Вплив макрогетероциклічних краун-сполук на систему ТТГ-Т3, Т4 організму щурів

Харківський національний педагогічний університет

Кратенко Р. І.

Кратенко Р. И.

Kratenko R. I.

Вступ

Останніми роками, ксенобіохімія з'ясування біологічного механізму дії чужорідних організму сполук ксенобіотиків, набуває неабиякого розвитку, завдяки новим багаточисленим речовинам, що виробляються підприємствами органічного синтезу. Це, повною мірою, притаманне новій групі макрогетероциклічних краун-сполук, які представляють собою молекулярні системи з 9-60 атомами у циклі, третина з яких складає атоми етерного оксигену, нітрогену або сульфуру [14]. Найбільш важливою властивістю макроциклічних поліетерів є їх здатність утворювати стійкі комплекси з солями лужних, лужноземельних та інших металів, включаючи у свою порожнину катіон [10]. Здатність краунетерів «коронувати» катіон, а також їхня короноподібна молекулярна структура прийняті C.J. Pedersen за основу при назві цього класу сполук («crown» корона) [14]. Унікальні властивості краун-етерів утворювати комплекси з катіонами металів, що мають високу електропровідність, розчинюватися в багатьох неводних розчинниках (ліпофільність), включати в макроцикл хіральні атоми обумовлюють широке використання цих сполук при рішенні прикладних задач в електрота супрамолекулярній хімії, фармацевтичному аналізі, каталізі, органічному синтезі, металургії [10,14]. Однак ці властивості, корисні у промисловості, можуть стати причиною високої біологічної активності та токсичної деструктивної дії краун-етерів при надходженні їх з водою до організму людини та теплокровних тварин. Існують наукові роботи, в яких ілюструються протисудомна [4], крадіо[8] та психотропна [13] дія речовин даного класу, їх вплив на деякі ферменти [6] й іонну проникність мембран [2].

Оскільки у науковій літературі відсутні дані про вплив макрогетероциклічних краун-етерів на різні гормональні системи організму та ферменти, які контролюються цими системами, то метою нашого дослідження було вивчення впливу краун-етерів на функціональний стан однієї з ланок ендокринної системи тиреотропін-тиреоїдні гормони (ТТГ Т3, Т4) у зв'язку з основними метаболічними ферментами, що знаходяться під контролем цих гормонів. Ця підсистема, за даними літератури, є однією з найбільш чутливих до хронічної дії малих доз токсичних речовин [9]. Робота виконана в рамках комплексного дослідження по встановленню механізму біологічної дії макрогетероциклічних краун-сполук.

Об'єкт і методи дослідження. Застосовуючи модель хронічного експерименту (6 місяців) на 50 (10 на експериментальну групу) щурах-самцях лінії Вістар трьохмісячного віку, було вивчено вплив 1/1000 LD50 18-краун-6 (0,00127 г/кг), 21-краун-7 (0,0032 г/кг), циклогексил-18-краун-6 (0,00265 г/кг) та дикето-18-краун-6 (0,00185 г/кг) на концентрації тиреотропного гормону (ТТГ), трийодтиронину (Т3), тироксину (Т4) сироватки крові. Тваринам перорально, щоденно, натщесерце за допомогою зонду вводили водні емульсії досліджуваних речовин. Щурам контрольної групи вводили відповідні об'єми води. По закінченню хронічного експерименту щурів обох груп забивали декапітацією гільйотинним ножем, попередньо анестезуючи тіопенталом натрію (50 мг/кг внутрішньопорожнинно) [7].

Концентрації гормонів визначали радіоімунологічними методами, використовуючи набори реактивів Ria-mtd TSH фірми Mallinekard Diagnostika (Germany) і UPRLK-PR компанії Oris industrie S.A. International-cis (Франція).

Відомо, що синтез та секреція тироліберину в гіпоталамусі відбувається під контролем нейротрансміттера норадреналіна [12], що має досить велику спорідненість до альфа2-адреналових рецепторів (а2-АР) в цієї структурі головного мозку [11]. У зв'язку з цим, вивчена дія краун-етерів на вміст норадреналіну в гіпоталамусі спектрофлюориметричним методом [5] та параметри зв'язування 3Н-раувольсину (а2-АР селективного ліганду) з синаптосомальною фракцією, що була виділена з цієї ділянки головного мозку [16], радіолігандним методом [17]. Окрім цього, вивчені активність гуанілатциклази та вмісту цГМФ в гіпоталамусі [15], як речовин, які опосередкують внутрішньоклітинну дію норадреналіну а2-АР [11].

Відомо, що калоригенний ефект тиреоїдних гормонів виявляється, з одного боку, підвищеним синтезом АТФ в процесі окислювального фосфорилювання, а з іншого посиленою затратою цієї «енергетичної валюти» на посилення трансмембранного переносу іонів за допомогою різних АТФаз [12]. У зв'язку з цим, досліджували активність цитохромоксидази головного мозку та K+-Na+-, Ca2+, Mg2+-АТФаз мітохондрій печінки щурів за умов дії макроциклічних етерів [1,3]. Вміст білку в пробах визначався за Лоурі [18]

Таблиця 1.

Вплив краун-етерів (1/1000 LD50) на вміст норадреналіну, цГМФ, активність гуанілатциклази та параметри зв'язування 3Н-раувольсину в гіпоталамусі щурів

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю.

Експериментальні дослідження було проведено з дотримання вимог гуманного ставлення до піддослідних тварин, регламентованих Законом України «Про захист тварин від жорстокого поводження» (№ 3447-IV від 21.02.2006 р.) та Європейською конвенцію про захист хребетних тварин, які використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 18.03.1986 р.).

Таблиця 2.

Вплив краун-етерів (1/1000 LD50) на концентрацію ТТГ, Т3 і Т4 в сироватці крові щурів

Таблиця 3.

Активність цитохром оксидази головного мозку та АТФазна активність гепатоцитів щурів під впливом 1/1000 LD50 краун-етерів

Примітки: a - мкмоль Фн/год-мг білка * - р<0,05 відносно контролю.

Статистичний аналіз даних проводили з використанням комп'ютерного пакета прикладних програм для обробки статистично інформації Statistica 6.1 (StatSoft, Іпс., США). Первинне статистичне опрацювання даних починали з перевірки припущення про відповідність вибірок закону гаусівського розподілу. Кількісні ознаки, що мали нормальний розподіл, описували параметричними характеристиками середнім значенням показника (М) та середнім квадратичним відхиленням (s); у разі відсутності нормального розподілу непараметричними медіаною (Ме) та інтерквартильним розмахом.

Для порівняння двох нормальних розподілів застосовували t-критерій Стьюдента. Якщо принаймні один з розподілів не був нормальним, то для порівняння незалежних вибірок застосовували критерій Манна-Утні. За критичний рівень значущості при перевірці статистичних гіпотез приймали р<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. По закінченню хронічного експерименту було виявлено достовірне підвищення вмісту норадреналіну, цГМФ та підсилення активності гуанілатциклази, індукованої норадреналіном в гіпоталамусі щурів усіх експериментальних груп (табл. 1). Під впливом 18-краун-6 та дикето-18-краун-6 підвищувалась максимальна кількість активних форм а2-АР синаптосом в гіпоталамусі, у той час як дія циклогексил18-краун-6 та 21-краун-7 була не стільки виражена, і цей показник мав лиш тенденцію до підвищення. Базальний рівень активності гуанілатциклази та спорідненість а2-АР до селективного ліганду не змінювались.

Під впливом досліджуваних сполук збільшувались концентрації ТТГ та Т3 в сироватці крові (р<0,05), в той час як вміст Т4 достовірно знижувався (табл. 2).

Активність цитохромоксидази головного мозку та K+-Na+-, Ca2+, Мд2+-АТФаз печінки щурів достовірно підсилювались у тварин дослідних груп, порівняно з їх активністю в контрольній групі (табл. 3).

За умов дії краун-етерів також достовірно підсилювалась активність Ca2+-АТФази головного мозку: 122,5±10,8; 114,3±7,7; 112,8±8,5; 119,7±9,5 для 18краун-6, 21-краун-7, дициклогексил-18-краун-6, дике то-18-краун-6 відповідно, відносно контролю 80,7±4,3.

Винайдені наступні лінійні залежності:

- високі позитивні кореляції між вмістом норадреналіну, індукованою активністю аденілатциклази та вмістом цГМФ у щурів контрольної ^2=0,88)та дослідних груп (R2=0,91; 0,93; 0,90; 0,94);

- висока позитивна кореляція між концентраціями ТТГ та Т3 у сироватці крові щурів дослідних груп (R2=0,92; 0,87; 0,86; 0,94);

- висока негативна кореляція між вмістом Т3 та Т4 у сироватці крові щурів експериментальних груп (R2= 0,91; 0,96; 0,91; 0,94);

- високі позитивні кореляції між концентрацією Т3 в сироватці крові та активністю ат фаз у щурів дослідних груп (R2=0,91; 0,90; 0,92; 0,89).

Підвищення концентрації норадреналіну в гіпоталамусі щурів експериментальних груп може бути наслідком посилення синтезу цього нейромедіатору в ядрах шву та/або активації процесів його транспорту й депонування. Однак, беручи до уваги високу здатність краун-етерів формувати комплекси з лужними та лужно-земельними металами [10] та враховуючи той факт, що вивільнення норадреналіна з везикул є Са2+-залежним процесом [11], можна припустити наступне. Краун-етери, які є ліпофільними та надзвичайно кумулятивними речовинами, що слабо підлягають біотрансформації, легко проходять крізь мембрани нейронів і накопичуються в пресинаптичних ділянках. Вони зв'язують Са2+, знижуючи концентрацію вільних іонів біля пресинаптичних мембран, тим самим підсилюючи приток нових іонів ззовні та перетворюючи цей процес у більш пролонгований. Це призводить до посилення вивільнення нейромедіатору, активуються кальмодулін-залежні процеси, які інгібують цАМФ-залежні реакції, в тому числі зворотне захоплення норадреналіну [12]. Це, непрямим чином, потенціює транспорт норадреналіну до норадренергічних нервових терміналей гіпоталамусу (підвищене вивільнення стимулює транспорт [11]).

Підтвердженням підвищення вмісту норадреналіну в гіпоталамусі в результаті накопичення комплексів краун-етерів і Са2+ та активації нейромедіаторного вивільнення й транспорту може служити більш сильний вплив 21-краун-7 на цей процес. За даними літератури, даний краун-етер має більший діаметр молекулярної порожнини, ніж 18-краун-6, і біль активно зв'язує йони лужно-земельних металів [14].

Підсилення активності гуанілатциклази, індукованої норадреналіном, та підвищення вмісту цГМФ в гіпоталамусі щурів дослідних груп може розцінюватися, як наслідок збільшення вмісту норадреналіна в цій структурі головного мозку (висока позитивна лінійна кореляція між цими показниками). В свою чергу, підвищення вмісту цГМФ є однією з істотних причин, внаслідок чого підсилюються синтез та секреція тиреоліберину, який потенцює синтез ТТГ аденогіпофізу та його вихід до кров'яного русла [12]. В результаті активації цього ланцюга реакцій відбувається підвищення концентрації ТТГ в крові, що і було зареєстровано у тварин дослідних груп.

В наших експериментах краун-етери не впливали на спорідненість а2-АР до селективного радіоліганду (величини параметру Kd достовірно не змінювались), що може вказувати на нездатність краун-етерів алостерично взаємодіяти, з рецепторами цього типу. Збільшення кількості активних форм а2-АР (Bmax) під впливом 18-краун-6 та дикето-18краун-6, можливо є наслідком зміни структури фосфоліпідного мікрооточення. На користь цього припущення може вказувати нездатність 21-краун-7 та дициклогексил-18-краун-6 достовірно змінювати цей показник, ймовірно, із-за великих розмірів молекули та бічного радикалу та, як наслідок, більш слабкої розчинності в фосфоліпідах мембран.

Підвищення концентрації Т3 та зниження концентрації Т4 в крові під впливом краун-етерів вказує на індукцію синтезу більш активного гормону. Трийодтиронин має більш сильну дію (в 5 разів), ніж його метаболіт тироксин [12]. Висока позитивна кореляція між концентраціями ТТГ та Т3 в сироватці крові щурів експериментальних груп може підтверджувати припущення про те, що підвищенні концентрації ТТГ потенціюють синтез Т3 та знижують його перетворення до Т4.

Підвищення вмісту більш активного тиреоїдного гормону в крові не може не впливати на енергетичний метаболізм тканин організму формуванні та затраті АТФ. Маючи більш високу здатність до проникнення у клітини та зв'язування з цитоплазматичними рецепторами [12], трийодтиронин істотно активує клітинне дихання та окислювальне фосфорилювання (які реєструються, як підвищення активності цитохром оксидази в наших експериментах), з одного боку, та потенціює споживання енергії АТФ завдяки посиленню іонного транспорту крізь мембрани з іншого (до 45 % енергетичних затрат клітини приходиться на активний іонний транспорт під дією АТФаз). Підтвердженням останнього положення є збільшення активності АТФаз під впливом краун-сполук.

Привертає увагу той факт, що, потенціюючи активність Са2+-АТФази у головному мозку через посилення синтезу Т3 та зв'язуючи іони Са2+, краунетери вносять дисбаланс до внутрішньоклітинних концентрацій іонів цього металу. Мітохондріальна Са2+-АТФаза «перекачує» іони Са2+ проти градієнту концентрації, тобто з цитоплазми до мітохондрій, в той час як краун-етери, завдяки своїм комплексоутворюючим властивостям зв'язують деяку кількість іонів і утримують їх в цитозолі. В результаті концентрація вільного Са2+ в цитоплазмі клітин зменшується до мінімуму, що активує приток цих іонів ззовні. В головному мозку вивільнення багатьох нейромедиаторів та активація кальмодулін-пов'язаних ферментів є Са2+-залежними процесами, тому можна припустити порушення їх балансу під впливом краун-етерів.

Таким чином, за умов дії краун-етерів, що утворюють комплекси з Са2+ та впливають на концентрацію цих іонів в нейронах головного мозку, у решті решт відбувається активація норадренергічних механізмів в структурах норадреналінової медіації, через підсилення вивільнення норадреналіну. Медіатор активує цГМФ-залежні процеси, що, зокрема в гіпоталамусі, призводить до підвищення синтезу тиреоглобуліна, який підсилює вивільнення ТТГ через останній синтез та секрецію Т3. Триіодтиронин потенціює, зокрема, транспорт Ca2+ з цитоплазми нейронів гіпоталамусу в мітохондрії, активуючи Ca2+АТФазу. Концентрація вільного Ca2+ зменшується, що збільшує приток іонів з міжклітинної речовини та гліальних клітин, і в певній мірі підсилює розпад комплексів «краун-етери-Са2+». Це призводить до підвищення концентрації Ca2+ в пресинаптичних пресинаптичних регіонах та індукції вивільнення адреналіну. Таким чином, виникає замкнуте коло. В даному процесі краун-етери відіграють роль акцепторів Са2+ при високій концентрації цих іонів та донорів при низькій.

Висновки

Краун-етери підсилюють синтез та секрецію тиреотропного гормону гіпофізу через активацію норадренергічних механізмів в гіпоталамусі шляхом формування комплексів з іонами Ca2+.

Краун-етери призводять до підвищення концентрації триіодтиронину в сироватці крові щурів.

Краун-етери підсилюють калоригенний ефект організму шляхом активації окислювально-відновних ферментів та іонних насосів клітин.

Перспективи подальших досліджень. В подальшому було б цікаво дослідити вплив краун-сполук на стан системи клітинного та гуморального імунітету.

Література