Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, определены цель и задачи работы, сформулированы основные положения, выносимые на защиту, и дано краткое описание диссертации по главам.

Первая глава представляет собой общий литературный обзор, в котором рассмотрены клетки крови, методы измерения и моделирования светорассеяния и существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния. В первом разделе дана классификация клеток крови (эритроциты, лимфоциты, гранулоциты и тромбоциты), описаны их основные функции и морфология. В частности, для видимого излучения размерный параметр клеток крови, определяемый как отношение длины окружности шара того же объёма к длине волны, лежит в диапазоне 30 x 150, а средний показатель преломления относительно жидкой внешней среды m 1.05. При этом эритроциты практически однородны, но имеют форму двояковогнутого диска, а гранулоциты, напротив, практически сферические, но имеют сложную внутреннюю структуру.

В разделе 1.2 описаны экспериментальные методы измерения светорассеяния одиночных микрочастиц, каковыми являются клетки крови. Самым распространённым методом для этого является проточная цитометрия, в которой система гидродинамической фокусировки доставляет частицы в зону измерения по одиночке со скоростью до 30 000 частиц/с. При этом для каждой частицы измеряется интенсивность светорассеяния в фиксированные телесные углы, например рассеяние вперёд и вбок и флуоресценция в нескольких спектральных интервалах, возможно с использованием нескольких возбуждающих лазеров. Существуют методы измерения разрешённого по углу светорассеяния, т.е. одно - и двумерных индикатрис рассеяния, с помощью либо оптического или электростатического пинцета, либо проточной системы с гидродинамической фокусировкой. Установки, в которых частица зафиксирована и используется сканирующий детектор или множество детекторов для измерения индикатрисы, требуют относительно большого времени измерения.

Примером проточной системы измерения индикатрисы является сканирующий проточный цитометр (СПЦ). В настоящее время, СПЦ может измерять индикатрисы одиночных частиц со скоростью до 500 частиц в секунду в диапазоне углов от 5 до 100. Более того, СПЦ позволяет одновременно с индикатрисой измерять несколько сигналов флуоресценции, используя для возбуждения либо тот же лазер, либо другой, перпендикулярный потоку. В данной диссертации используется конфигурация СПЦ, которая измеряет следующую индикатрису:

(1)

где S₁₁ и S₁₄ - это элементы матрицы Мюллера, а усреднение проводится по всему азимутальному углу рассеяния.

Раздел 1.3 посвящён обзору существующих методов моделирования светорассеяния, которые можно разделить на строгие и приближённые. К последним относятся приближения Релея, Релея-Дебая-Ганса (РДГ) и Вентцеля-Крамерса-Бриллюена (ВКБ), аномальная дифракция (АД) и геометрическая оптика. Приближённые теории обладают быстротой и простотой, однако границы их применимости не определены чётко, так как их точность сильно зависит от формы частицы и от того, какую именно величину требуется вычислить. Клетки крови лишь частично попадают в область применимости РДГ, АД и ВКБ. Строгие методы, в свою очередь, удобно разделить на аналитические, частично аналитические и численные. К аналитическим методам относятся различные варианты метода разделения переменных (МРП), которые практически применимы только к шарам и сфероидам, возможно многослойным. Частично аналитические методы базируются на разложении решения дифференциального уравнения для электрического поля в частотной области в ряд по собственным функциям этого уравнения. К ним относятся обобщённый МРП, дискретизированный формализм Ми, метод согласования в конечном числе точек и метод расширенных граничных условий. Более общими методами, применимыми также и к вогнутым частицам, являются метод дискретных источников (МДИ) и программа на основе нескольких мультиполей.

Неоднородные частицы произвольной формы составляют область применения численных методов, которые напрямую дискретизируют дифференциальные или интегральные уравнения для электромагнитного поля. К ним относятся метод конечных разностей во временной области (КРВО), метод конечных элементов, метод моментов (ММ) и метод дискретных диполей (МДД). Ввиду их сложной морфологии строгое моделирование светорассеяния клетками крови требует именно численного метода. В данной диссертации использовался МДД, который физически представляет рассеиватель в виде кубической решётки точечных диполей, поляризуемость каждого из которых определяется локальным показателем преломления. Взаимодействие этих диполей друг с другом и с падающим электрическим полем определяет поляризацию каждого диполя. Рассеянное поле вычисляется как суперпозиция полей, излучённых точечными диполями с известными поляризациями.

В разделе 1.4 описаны существующие подходы к решению обратной задачи светорассеяния. Прямая подгонка экспериментальной индикатрисы путём решения прямой задачи для многих наборов параметров методически проста, однако её применимость практически ограничена простыми формами частиц, вплоть до пятислойного шара. Для анализа одиночных частиц в реальном времени наиболее предпочтительны эмпирические или приближённые методы, которые обычно основаны на сжатии информации, содержащейся в индикатрисе, до нескольких специально подобранных параметров, которые получаются либо напрямую из индикатрисы, либо из её спектра Гегенбауэра или Фурье. При этом многомерное отображение параметров частицы (размер, показатель преломления и т.д.) в параметры индикатрисы обращается приближённо. Обобщением этого подхода является нейронная сеть, которая автоматически обращает многомерное отображение, - в настоящее время эта область быстро развивается, но для характеризации одиночных частиц нейронные сети применялись пока только для шаров. В данной диссертации мы имеем дело со сложными частицами, и большим количеством параметров частиц, вплоть до шести. Поэтому мы используем подходы, основанные на базе данных индикатрис для различных параметров, которая используется либо напрямую для характеризации, либо как учебный набор для развития другого метода.

Во второй главе развивается МДД. В первом разделе проведён подробный обзор предыдущих работ в рамках общей формулировки на основе интегрального уравнения для электрического поля. Хотя основные алгоритмы МДД, которые используются в нескольких широко используемых компьютерных программах, мало изменились с 1994 г., было предложено много улучшений, которые ещё не общеприняты. Сначала обсуждается теория МДД, включая формулировки различных авторов, и его место среди похожих методов, таких как ММ. Далее приведены литературные данные по точности МДД при численном моделировании для различных форм, размеров и показателей преломления рассеивателей. Далее подробно обсуждаются вычислительные аспекты МДД, а именно прямые и итерационные методы решения линейных уравнений и использование быстрого преобразования Фурье для вычисления произведения матрицы на вектор.

В завершение, описаны существующие работы, в которых МДД сравнивается с другими методами.

В разделе 2.2 представлен теоретический анализ сходимости МДД. Исходя из интегрального уравнения для электрического поля, доказано, что ошибка любой измеряемой величины ограничена квадратичной функцией параметра дискретизации y |m|kd (k - волновое число во внешней среде, d - диаметр диполя):

(2)

где константы c₁-c₄ зависят от всех параметров задачи и конкретной измеряемой величины, но не зависят от y. При выводе предполагается, что kd 2, а обратный интегральный оператор рассеяния имеет конечную L₁ норму. Линейный член относительно мал для кубовидных рассеивателей (форма которых может быть точно описана набором кубических элементов), и его относительная важность убывает с ростом размера частицы. Поэтому сходимость МДД для достаточно больших частиц квадратична при типичных значениях d.

Было проведено моделирование для пяти тестовых частиц: куб с kD 8, три шара с kD 3, 10 и 30 и частица, полученная дискретизацией шара с kD 10, используя 16 диполей на D (всего 2176 диполей); D обозначает диаметр шара или длину стороны куба. Все рассеиватели однородные с m 1.5 Результаты моделирования подтверждают все теоретические выводы. Более того, ошибки не только ограниченны квадратичной функцией, но и могут быть (с хорошей точностью) описаны квадратичной функцией (рис.1).

Рис.1. Относительная ошибка эффективности экстинкции Q_ext (со знаком) в зависимости от y и подогнанные квадратичные функции по 9 лучшим точкам для трёх шаров.

В разделе 2.3 на основании теоретического анализа предложена методика экстраполяции, основанная на предположении, что

, (3)

где a₀, a₁ и a₂ - это коэффициенты, выбранные так, чтобы ^y - ошибка приближения - была в некотором смысле минимальна. Тогда a₀ является оценкой точного значения измеряемой характеристики ⁰. Вычисление a₀, по сути, является подгонкой квадратичной функции по нескольким точкам {y, ^y}, полученным стандартным МДД моделированием (рис.1). Мы используем подгонку методом наименьших квадратов, параметрами которого являются: количество и величины y (интервал [y_min,y_max]), относительный вес различных точек (ожидаемое поведение ошибок ^y), и оценка погрешности итогового результата (исходя из стандартного отклонения, СО, величины a₀). Эти параметры выбираются эмпирически - нашей целью является показать применимость одного конкретного набора параметров, а их оптимизация является предметом дальнейшего исследования. В итоге сформулирована следующая пошаговая методика экстраполяции, где используются сокращения (к) и (нк) для кубовидных и некубовидных рассеивателей соответственно:

Выберите y_min на основе имеющихся вычислительных ресурсов.

Возьмите y_max равное 2-м (к) или 4-м (нк) y_min, но не больше чем 1.

Выберите 5 (к) или 9 (нк) точек в интервале [y_min,y_max], примерно равномерно расположенных в логарифмическом масштабе.

Проведите МДД моделирование для каждого значения y.

Подгоните квадратичную функцию [формула (3)] к точкам {y, ^y}, используя y³ в качестве ошибок данных; тогда a₀ будет оценкой значения ⁰.

Умножьте СО a₀ на 10 (к) или 2 (нк) чтобы оценить погрешность экстраполяции.

Моделирование для тех же тестовых частиц, что и в предыдущем разделе показало, что экстраполяция заметно подавляет максимальные ошибки S₁₁ (), когда параметр наилучшей дискретизации y_min 0.4 и 0.15 для кубовидных и некубовидных рассеивателей соответственно. Качество экстраполяции улучшается с уменьшением y_min, достигая выдающихся результатов, особенно для кубовидных частиц, - уменьшение ошибки на два порядка при y_min 0.05 (рис.2, при этом время вычислений увеличивается менее чем в 2.7 раза). Предложенная оценка надёжно описывает реальную ошибку, хотя она требует дальнейшего улучшения, чтобы не переоценивать ошибку в некоторых случаях. Этот подход используется в данной диссертации для оценки ошибки моделирования светорассеяния клетками крови. Поскольку эта оценка полностью внутренняя, она потенциально позволяет создать адаптивный МДД - программу, автоматически улучшающую дискретизацию до достижения заданной точности.

Рис.2. Ошибки S₁₁ () в логарифмическом масштабе для экстраполяции с использованием 5 значений y в интервале [0.047,0.094] для куба с kD 8.

Рис.3. Текущие возможности ADDA для шаров с различными x и m. Заштрихованная область соответствует полной сходимости, а перекрёстно заштрихованная - неполной. Пунктирные линии отображают два уровня постоянного объёма памяти.

В разделе 2.4 представлена новая компьютерная программа на основе МДД, разработанная автором диссертации и названная ADDA. Основной отличительной чертой этой программы является возможность параллелизовать одиночное вычисление, разделяя его между многими процессорами, поэтому размер частиц не ограничен памятью одного процессора. Моделировалось светорассеяние шарами с разными размерами и показателями преломления, используя 32 узла Голландского вычислительного кластера LISA (на каждом два процессора Intel Xeon 3.4 ГГц и 4 ГБ памяти). Использовалась стандартная формулировка МДД и три разных итерационных метода: метод квазиминимальной невязки, би-сопряжённых градиентов (Би-СГ) и Би-СГ стабилизированный. Для всех трёх использовался критерий остановки по умолчанию - относительная норма невязки _it 10⁵, однако в некоторых случаях ADDA останавливалась на более высоком значении. Текущие возможности программы показаны на рис.3 в координатах (x,m), в частности, биологические частицы (m 1.05) можно моделировать вплоть до x 160, что покрывает весь диапазон клеток крови при использовании видимого излучения.

Время вычисления резко увеличивается с ростом и x, и m - оно не превосходит 1 часа для m 1.05, но достигает величин порядка недели для бульших m. Последнее связано с очень медленной сходимостью итерационного метода, ускорение которой, например, с помощью предобусловливания, является темой дальнейшего исследования. Ошибки и интегральных, и разрешённых по углу измеряемых характеристик в целом увеличиваются с m, но не имеют систематической зависимости от x.

Таблица 1. Время вычислений (одной ориентации) и память, используемая четырьмя программами МДД, для двух тестовых задач.

^a Эта величина не была измерена.

В разделе 2.5 ADDA сравнивается с тремя другими аналогичными программами (SIRRI, DDSCAT, ZDD) для нескольких тестовых задач. Сравнение проводилось в терминах точности, быстродействия и удобства работы - каждая программа имеет свои преимущества и недостатки. Использовались следующие пять тестовых частиц: шар, сфероид, цилиндр и кластеры из 4 и 50 одинаковых шаров - для всех x 5.1, и два разных показателя преломления: m_si 1.6 0.001i (силикат) и m_ic 1.313 (лёд). Размер диполя соответствовал kd 0.3, и для всех частиц, кроме шара, проводилось усреднение по ориентации. Для шара ADDA, DDSCAT и ZDD приводят к практически идентичным результатам, что подтверждает то, что они основаны на одинаковой формулировке МДД (на основе дисперсионного соотношения решётки, предложенного Дрейном). Ошибки SIRRI, основанной на выражении для поляризуемости диполей, предложенном Лахтакиа, немного больше.

Однако схемы усреднения по ориентации различаются во всех программах. В ADDA используется регулярная решётка по углам Эйлера и метод интегрирования Ромберга, который можно использовать в адаптивном режиме. Но в некоторых случаях, особенно для осесимметричных частиц, эта схема приводит к плохой точности при использовании настроек по умолчанию. Важно отметить, что при учёте симметрий частицы в настройке данной схемы точность ADDA не хуже, чем для других программ. С другой стороны, ADDA быстрее всех остальных программ во всех тестах, причём для некоторых частиц более чем в два раза (таблица 1), и она единственная применима к большим частицам, для которых не хватает памяти одного процессора.

В разделе 2.6 проводится систематическое сравнение МДД с КРВО в широком диапазоне размеров и показателей преломления рассеивателей, используя современные параллельные реализации обоих методов и требуя, чтобы они достигли определённой точности, после чего сравнивалась их производительность. Моделирование светорассеяния проводилось для шаров с размерным параметром вплоть до 80 и вещественной части показателя преломления m вплоть до 2 (мнимая часть m равнялась 1.510^-5). Времена вычисления на 16 узлах кластере Lemieux (каждый имеет 4 процессора Alpha EV6.8 1 ГГц и 4 ГБ памяти), требуемые для достижения точности 1% в Q_ext и среднеквадратичной относительной ошибки S₁₁ () не более 25%, приведены в таблице 2. Относительное быстродействие резко зависит от m - МДД более чем на порядок быстрее при m? 1.2 и x 30, в то время как при m? 1.7, наоборот, КРВО быстрее в той же степени, а при m = 1.4 методы сравнимы.

Таблица 2. Времена вычисления для шаров с разными x и m. ^a

^a Скобки указывают неполную сходимость

Также рассмотрены два примера биологических клеток: эритроцит и предшественник B-лимфоцита, для последнего использовалась реалистичная трёхмерная модель, измеренная с помощью конфокального микроскопа. При этом МДД в 80 и 60 раз быстрее соответственно, что согласуется с выводами для шаров. Хотя выводы данного сравнения немного зависят от конкретной характеристики рассеяния и от степени оптимизации программ, принципиально они не изменятся, пока не произойдёт большое улучшение эффективности одного из методов. Тем не менее данное сравнение нельзя считать завершённым, поскольку мы не варьировали мнимую часть показателя преломления, которая существенно влияет на эффективность обоих методов. Проведённые сравнения показывают, что МДД, в частности, компьютерная программа ADDA, является наиболее подходящим методом для моделирования светорассеяния клетками крови.

Третья глава посвящена характеризации эритроцитов по индикатрисам светорассеяния. В первом разделе проводится обзор литературы по морфологии эритроцитов и их исследованиям на основе светорассеяния. Введены следующие параметры: диаметр D, минимальная (b) и максимальная (h) толщина, объём V, площадь поверхности S, индекс сферичности (ИС) и концентрация гемоглобина HbC, последняя линейно связана с показателем преломления эритроцита. Приведены литературные данные по значениям этих параметром для нормальных человеческих эритроцитов, полученные различными экспериментальными методами. Также описаны существующие параметрические модели двояковогнутой формы эритроцита, среди которых наиболее реалистичной является форма, предложенная Эвансом и Фангом на основе прямых экспериментальных измерений с помощью интерференционной голографии:

(4)

где z и это цилиндрические координаты, ось z совпадает с осью симметрии клетки.

Светорассеяние эритроцитами долгое время моделировалось путём приближения двояковогнутой формы шаром, сфероидом или эллипсоидом, что оправдано только при определённых экспериментальных условиях. Впервые строгое моделирование светорассеяния нативными эритроцитами было проведено с помощью метода граничных элементов, а далее с помощью МДИ, КРВО и МДД. Однако строгое моделирование использовалось только в фундаментальных целях, таких как проверка адекватности приближённых форм. Практическая характеризация эритроцитов ограничивается методами, основанными на сферизации эритроцитов с сохранением объёма и последующим измерением размера и показателя преломления этих шаров по сигналам светорассеяния, тем самым определяя V и HbC. Недавно был предложен новый метод для определения диаметра эритроцита по спектру Фурье его индикатрисы.

В разделе 3.2 проведено моделирование светорассеяния эритроцитами с помощью МДД - индикатриса чувствительна к форме эритроцита, поэтому в общем случае требуется использовать метод, способный работать с реалистичной формой, для изучения влияния характеристик эритроцита на его индикатрису. Предложен ² метод характеризации эритроцитов, основанный на прямом сравнении экспериментальных индикатрис с теоретическими с использованием следующей меры близости:

(5)

где I_exp (_i) - это экспериментальная индикатриса, измеренная для n углов _i (₁ 10, _n 50), I_th (_i) - теоретическая индикатриса, вычисленная для тех же углов, а w (_i) - следующая весовая функция:

,(6)

что соответствует стандартному окну Хенинга, которое сильно уменьшает влияние разрывов в начале и конце измерительного диапазона СПЦ. Мы считаем, что анализируемый эритроцит имеет те же характеристики, что и ближайшая модель (по ² расстоянию). Данный идея была продемонстрирована на базе данных из 92 индикатрис для разных диаметров, объёмов и ориентаций эритроцита в капилляре СПЦ (угол ).

Рис.4. Усреднённый профиль эритроцита из работы Фанга и др., подогнанный четырёхпараметрической моделью; показаны геометрические параметры.

В разделе 3.3 представлено дальнейшее развитие ² метода. Предложена четырёхпараметрическая модель формы эритроцита, в которой все величины, полученные микроскопическими измерениями (D, b, h и диаметр кольца максимальной толщины с), являются независимыми входными параметрами. В частности, эта модель хорошо описывает экспериментальные результаты Фанга и др. на основе формулы (4) - рис.4. Составлена база данных из 40 000 индикатрис эритроцитов, при этом случайно выбирались шесть параметров: четыре параметра формы, HbC и из интервалов, соответствующим литературным данным ( выбиралось из интервала [75,90] ввиду ориентирующих свойств СПЦ). В ² методе умножение на весовую функцию было заменено логарифмическим преобразованием:

(7)

Кроме того используется немного другой диапазон ^: ₁ 12 и _n 55. Формула (7) измеряет среднюю относительную разницу между двумя функциями, за исключением небольшого интервала углов вблизи _n.

Таблица 3. Результаты ² метода и сравнение с другими методами. ^a

^a Показаны средние значения ± 2СО.

^b Coulter MAX M не определяет СО для распределения по HbC.

Рис.5. Положение последнего пика амплитудного спектра Фурье модифицированной индикатрисы и диаметр для 40 000 моделированных эритроцитов. Также показана линейная подгонка через все точки.

Результаты применения ² метода к пробе крови здорового донора приведены в таблице 3. Значения для V и HbC сравнены с методами на основе сферизации эритроцитов с сохранением объёма и коммерческого гематологического анализатора Coulter MAX M (Beckman Coulter Corporation). Средние значения хорошо согласуются, однако стандартные отклонения для ² метода примерно в 1.5 раза больше, чем для эталонных методов. Это объясняется чувствительностью ² метода к несовершенству оптической системы СПЦ, однако этот вопрос требует дальнейшего исследования. Результаты для всех параметров разумные, за исключением минимальной толщины, которая не может быть точно определена ² методом, ввиду низкой чувствительности индикатрисы к этому параметру.

Мы также использовали базу данных вычисленных индикатрис для уточнения и проверки ранее предложенного эмпирического метода определения диаметра эритроцита D по положению последнего пика (ППП) в амплитудном спектре Фурье модифицированной индикатрисы, определённой как

(8)

где w_F () ^2.5, и индикатриса рассматривается в интервале [5,50]. Мы вычислили ППП для каждой из 40 000 теоретических индикатрис и отложили их как функцию от D на рис.5. Процедура обращения основана на выраженной линейной корреляции между ППП и D:

(9)

коэффициент которой (среднее значение) определён для длины волны 660 нм и показателя преломления внешней среды m₀ 1.337. Применимо к той же пробе крови спектральный метод приводит к распределению по диаметру 7.00 ± 1.86, что шире, чем для ² метода. Следовательно требуется дальнейшее улучшение обоих методов, а для проверки их точности необходим эталонный метод, например, на основе микроскопических измерений. Для дальнейшего развития как ², так и спектрального метода требуется дополнительная проверка для многих проб крови в сравнение с эталонными методами.

В четвёртой главе представлено исследование светорассеяния гранулоцитами. Первый раздел посвящён обзору литературных данных по морфологии гранулоцитов, а также существующих методов их исследования с помощью светорассеяния, в частности, на проточных цитометрах. Гранулоциты это самый многочисленный тип лейкоцитов, состоящий из трёх подтипов: нейтрофилов, эозинофилов и базофилов. Их количество относительно всех лейкоцитов в нормальных условиях лежит в диапазонах 46-73%, 0-4.4% и 0.2-1.2% соответственно. В мазках крови гранулоциты имеют размер 10-15 мкм, однако во взвеси их размеры заметно меньше - 8.3, 8 и 5-7 мкм для нейтрофилов, эозинофилов и базофилов соответственно. Их ядро состоит из нескольких долей, обычно двух или трёх. Гранулы в каждом из подтипов представлены несколькими классами: в нейтрофилах размеры этих классов равны примерно 0.2 и 0.5 мкм, в эозинофилах - 0.1-0.5 и 0.5-1.3 мкм, а в базофилах - 0.1-0.5 и 0.2-1.0 мкм. Суммарный объём гранул равен примерно 10% объёма клетки.

В проточных цитометрах гранулоциты можно отделить от других лейкоцитов по бульшим сигналам рассеяния вперёд и вбок (кроме базофилов, которые попадают в область лимфоцитов). Дальнейшее разделение гранулоцитов на подтипы основано на измерении либо количества поверхностных антигенов, таких как CD45, CD16, CD49d, NTB-A и CD224, используя меченые моноклональные антитела, либо степени деполяризации бокового рассеяния (D_SS). Последняя была предложена де Гротом и сотрудниками как отношение интенсивности деполяризованного бокового рассеяния (I) к полной (I_SS) - они экспериментально показали, что эозинофилы имеют примерно такое же I_SS, как нейтрофилы, но большее I и D_SS.

В разделе 4.2 проводится теоретическое исследование светорассеяния моделью гранулоцита с помощью метода дискретных диполей путём вычисления I_SS и I для разных размеров (D_c и d_g) и показателей преломления (m_c и m_g) клетки и гранул соответственно, и разных объёмных долей гранул f. В качестве модели гранулоцита мы используем зернистый шар, который не имеет ядра, а все его гранулы одинаковы и случайно расположены. Использовались следующие параметры модели по умолчанию: D_c 8 мкм, f 0.1, m_c 1.015, m_g 1.2, 0.4936 мкм (во внешней среде). Основная переменная величина - это d_g, который изменяется от 0.075 до 2 мкм. Конкретный результат зависит от случайного положения гранул, поэтому мы повторяем каждое вычисление 10 раз и показываем среднее 2СО для каждой характеристики рассеяния. Сигналы бокового рассеяния моделировались в соответствии с исходной работой де Грота и др., используя квадратную апертуру, ограничивающую и полярный и азимутальный угол рассеяния интервалом 90 25. I_SS и I получены усреднением по этой апертуре.

Результаты моделирования приведены на рис.6, где каждая точка соответствует одному d_g. Мы также варьировали все параметры модели (кроме ), но общий вид зависимостей I_SS и I от d_g не изменялся - два сегмента высокой корреляции между I_SS и I для малых и больших d_g и промежуточная область для узкого диапазона d_g. Эти области качественно соответствуют нейтрофилам и эозинофилам по данным де Грота и др. Как I_SS, так и I увеличиваются с ростом d_g при малых d_g, достигают максимума при d_g порядка и после медленно спадают. D_SS ведёт себя ступенчато (рис.7), при этом литературное значение для нейтрофилов примерно соответствует пределу малых d_g для f 0.1, в то время как D_SS для эозинофилов лежит между пределами малых и больших d_g для той же f. Последнее можно качественно объяснить наличием у эозинофилов больших ( 0.4 мкм), малых ( 0.25 мкм) и промежуточных гранул. Тем самым различие в I и D_SS между нейтрофилами и эозинофилами можно полностью объяснить разным размером гранул.

Рис.6. Интенсивности полного и деполяризованного бокового рассеяния для нескольких диаметров гранул от 0 до 2 мкм. Показаны средние значения 2СО.

Рис.7. Степень деполяризации бокового рассеяния в зависимости от диаметра гранул для нескольких объёмных долей. Показаны средние значения 2СО. Также приведены литературные средние значения для нейтрофилов и эозинофилов.

Аналитические выражения, полученные в рамках приближений Релея-Дебая-Ганса и второго борновского, качественно описывают все эти результаты. Более того, эти выражения численно согласуются со строгим МДД моделированием при малых d_g и f, что может быть использовано для приближённого решения обратной задачи светорассеяния для гранулоцитов. В завершение приведены вычисленные зависимости Q_ext и параметра асимметрии от d_g и f.

В разделе 4.3 представлены первые экспериментальные измерения индикатрис светорассеяния нейтрофилов и их сравнение с моделированием на основе МДД. Для однозначной идентификации нейтрофилов использовались моноклональные антитела к CD16b, меченные флуоресцеина изотиоцианатом. Для сравнения с экспериментальными данными мы провели дополнительное моделирование с помощью МДД, немного изменив параметры модели. Во-первых, установив D_c 9.6 мкм, m_g 1.15 и m_c 1.015, мы вычислили шесть индикатрис для зернистых шаров с d_g 0.1, 0.15 и 0.2 мкм и f 0.1 и 0.2. Во-вторых, мы добавили в нашу модель ядро, составленное вручную из четырёх эллипсоидов разного размера, случайно расположенных и повёрнутых в цитоплазме, с суммарной объёмной долей равной 0.11. Рассматривались две ориентации модели относительного падающего излучения, а гранулы случайно располагались в оставшейся цитоплазме с объёмной долей f 0.1 (суммарная объёмная доля нецитоплазматического материала во всей клетки 0.2). Мы использовали те же три размера гранул, что и выше, а показатель преломления ядра m_n такой же, что и для гранул (1.15).

Усреднённые по пробе экспериментальные индикатрисы сравнены с модельными для d_g 0.15 мкм на рис.8. Общая величина модельных индикатрис хорошо согласуется с экспериментом для разных проб, при этом различие между моделями не превосходит разницы между пробами. Наличие ядра значительно увеличивает I () при 15 40, в то время как при бульших углах I () практически одинакова для всех моделей с одинаковой суммарной объёмной долей ядра и гранул. Важно отметить, что величина индикатрисы сильно зависит от показателей преломления ядра и гранул и от f. Вероятно, вариация именно этих факторов приводит к различию экспериментальных индикатрис между пробами, так как ядро присутствует во всех зрелых нейтрофилах.

Рис.8. Усреднённые по пробе экспериментальные индикатрисы нейтрофилов трёх доноров в логарифмическом масштабе, показанные вместе с индикатрисами моделей с ядром и без.

Также было измерено распределение по диаметрам нейтрофилов с помощью спектрального метода, средние значения составили от 9 до 10 мкм с различием менее 10% между пробами. Однако, эти результаты лишь приблизительные, так как применимость спектрального метода для зернистых частиц на данный момент недостаточно обоснована. Результаты моделирования позволяют приблизиться к задаче характеризации нейтрофилов, однако на данный момент не представляется возможным строго характеризовать отдельные нейтрофилы. Возможны несколько упрощённых подходов: характеризовать отдельные нейтрофилы, используя приближённые теории светорассеяния, или определять средние по пробе морфологические параметры путём анализа усреднённых индикатрис. Но даже эти более простые задачи отнюдь не тривиальны и всё ещё ожидают своего решения.

Результаты работы