маркером продукт ампліфікації розміром 1150 п. н. отримано для всіх зразків чоловічої статі і не отримано для сортів.

Таким чином, за результатами дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму сортів та чоловічих зразків хмелю звичайного за мікросателітним локусом HlAGA7 використовувати його алелі як маркери статі неможливо через відсутність зв'язку наявності певного алеля (алелів) тільки у зразків певної статі. STS-маркер регіону Y-хромосоми є специфічним для диференціації зразків хмелю звичайного за статтю.

Отже, результати біоінформатичних та молекулярно-генетичних досліджень дозволили розробити біотехнологічні засади оцінки зразка хмелю звичайного за типом сорту, статтю та наявністю ураження A. tumefaciens, що складаються з таких стадій.

1) Добір рослинного матеріалу. Матеріалом досліджень можуть слугувати будь-які тканини, частини, органи хмелю звичайного масою не менш 5 г. Зразок тричі промити деіонізованою водою та підсушити. Для ДНК-типування підготувати 50-100 мг наважку. Решту зберігати при -20 оС.

2) Виділення ДНК. Зразок тканини гомогенізувати. Виділення та очищення тотальної ДНК проводити за методикою Okada et al. (2004). Визначити кількість виділеної ДНК флуориметричним методом або гель-електрофорезом.

3) Постановка полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Провести ПЛР з праймерами до ділянок генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, STS-праймерами до ділянки Y-хромосоми та праймерами до ipt та virD2 генів Ті-плазміди.

4) Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Провести електрофоретичний розподіл продуктів ПЛР, негативних контролів та маркеру молекулярної маси у 10 % поліакриламідному (ПАА) (у випадку ПЛР з праймерами до генів, що кодують халконсинтази) або 2 % агарозному (у випадку ПЛР з праймерами до ipt і virD2 генів Ті-плазміди та STS-праймерами до ділянки Y-хромосоми) гелях. Провести візуалізацію продуктів ампліфікації фарбуванням бромистим етидієм.

5) Визначення розмірів продуктів ампліфікації. Розміри продуктів ампліфікації у парах нуклеотидів (п. н.) визначити за допомогою програми аналізу гелів. Очікувані розміри фрагментів ампліфікації генів, що кодують халконсинтази, такі: chs_H1, інтрон (позиції 592-884) - 234-272 п. н., chs_H1, інтрон (позиції 634-834) - 218 п. н., chs_H1, екзон 2 - 580-600 п. н., chs_H1, 3'НТР - 247-267 п. н., chs2, інтрон - 230-240 п. н., chs3, інтрон - 217 п. н., chs4, інтрон - 207 п.н., vps, інтрон - 211 п. н., vps, промотор - 165-191 п. н., vps, ділянка «екзон 1, інтрон, екзон 2» - 917, 1313 п. н., vps, екзон 2 - 582 п. н. При ПЛР з STS-праймерами до ділянки Y-хромосоми розмір продукту ампліфікації складає 1150 п. н. або продукти ампліфікації відсутні. Після ПЛР-аналізу з праймерами до ipt та virD2 генів Ті-плазміди розміри продуктів ампліфікації становлять 427 п. н. та 224, 338, 661 п. н., відповідно.

6) Кластерний аналіз. Провести за допомогою програми TREES 8.0 кластерний аналіз даних щодо поліморфізму генів chs_H1, chs2, chs3, chs4 та vps разом з даними, отриманими нами для 20 сортів української селекції, за алгоритмом Clustal W та побудувати дендрограми за парногруповим методом кластеризації з арифметичним усередненням (UPGMA).

7) Опрацювання результатів. При визначенні типу сорту: після кластерного аналізу зразок буде розташований в одному з двох кластерів: в кластері з ароматичними або гіркими сортами. При визначенні статі: зразок вважається чоловічої статі, якщо після ПЛР з праймерами до ділянки Y-хромосоми є продукти ампліфікації розміром 1150 п. н. При відсутності продуктів ампліфікації з даними праймерами зразок вважається жіночої статі. При детекції патогенних агробактерій зразок вважається хворим на бактеріальний рак рослин за наявності продуктів ампліфікації з праймерами до ipt і virD2 генів Ті-плазміди розмірами 427 п. н. та 224, 338, 661 п. н., відповідно. При відсутності продуктів ампліфікації з однією або двома парами праймерів зразок вважається здоровим.

Примітки. В залежності від задач дослідника можливо проводити як комплексну оцінку зразка, так і визначення окремих показників. У випадку визначення тільки статі аналізувати спочатку мікросателітний локус HlAGA7 для встановлення реакційної здатності виділеної ДНК, а потім - ділянку Y-хромосоми з STS-маркером. Після визначення даних характеристик зразки хмелю звичайного є придатними для введення в культуру in vitro.

Висновки

Теоретично та експериментально проаналізовано молекулярно-генетичний поліморфізм регіонів ядерного геному хмелю звичайного, пов'язаних з синтезом цінних вторинних метаболітів та проявом статі, досліджено ділянки Ті-плазміди збудника бактеріального раку A. tumefaciens, протестовано та добрано зразки, вільні від A. tumefaciens, проведено їхнє клональне мікророзмноження та розроблено молекулярно-біотехнологічні засади комплексної оцінки зразка хмелю за типом сорту, статтю та наявністю ураження бактеріальним раком.

1. За результатами біоінформатичних та молекулярно-генетичних досліджень Ті-плазміди A. tumefaciens визначено, що за наявності регіону virD2, який відповідає за вірулентність, але за відсутності гена патогенності ipt, A. tumefaciens не здатний викликати бактеріальний рак, тому за відсутності в Ті-плазміді гена ipt наявність A. tumefaciens є припустимою.

2. Шляхом добору за молекулярними маркерами Ті-плазміди та введення в культуру in vitro методом апікальних меристем отримано 197 зразків хмелю звичайного, вільних від A. tumefaciens. Дані зразки рекомендовано для подальших біотехнологічних, молекулярно-генетичних та селекційних досліджень.

3. За даними біоінформатичних досліджень генів chs_H1, chs2, chs3, chs4 та vps, що кодують халконсинтази, встановлено поліморфізм різних регіонів (екзонів, інтронів, 3'-нетрансльованих регіонів), а саме інсерції, делеції, однонуклеотидні заміни. Здійснено анотацію генів chs2, chs3 та chs4: показано наявність у кожного двох екзонів та інтрону, визначено їх розміри.

4. На основі результатів молекулярно-генетичних досліджень генів chs_H1, chs2, chs3, chs4 та vps, що кодують халконсинтази, визначено поліморфізм різних регіонів. За рівнем та типами поліморфізму сорти української селекції значно відрізнялися від сортів з інших еколого-географічних груп (північноамериканської та європейської зародкових плазм), що пов'язано, можливо, з використанням при селекції даних сортів специфічних зразків, зокрема чоловічих форм складного селекційного походження та місцевих дикорослих зразків.

5. Встановлено статистично достовірний зв'язок між сумарним поліморфізмом різних регіонів генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, та показником «тип сорту» (ароматичний або гіркий), тобто вмістом і співвідношенням когумулону та колупулону.

6. Для визначення статі хмелю на ранніх стадіях онтогенезу необхідною є двоетапова процедура: аналіз мікросателітного локусу HlAGA7 для виключення псевдонегативного результату та тестування STS-локусу Y-хромосоми для виявлення чоловічої статі.

7. Генетичні ідентифікаційні формули сортів хмелю звичайного української селекції, в яких відображено алельний склад мікросателітних локусів, доповнено даними щодо генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ.

Розроблено молекулярно-біотехнологічні засади комплексної оцінки зразка хмелю звичайного щодо типу сорту (гіркий / ароматичний), статі та ураження A. tumefaciens.

Рекомендуємо:

1. Використання даних щодо поліморфізму різних ділянок генів chs_H1, chs2, chs3, chs4, vps, що кодують халконсинтази, для визначення типу сорту хмелю звичайного.

2. Використання молекулярного маркеру STS для визначення статі хмелю звичайного.

3. Одночасне використання молекулярних маркерів генів ipt та virD2 для визначення наявності бактеріального раку у хмелю звичайного

Література

1) Венгер А.М. Визначення статі хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) за молекулярними маркерами / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Збірник наукових праць СГІ-НЦНС. - 2013. - Вип. 26 (61). - С. 161-166. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

2) Venger A. Molecular-genetic polymorphism of vps gene in Ukrainian hop varieties / A. Venger, N. Volkova // Modern science. - 2014. - Vol. 1. - P. 28-34. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

3) Венгер А.М. Молекулярно-генетичний поліморфізм генів chs2, chs3 та chs4 у сортів хмеля звичайного української селекції / А.М. Венгер, Н.Е. Волкова // Вісник Запорізького національного університету - 2014. - № 1 (29). - С. 13-21. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

4) Венгер А.М. Молекулярна біотехнологія діагностики бактеріального раку хмелю звичайного / А.М. Венгер, Н.Е. Волкова // Мікробіологія і біотехнологія. - 2015. - № 1. - С. 60-66. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

5) Венгер А.М. Поліморфізм генів, що кодують халконсинтази, та його зв'язок з рівнем гірких речовин шишок хмелю звичайного / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Наукові доповіді НУБіП України. - 2015. - № 2. (51) - С. 1-9. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавтором проведено планування, експериментальні дослідження, аналіз і підготовка статті до друку).

6) Кожухова Н. Е. Сучасні молекулярно-генетичні дослідження хмелю (огляд) / Н. Е. Кожухова, А. М. Венгер, Ю. М. Сиволап, Б. Ф. Кормільцев // Збірник «Агропромислове виробництво Полісся». - 2011. - Вип. 4. - С. 62-67. (Здобувачем проведено пошук літератури, спільно з співавторами проведено підготовка статті до друку).

7) Венгер А. М. Ген валерофенонсинтази хмелю. Біоінформатичний аналіз / А. М. Венгер, Н. Е. Кожухова, Г. І. Сліщук // Збірник наукових праць «Фактори експериментальної еволюції організмів». - 2011. - Т. 10. - С.187-190.

8) Спосіб детекції збудника бактеріального раку Agrobacterium tumefaciens у хмеля звичайного / Н. Е. Кожухова, А. М. Венгер, Ю. М. Сиволап // Патент на корисну модель. - 2011. - Бюл. № 24. - 6 с.

9) Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетична оцінка сортів хмелю звичайного (Humulus lupulus L.) / Ю. М. Сиволап, Н. Е. Волкова, О. О. Захарова, Г. Ю. Шевчук, А. М. Венгер // Методичні рекомендації. - Одеса: КП ОМД. - 2012. - 18 с.

10) Венгер А. М. Молекулярні маркери для детекції бактеріального раку хмеля звичайного (Humulus lupulus L.) /А. М. Венгер, Н. Е. Кожухова, Ю. М. Сиволап // Тези VI Міжнародної конференції «Сучасна біотехнологія сільськогосподарських рослин та біобезпека» (Геном рослин VI). - Одеса, 07-10.09.2010 р. - С. 15.

11) Венгер А. Вивчення дії тідіазурону на ріст in vitro хмелю звичайного / А. Венгер, Н. Кожухова // Збірник тез VII Міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології». - Львів, 05-08.04.2011 р. - С. 346.

12) Венгер А. М. Молекулярні маркери у селекції хмелю звичайного / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Матеріали І Міжнародної науково-практичної конференції «Стан і перспективи формування сортових рослинних ресурсів в Україні». Київ, 11-13.07.2012 р. - С. 50-51.

13) Венгер А. М. Молекулярно-генетичні маркери у визначенні статі хмеля звичайного / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова, Б. Ф. Кормільцев // Тези Міжнародної науково-практичної конференції «Перспективи розвитку рослинницької галузі в сучасних економічних умовах». - Скадовськ, 06-08.08.2013 р. -С. 5-6.

14) Венгер А. М. Молекулярні маркери в реєстрації сортів хмелю звичайного / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Тези II Міжнародної науково-практичної конференції «Новітні досягнення біотехнології». - Київ, 24-25.10.2013 р.

15) Венгер А. М. Ідентифікація типу сорту хмеля звичайного за молекулярними маркерами генів, що кодують халконсинтази / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Збірник наукових праць «Фактори експериментальної еволюції організмів». - 2014. - Т. 15. - С. 24-27.

16) Venger A. Genetic diversity of Ukrainian hop varieties and molecular markers in detection of aroma and bitter substances levels / A. Venger // Oral and poster presentation abstract volume of Global Genome Biodiversity Network, International Conference on biodiversity biobanking, London, Great Britain, 30.06.-02.07.2014. - P. 40-41.

17) Венгер А. М. Оцінка генотипу хмелю звичайного за генами, що кодують халконсинтази, статтю та ураженістю бактеріальним раком / А. М. Венгер, Н. Е. Волкова // Тези доповідей Всеукраїнської наукової конференції молодих вчених «Інновації в сучасній селекції та генетиці сільськогосподарських культур». - 2014. - С. 72.

Размещено на Allbest.ru