Обоснование переработки гаммаруса Балтийского моря (gammarus lacustris) методами биотехнологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата

технических наук

Специальности: 05.18.04 -

Технология мясных, молочных, рыбных

продуктов и холодильных производств

05.18.07 - Биотехнология пищевых продуктов

ОБОСНОВАНИЕ ПЕРЕРАБОТКИ ГАММАРУСА БАЛТИЙСКОГО МОРЯ (GAMMARUS LACUSTRIS) МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ

Григорьева Евгения Васильевна

Москва - 2008

Работа выполнена во ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет» и Гамбургском университете (Институт технической и макромолекулярной химии), Германия.

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор

Мезенова Ольга Яковлевна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук,

старший научный сотрудник,

Маслова Галина Васильевна;

кандидат технических наук,

Ведерникова Ирина Владимировна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет» (ФГОУ ВПО «Дальрыбвтуз»)

Защита состоится 11 июня 2008 года в 14⁰⁰ ч на заседании диссертационного совета Д 307.004.03. при ФГУП «Всероссийский научно - исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО») по адресу: 107140, г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Всероссийский научно - исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (ФГУП «ВНИРО»).

Автореферат разослан 8 мая 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук

В.А. Татарников

1. Общая характеристика работы

Актуальность работы. Природные биополимеры хитин и хитозан все шире применяются в различных отраслях промышленности, что обусловлено их уникальным химическим составом и свойствами (биосовместимость, нетоксичность, биодеградируемость, сорбционность и др.). Традиционным объектом для получения данных продуктов являются панцирьсодержащее сырье (ПСС), образующееся при разделке промысловых ракообразных (крабы, криль, креветки, раки и др.). Несмотря на то, что запасы ПСС достаточно стабильны, отмечена положительная динамика новых источников получения хитина. В последние годы изучены насекомые (пчелиный подмор, надкрылья тараканов, майских жуков), кораллы, термиты и др., для которых разработаны специальные технологии. (О.Ю. Зуева, С.В. Немцев, 2003; R.A.A. Muzzarelli, 1997 и др.).

Однако в акватории Балтики традиционное ПСС отсутствует, а переработка новых источников по ряду причин не развивается выше кустарного уровня. В Балтийском море, Куршском и Вислинском заливах, озерах Калининградской области в большом количестве обитает недоиспользуемый в промышленности - рачок-бокоплав гаммарус (Gammarus lacustris). Относительно высокое содержание (25-30%) и малая толщина (100 - 500 мкм) панциря облегчают процесс его диспергирования, необходимого при всех способах получения хитина. С учетом оценки его запасов и высокой способности рачка к размножению данную сырьевую базу можно считать потенциально значимой в регионе для получения хитина (Е.Э. Куприна, 1997; Г.В. Маслова, 1996; R.A.A. Muzzarelli, 1997).

Принимая во внимание факт присутствия в составе гаммаруса также других ценных компонентов (белки, липиды, пигменты, минеральные вещества и др.), целесообразным представляется его комплексная переработка методами биотехнологии с получением хитина и дополнительного белкового гидролизата, представляющего ценность для кормовой промышленности.

Несмотря на актуальность применения хитозана в пищевой, медицинской и других сферах производства, внедренных решений не очень много, что объясняется как дефицитом биополимеров, так и отсутствием качественных разработок.

Вопросами совершенствования производства и применения хитина и хитозана занимались многие ученые: Албулов А.И., Быков В.П., Варламов В.П., Вихорева Г.А., Водолажская С.В., Гамзазаде А.И., Дацун В.М., Куприна Е.Э., Маслова Г.В., Немцев С.В., Новиков М.Ю., Нудьга Л.М., Сафронова Т.М., Третениченко Е.М., Hirano S., Johnson E.L., KaeЯmann H.J. Muzzarelli R.A.A., Peniston C.P., Peter M.G., Struszczyk H и др.

Однако в известных трудах отсутствуют технологические решения по комплексной переработке гаммаруса балтийского, имеющего специфические особенности состава и свойств. На сегодня не изучен биотехнологический потенциал данного сырья, без знания которого нельзя однозначно применять известные способы для его переработки. Отсутствуют решения по стабилизации активной биодепротеинирующей системы, составу и функциональным свойствам получаемых из гаммаруса биополимеров, рациональных областях и конкретных технологиях их применения. Не разработаны соответствующие аппаратурные требования, необходимые для внедрения результатов исследования.

С учетом сказанного представляется актуальным получать хитин и хитозан из балтийского гаммаруса с применением усовершенствованного способа предварительного ферментирования при его комплексной переработке. Рациональным является синергетическое использование автоэнзимолиза в среде био- (фито-) консервантов с введением в качестве жидкой фракции гидромодуля молочной творожной сыворотки или раствора натуральных компонентов алоэ. Последние надежно подавляют гнилостные процессы, развивающиеся при автодеструкции белков гаммаруса, но не ингибирует сами энзимы, что позволяет получить устойчивый антисептический эффект и использовать в кормовых целях образующийся бульон, обладающий приятными органолептическими свойствами и ценными биологически активными веществами (флавоноиды, гликозиды, алколоиды, витамины, минеральные, липидные и др.). При этом становится возможной последующая ускоренная дообработка сырья и получение обогащенного белкового гидролизата при снижении агрессивной химической нагрузки процесса в целом.

Цель работы заключалась в комплексной переработке балтийского гаммаруса с применением процессов автоэнзимолиза и биоконсервирования для получения хитозана и биологически ценного гидролизата.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Изучение техно-химических свойств балтийского гаммаруса и обоснование возможности его комплексной переработки с применением предварительного автоэнзимолиза в условиях биоконсервирования;

2. Исследование, моделирование и оптимизация технологического процесса автоэнзимолиза, как предварительного депротеинирования, при использовании молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ;

3. Формализация и обоснование оптимальных параметров деминерализации полуфабриката хитина, направляемого в обработку после автоэнзимолиза гаммаруса;

4. Исследование состава и функциональных свойств полученного хитозана в технологии рыбы холодного бездымного копчения и при синтезе медицинских биопленок;

5. Получение биологически ценного гидролизата из белковой части гаммаруса и исследование его качества;

6. Разработка комплексной схемы переработки гаммаруса и рекомендаций по применению конечных продуктов;

7. Производственная апробация технологической рекомендации по адгезионному копчению;

8. Оценка эффективности разработки;

9. Подготовка нормативной документации на технологический процесс и готовые продукты из балтийского гаммаруса.

Научная новизна работы. Обосновано совершенствование биотехнологического метода получения хитина, хитозана и биоавтогидролизата из недоиспользуемого хитинсодержащего сырья - балтийского гаммаруса, сущность которого заключается в его предварительном автоэнзимолизе в среде биоконсервантов при последующих однократных процессах деминерализации и депротеинизации, что позволяет получать функциональные конечные продукты, осуществлять процесс комплексно и безопасно. Установлены высокая автопротеолитическая способность тканей сушеного рачка и характер деструкции тканей в биореакционной автосистеме, представляющей собой дисперсию измельченного гаммаруса в водной среде биоконсерванта. Обоснована рациональность применения молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ, биологически активные вещества которых, надежно предотвращают микробиологическую порчу белковой части автосистемы, не влияя на активность ее ферментов. Разработана математическая модель процесса автоэнзимолиза гаммаруса, а также деминерализации полуфабриката хитина, адекватно связывающие факторы процессов с качеством конечных продуктов и позволяющие его регулировать по органолептическим и физико-химическим показателям. Исследованы основные качественные характеристики хитина и хитозана (минеральный состав, степень деацетилирования, молекулярная масса, вязкостные свойства растворов, термическая устойчивость, микробиологические показатели). Изучено качество биоавтогидролизата, содержащего в сохраненном виде биокомпоненты гаммаруса и натуральные биоконсерванты. Установлены минеральный и жирно-кислотный составы рачка и биоавтогидролизата, представленные рядом ценных микроэлементов, моно- и полиненасыщенных жирных кислот. Показана функциональность использования хитозана в пищевых и медицинских целях. Разработана математическая модель состава коптильного геля с применением хитозана. Исследован антисептический эффект биомедицинских пленок на основе хитозана, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи.

Новизна технологического решения подтверждена Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса».

Практическая значимость работы. Разработана комплексная технология переработки балтийского гаммаруса, позволяющая получать хитин, хитозан и биоавтогидролизат, обладающие высокими качественными характеристиками, приоритет которой подтвержден Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса».

Разработан проект нормативной документации на изготовление из балтийского рачка хитина, хитозана и биоавтогидролизата, что позволяет получать ценные биологически активные вещества из нового сырья практически безотходно, комплексно, по эффективным технологиям. Предложены модели процессов и методики их расчетов, которые способны регулировать выход и качественные характеристики готовых продуктов. Разработаны практические рекомендации по использованию получаемых биологически активных веществ и композиций в технологии пищевых, медицинских и кормовых продуктов.

Действенность разработанных рекомендаций положительно апробирована в производственных условиях ИП «Черба» (Калининградская обл., п. Васильково) в технологии бездымного копчения рыбы. В условиях Гамбургского университета показана антисептическая функциональность хитозана в составе медицинских биопленок.

Материалы работы использованы в учебном процессе подготовки студентов, магистрантов и аспирантов пищевых специальностей ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический университет», а также студентов Гамбургского университета (Германия), занимающихся технологиями высокомолекулярных биополимеров.

Проведена оценка экономической и социальной целесообразности реализации разработанной комплексной технологии переработки гаммаруса и применения целевых продуктов.

На защиту выносятся:

· Обоснование процесса автоэнзимолиза с биоконсервированием в технологии комплексной переработки гаммаруса при получении хитина и хитозана.

· Зависимости формирования качества хитина и хитозана в процессе переработки гаммаруса, установленные на основных этапах технологии.

· Параметры качества, обосновывающие функциональность готовых продуктов переработки гаммаруса.

Апробация работы. Результаты выполненных исследований были представлены на коллоквиуме по макромолекулярной химии (Freiburg im Breisgau, 2005), III Международной научной конференции «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2005), НПК «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», (Калининград, 2005), фирме Байерсдорф АО (Hamburg, 2005), VIII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», (Казань, 2006), Международном симпозиуме «Биоматериалы» и 29-ом «Гамбургском симпозиуме по макромолекулярной химии» (Hamburg, 2006), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы», (Калининград, 2006), V Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании 2007», «У.М.Н.И.К.», (Калининград, 2007), III Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), заседаниях кафедры пищевой биотехнологии ФГОУ ВПО «КГТУ» 2005-07 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 1 Патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, литературный обзор, методическую и экспериментальную части, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 235 страницах основного текста, содержит 50 таблиц, 60 рисунков, 8 приложений, ссылки на 216 литературных источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов.

Исследования проведены в ФГОУ ВПО «Калининградской государственный технический университет» по госбюджетной НИР № 30.36.100.2, а также Институте технической и макромолекулярной химии Гамбургского университета (Германия) в рамках программы немецкого экологического фонда (Deutsche Bundesstiftung Umwelt).

Автор выражает благодарность всем причастным к данной работе, прежде всего, научному руководителю д. т. н., профессору О.Я. Мезеновой и руководителю стажировки в Германии, доктору наук, профессору В.М. Кулике (Университет Гамбурга, Институт технической и макромолекулярной химии).

2. содержание работы

Во введении обоснована актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований, защищаемые положения.

В первой главе «Обзор литературы» представлены обзор современного ХСС и перспективы его переработки, технологии получения полиаминосахаров при комплексной переработке сырья, состояние и перспективы развития технологий белковых гидролизатов, применение хитина/хитозана в промышленности.

Во второй главе «Организация эксперимента и методы исследования» представлена схема эксперимента (рис. 1), приведена характеристика объектов и методов исследования. Основные эксперименты проводили на гаммарусе балтийском (Gammarus lacustris). Органолептическую оценку целевых продуктов (хитина, хитозана, биоавтогидролизата, образцов копченой рыбы) осуществляли с применением действующей НД и разработанных 5 - балльных шкал с учетом коэффициентов значимости отдельных показателей качества. Массовую долю воды, азотистых, минеральных веществ, жира, тяжелых металлов, а также микробиологические показатели определяли стандартными методами; молекулярную массу растворов хитозана измеряли методами вискозиметрии через индекс Штаудингера и гельпроникающей хроматографией; степень деацетилирования оценивали методами ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и титрометрически; реологичекие исследования растворов хитозана осуществляли на реометре TA Instruments Rheometric Series ARES Rheometer (TA Instruments, Newcastle, DE, USA); жирнокислотный (ЖК) состав липидной фракции гаммаруса и белкового гидролизата анализировали методом капиллярной газовой хроматографии на установке (HP 6890 Series GC System, DE) с предварительной экстракцией жира петролейным эфиром (стандартный метод ФРГ) и этерификацией метилированием; вязкость растворов хитозана оценивали на капиллярном вискозиметре Уббелоде Тип Ic (Германия); микробиологическую обсемененность биоавтогидролизата определяли по стандартным методам Европейской фармакопеи (п.2.6.12. и 2.6.13); антисептическую активность хитозана и биопленок на его основе измеряли с использованием жидкой глюкозо-дрожжевой питательной среды No.1-бульон (фирмы VWG-Eurolab, Darmstadt). Моделирование и оптимизацию технологических процессов осуществляли методом планирования эксперимента с применением ортогонального центрального композиционного плана (ОЦКП) второго порядка для двух факторов. Статистическую обработку данных проводили стандартными методами на ПЭВМ с пакетом прикладных программ Microsoft Office (Word, Excel) и Mathcad 2001i Professional.

В третьей главе «Результаты исследования и их обсуждение» в разделе «Характеристика гаммаруса балтийского» приведены особенности его химического состава в сравнении с алтайским рачком (табл. 1, рис. 2).

Таблица 1 Сравнительный химический состав сушеного рачка Gammarus lacustris, выловленного в различных водоемах, % массы сырья

* - литературные данные

Балтийский рачок отличается от исследованного ранее сибирского вида уменьшенным содержанием липидов (4,7 против 7,7%), которые представлены насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами (арахидоновой, эйкозапентаеновой, докозагексаеновой и др.), более низким содержанием минеральных веществ (18,8 против 26,0%). Полученные данные позволяют говорить о рациональности использования липидной части рачка и применении щадящих режимов деминерализации в технологии хитина. Значение протеолитической активности собственных ферментов сушеного гаммаруса составило 1,4 ед/г, что свидетельствует об их высоких функциональных возможностях при проведении автоэнзимолиза.

Обоснование целесообразности и оптимизацию процесса предварительного автоэнзимолиза гаммаруса в технологии хитина/хитозана проводили в серии специальных сравнительных экспериментов. Апробировано 3 способа изготовления хитина из гаммаруса: 1 - с применением автоэнзимолиза при последующем воздействии 4%-ым раствором соляной кислоты и щелочи (эксперимент); 2 - получение хитина традиционным кислотно-щелочным способом по технологии ВНИРО (контроль 1); 3 - с применением промышленного ферментного препарата Протосубтилин Г20Х на стадии предварительного ферментолиза в концентрации 0,2 и 1,0% к массе сырья (контроли 2 и 3).

Сравнительный анализ результатов экспериментов, включающих определение выхода и качественную оценку полученного полуфабриката хитина, показал высокую эффективность экспериментального процесса, включающего автоэнзимолиз, при котором количество депротеинизированного панциря возрастало до 49,0%, относительно 39,4 и 35,2% в контроле 2 и 3. При этом было достигнуто максимальное удаление сопутствующих хитину азотистых соединений (степень депротеинирования экспериментальных образцов составила 65%).

Принимая во внимание длительность процесса, с учетом направленной эффективности автоэнзимолиза в качестве гидросреды использовали молочную творожную сыворотку и раствор компонентов алоэ, биологически активные вещества которых надежно предотвращают микробиологическую порчу, не влияя на активность ферментов, при этом существенно улучшаются органолептические свойства биоавтогидролизата (Т. Сенкевич, 1989; А.Г. Храмцов, П.Г. Нестеренко, 2004; G. Linden 2000; Г.П. Яковлева, 2006; И.П. Неумывакин, 2007).

Установление оптимальных параметров процесса автоэнзимолиза гаммаруса осуществляли путем планирования эксперимента с применением ОЦКП. В качестве частных факторов, подлежащих варьированию и оптимизации, использовали продолжительность автоэнзимолиза (фавт) и температуру (Тавт). Параметром оптимизации был выбран обобщенный показатель у, включающий качественную оценку полученного полуфабриката хитина (содержание общего азота (МN), минеральных веществ (ММВ) и потери массы полуфабриката хитина, в % массы сырья (МПФ). Автоэнзимолиз осуществляли при гидромодуле реакционной системы «измельченный гаммарус: биоконсервант» соответственно «1:3».

Реализация плана эксперимента (табл. 2) и обработка его данных позволили получить уравнение (1), адекватно связывающее качество полуфабриката с изменяемыми факторами:

у = 0,1855 - 0,0672x1 - 0,0293x2 + 0,0123x1x2 + 0,0039х1² + 0,0632х2² (1)

Графическая интерпретация полученной модели (рис. 3) наглядно показывает области локализации процесса, анализ которых, а также учет видовой специфики биоконсервирования позволили установить следующие рациональные значения процесса автоэнзимолиза гаммаруса: продолжительность процесса фавт - от 37 до 42 ч; температура Tавт - от 26 до 32°C.

Обоснование процесса деминерализации полуфабриката хитина, полученного после удаления продуктов автоэнзимолиза фильтрованием и промывкой водой, вели химическим воздействием соляной кислотой, что рекомендовано при получении хитина из мелких ракообразных (В.М. Дацун, Е.Э. Куприна, Л.А. Нудьга, R.A.A. Muzzarelli, 1977).

Таблица 3 Показатели качества экспериментальных образцов хитина и хитозана

Одним из ключевых индикаторов биологической ценности кормового продукта является качественный и количественный состав микроэлементов и жирных кислот (ЖК) в липидах. Анализ минерального состава сушеного гидролизата свидетельствуют о наличии в нем таких полезных элементов (в мг/кг), как кальций (165,0), магний (32,4) натрий (117,8), калий (203,8), цинк (0,60), медь (1,0), железо (0,25), а также отсутствии тяжелых металлов (кадмия, свинца и ртути).

Повышенное содержание калия, кальция и натрия в продукте обусловлено использованием в качестве экстракционной среды биоавтосистемы гаммаруса молочной сыворотки. В случае применения в качестве биоконсерванта раствора компонентов алоэ в гидролизате присутствуют такие биологически активные вещества, как кальций, селен, цинк, витамины группы B, C и E, бета-каротин и флавоноиды.

Результаты сравнительных исследований жирно-кислотного состава липидной фракции гидролизата свидетельствуют о достаточной сохранности в нем ценных характерных для гидробионтов насыщенных и ненасыщенных жирных кислот и его высокой биологической эффективности (табл. 6). С учетом содержания других биологически активных веществ, необходимых для развития организма (витамины, минеральные вещества, органические кислоты), полученный биоавтогидролизат рекомендован в качестве кормовой добавки, предназначенной для сельскохозяйственных животных.

Таблица 6 Жирно-кислотный состав липидов гаммаруса и сушеного биоавтогидролизата, % массы липидов