Определение цинка и меди в клетках поджелудочной железы стрессированных мышей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение цинка и меди в клетках поджелудочной железы стрессированных мышей

Н.В. Григорова, Ю.В. Ещенко,

В.Д. Бовт, В.А. Ещенко

With the aid of 8-(toluenesulfonylamino)-quinoline and aldehyde fuchsin cytochemical reactions zinc and insulin were detected in pancreatic B - cells. Copper was revealed in pancreatic cells throgh dithiooxide and lumocupferon staining.

Stressing mice with physical load, immobilization, alcoholisation, cooling induced zinc content increase and copper content decrease in the cells. Such changes of metals content in the cells were observed under the injection of adrenaline and pilocarpine to animals. The data obtained indicate the role of suprarenales in the regulation of cell metal metabolism and point out the physiological antagonism of zinc and copper in the cells.

Визначення цинку та міді в клітинах підшлункової залози стресованих мишей

За допомогою цитохімічних реакцій 8 - (п - толуолсульфоніламіно) - хіноліну (8 - ТСХ) та альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В визначали цинк та інсулін. Мідь виявляли в клітинах підшлункової залози фарбуванням дитіооксидом і люмокупфероном. Стресування мишей фі-зичним навантаженням, іммобілізацією, алкоголізацією, охолодженням викликало підвищення вмісту цинку та зменшення кількості міді в клітинах. Такі самі зміни вмісту металів у клітинах спостерігалися при введенні тваринам адреналіну та преднізолону. Отримані дані вказують на роль наднирників у регуляції клітинного метаболізму металів і фізіологічний антагонізм цинку та міді в клітинах.

Определение цинка и меди в клетках поджелудочной железе стрессированных мышей

При помощи цитохимических реакций 8- (п - толуолсульфониламино) - хинолина (8 - ТСХ) и альдегидфуксина в панкреатических клетках В определяли цинк и инсулин. Медь выявляли в клетках поджелудочной железы окраской дитиооксидом и люмокупфероном. Стрессрование мышей физической нагрузкой, иммобилизацией, алкоголизацией, охлаждением вызвало повышение содержания цинка и уменьшение количества меди в клетках. Такие же изменения содержания металлов в клетках наблюдались при введении животным адреналина и преднизолона. Полученные данные указывают на роль надпочечников в регуляции клеточного метаболизма металлов и физиологический антагонизм цинка и меди в клетках.

Введение

Цинк и медь выполняют в организме важные биологические функции [1-4, 6-8, 13, 17, 19, 24]. Они необходимы для активности ферментов [14-18, 21-27], регулируют проницаемость клеточных мембран [1, 12, 20]. Имеются данные об антагонизме меди и цинка в организме. Так, концентрация меди в крови повышается при цинкдефицитных состояниях, например, при стрессе, алкоголизме, заболеваниях органов пищеварения и мочевыделения и др. [1, 2]. Представляют интерес исследования на клеточно-молекулярном уровне. Для проведения таких исследований нами были использованы цитохимические реакции на цинк 8 - (п - толуолсульфониламино) - хинолина (8 - ТСХ) и на медь дитиооксамида (ДТО) и люмокупферона (ЛК) [5, 7, 8]. Материалом исследований служили поджелудочные железы мышей.

Материалы и методы

В опытах было использовано 109 мышей, в том числе 17 контрольных (интактных) животных, 52 мыши с физической нагрузкой, иммобилизацией, алкоголизацией, охлаждением, 40 животных, получивших адреналин, преднизолон, пилокарпин.

Для изучения влияния физической нагрузки мышей помещали в аквариум с температурой воды 32 ?C. Животные плавали в течение 1 часа [9]. Иммобилизировали животных привязыванием их при помощи мягких повязок к станку в положении на спине на 6 ч. Охлаждение организма мышей производили помещением их на 0,5 ч в холодную ванну с температурой воды 21 ?C [9]. Алкоголизировали животных введением через зонд в желудок 20 % раствора этанола в дозе 2 мл/кг.

Адреналин вводили животным подкожно в дозе 0,05 мг/кг, преднизолон - внутримышечно в количестве 5-10 мг/кг, пилокарпин - подкожно в дозе 1 мг/кг.

У животных при жизни брали кровь для определения уровня сахара в крови модифицированным методом Хаггедорна - Йенсена [6]. Забивали мышей декапитацией.

Для цитохимического определения металлов кусочки поджелудочной железы фиксировали в холодном (+4 ?С) ацетоне, проводили через ксилолы, смесь ксилола с парафином, жидкие (+56 ?С) парафины и заливали в парафин.

Срезы толщиной 5-10 мкм депарафинировали обработкой в ксилолах, ацетонах. Для выявления металлов срезы флуорохромировали в течение 1 мин 0,01 % ацетоновым раствором 8-ТСХ и ЛК, промывали дистиллированной водой, заключали в глицерин и рассматривали под люминесцентным микроскопом. Для возбуждения люминесценции применяли светофильтр ФС-1, в качестве защитного (окулярного) использовали светофильтр из стекла ЖС-18. На препаратах металлы выявляли по желто-зеленой люминесценции клеток поджелудочной железы.

При помощи окраски ДТО выявляли медь в клетках поджелудочной железы, используя световую микроскопию. Для приготовления красящего раствора ДТО готовили его 0,01 % раствор на 10 % растворе ацетата натрия. продолжительность окраски срезов - 24 ч. Затем срезы заключали в глицерин-желатин и рассматривали под микроскопом. На препаратах выявляли в цитоплазме клеток поджелудочной железы окраску грязно-зеленого цвета.

Для морфологического исследования и цитохимического определения инсулина кусочки поджелудочной железы фиксировали в течение 24 ч в жидкости Буэна (смеси нейтрального формалина, пикриновой кислоты и ледяной уксусной кислоты). Затем кусочки обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, выдерживали в ксилолах, смеси ксилола и парафина, жидких парафинах и заливали в парафин. Депарафинировали срезы выдерживанием их в ксилолах и спиртах понижающейся крепости, окислителе (смеси перманганата калия и серной кислоты), восстановителе (растворе щавелевой кислоты), промывали в воде. Для морфологического исследования срезы окрашивали гематоксилин-флоксином, а для выявления инсулина их окрашивали альдегидфуксином (АФ) [6]. В первом случае срезы заключали в бальзам, во втором - в глицерин-желатин. На препаратах, окрашенных гематоксилином, хорошо видна структура железы, а при окраске АФ в цитоплазме островковых клеток В выявлялась сине-фиолетовая зернистость - показатель содержания в клетках инсулина.

Интенсивность цитохимических реакций 8-ТСХ, ДТО, альдегидфуксина, ЛК оценивали по трехбалльной системе [10, 11]. За один балл принимали слабоположительную, два балла - умеренную, три балла - выраженную по интенсивности реакцию.

цинк медь поджелудочная железа

Результаты и обсуждение

При морфологическом исследовании не обнаружено структурных изменений в поджелудочной железе у стрессированных мышей. В табл. 1 приведены данные содержания сахара в крови, цинка, инсулина и меди в панкреатических клетках В у мышей при стрессе.

У контрольных (интактных) мышей уровень сахара в крови составлял 6,0 ± 0,23 ммоль/л, интенсивность цитохимической реакции 8-ТСХ в панкреатических клетках В была равна 2,0 ± 0,12, АФ - 1,3 ± 0,10 у. е. В клетках поджелудочной железы интенсивность цитохимической реакции ДТО составляла 0,4 ± 0,02, а реакции ЛК - 0,6 ± 0,03 у. е.

Уровень сахара в крови был повышен на 45 % (р < 0,001) при физической нагрузке, 18 % (р < 0,01) - иммобилизации, 40 % (р < 0,001) - алкоголизации, 20 % (р < 0,01) - охлаждении. Как видно, гликемия была повышена при всех стрессовых воздействиях.

Интенсивность цитохимической реакции 8-ТСХ в панкреатических клетках В была повышена соответственно на 30 % (р < 0,01), 25 % (р < 0,01), 36 % (р < 0,001), 25 % (р < 0,05). Эти данные указывают на достоверное повышение содержания цинка в клетках В островков при всех стрессовых воздействиях.

Интенсивность цитохимической реакции АФ в тех же клетках у стрессированных мышей была повышена на 31 - 38 % (р < 0,01 ? < 0,001). Эти данные указывают на накопление инсулина в клетках В островков при действии стрессовых факторов.

Интенсивность в поджелудочной железе цитохимической реакции ДТО была снижена на 50 % (р < 0,001) при физической нагрузке и иммобилизации, на 25 % (р < 0,01 ? < 0,001) - при алкоголизации и охлаждении. Приведенные данные указывают на снижение содержания меди в клетках поджелудочной железы при стрессовых воздействиях.

Интенсивность цитохимической реакции ЛК была снижена на 17 % (р < 0,01) при физической нагрузке, на 33 % (р < 0,001) - при иммобилизации и алкоголизации, на 17 % (р < 0,05) - при охлаждении. Эти данные также указывают на уменьшение концентрации меди в клетках.

Таким образом, стрессовые воздействия вне зависимости от вида фактора вызывают повышение гликемии, содержания цинка и инсулина в панкреатических клетках В, а также уменьшение количества меди в клетках поджелудочной железы.

Однотипность изменений содержания металлов позволяет их отнести к признакам неспецифического адаптационного синдрома. Поэтому можно думать, что эти изменения связаны с повышенной инкреторной функцией надпочечников. Для подтверждения такого предложения нами были проведены подобные исследования гликемии, цинка и меди в клетках при введении мышам адреналина, преднизолона и пилокарпина. Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Как видно из этой таблицы, гликемия была повышена на 113 % (р < 0,001) при введении адреналина, на 93 % (р < 0,001) - после инъекции преднизолона и была снижена на 43 % (р < 0,001) после введения пилокарпина. Эти данные указывают на то, что гормоны надпочечников повышают содержание сахара в крови.

Интенсивность цитохимической реакции 8-ТСХ в В-инсулоцитах была повышена на 30 % (р < 0,01) при введении адреналина, 25 % (р < 0,01) - после инъекции преднизолона и снижена на 35 % (р < 0,001) - после введения пилокарпина. Эти данные указывают на то, что гормоны надпочечников способны повышать содержание цинка в клетках В островков.

Аналогичные результаты были получены при постановке цитохимической реакции АФ. Интенсивность этой реакции была увеличена соответственно на 38 % (р < 0,01) и 31 % (р < 0,05) и уменьшена на 38 % (р < 0,001). Это значит, что гормоны надпочечников вызывают также накопление инсулина в панкреатических клетках В.

Интенсивность цитохимической реакции ДТО была снижена на 50 % (р < 0,001) при введении адреналина и на 25 % (р < 0,01) - после инъекции преднизолона. Пилокарпин вызывал, наоборот, повышение интенсивности реакции на 25 % (р < 0,01). Следовательно, гормоны надпочечников вызывают уменьшение количества меди в клетках поджелудочной железы.

Сходные результаты были получены при постановке цитохимической реакции ЛК. При введении адреналина интенсивность этой реакции была снижена на 50 % (р < 0,001), преднизолона - на 33 % (р < 0,001). В противоположность этому, пилокарпин вызывал повышение ЛК- реакции на 33 % (р < 0,001). Результаты таких исследований подкрепляют положение о снижении: содержания меди в клетках поджелудочной железы под влиянием гормонов надпочечников.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывают на то, что при стрессовых воздействиях повышение гликемии, содержания цинка и инсулина в панкреатических клетках В и снижение содержания меди в клетках поджелудочной железы связаны с усилением инкреторной функции надпочечников. Эти изменения могут быть отнесены к признакам неспецифического адаптационного синдрома [4, 9].

Выводы

1. Стрессовые факторы (физическая нагрузка, иммобилизация, алкоголизация, охлаждение) вызывают повышение гликемии и содержания цинка и инсулина в панкреатических клетках В. При действии этих факторов снижается содержание меди в данных клетках.

2. Адреналин, относящийся к группе катехоламинов, и преднизолон, обладающий глюкокортикоидной активностью, вызывают такие же изменения гликемии, содержания цинка и инсулина в панкреатических клетках В и меди в клетках поджелудочной железы, что и стрессовые воздействия на организм.

3. Результаты исследований указывают на антагонистические взаимоотношения между цинком и медью в клетках поджелудочной железы.

Литература

1. Авцын А. П., Жаворонков А. А., Строчкова Л. С. Микроэлементозы человека (этиология, классификация, органопатология). - М.: Медицина, 1991. - 496с.

2. Альберт А. Избирательная токсичность.- М.: Медицина, 1989. - 432 с.

3. Балаболкин М. И. Диабетология. - М.: Медицина, 2000. - 671с.

4. Браун А. Д., Моженок Т. П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. - Л.: Наука, 1987. - 232с.

5. Бутенко З. А., Глузман Д. Ф., Зак П. Н., Филатова Р. С., Шляховенко В. А. Цитохимия и электронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов. - Киев: Наукова думка, 1974. - 247с.

6. Гольдберг Е. Д., Ещенко В. А., Бовт В. Д. Сахарный диабет. Этиологические факторы. - Томск: Изд-во Томск. ун-та, 1993. - 136с.

7. Григорова Н. В. Вплив уведення цинку на його метаболізм у клітинах при дії екстремальних факторів // Вісник ЗДУ. - 2000. - № 1. - С.216-219.

8. Ещенко В. А. Гистохимическое исследование цинка // Цитология. - 1978. - Т.20, № 8. - С. 927-933.

9. Панин Л. Е. Биохимические механизмы стресса. - Новосибирск: Наука, 1983. - 233c.

10. Соколовский В. В. Гистохимические исследования в токсикологии.- Л.: Медицина, 1971. - 172c.

11. Хейхоу Ф. Г. Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. - М.: Медицина, 1983. - 320с.

12. Bray T. M., Bettger W. J. The physiological role of zinc as an antioxidant // Free Radic. Biol. Med. - 1990. - Vol.8. - P. 281 - 291.

13. Chausmer A. B. Zinc, insulin and diabetes // J. Am. Coll. Nutr. - 1998. - Vol.17, № 2. - P.109 - 115.

14. Gerken B. M., Wattenbach C., Linke D., Zorn H., Berger R. G., Parlar H. Tweezing adsorptive bubble separation. Analytical method for the selective and high enrichmeht of metalloenzymes // Anal. Chem. - 2005. - Vol.77, № 19. - P.6113 - 6117.

15. Harada T., Koyama I., Matsunaga T., Kikuno A., Kasahara T., Hassimoto M., Alpers D. H., Komoda T. Characterization of structural and catalytic differences in rat intestinal alkaline phosphatase isozymes // FEBS J. - 2005. - Vol. 272, № 10. - P. 2477 - 2486.

16. Kierat R. M., Kramer R. A fluorogenic and chromogenic probe that detects the esterase activity of trace copper (II) // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2005. - Vol.15, № 21. - P.4824-4827.

17. Kuru O., Sentьrk U. K., Gьnduz F., Aktekin B., Aktekin M. R. Effect of long-term swimming exercise on zinc, magnesium and copper distribution in aged rats // Biol. Trace Elem. Res. - 2003. - Vol.93, № 1. - P.105 - 112.

18. Lianghua T., Liming X. Purification and partial characterization of a lipase from Bacillus coagaluns ZIU 318 // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2005. - Vol.125, № 2. - P.139-146.

19. Nieves J. W. Osteroporosis: the role of micronutrients // Am. J. Clin. Nutr. - 2005. - Vol.81, № 5. - P. 1232 - 1239.

20. Pelmenschikov V., Sieghahn P. E. Copper-zinc superoxide dismutase: theoretical insights on the catalytic mechanism // Inorg. Chem. - 2005. - Vol.44, № 9. - P.3311-3320.

21. Picaud S., Olofsson L., Brodelius M., Brodelius P. E. Expression, purification and characterization of recombinant amorpha - 4, 11-diene synthase from Artemisia annua L. // Arch. Biochem. Biophys. - 2005. - Vol.436, № 2. - P.215-226.

22. Shin S., Lee H. S., Kwon S. T., Kwak S. S. Molecular characterization of a CDNA encoding copper / zinc superoxide dismutase from cultured cells of Manihot esculenta // Plant Physiol. Biochem. -2005. - Vol.43, № 1. - P.55-60.

23. Story S. V., Shah C., Jenney F. E. I., Adams M. W. Characterization of a novel zinc - containing, lysine - specific aminopeptidase from the hypertermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // J. Bacteriol. - 2005. - Vol. 187, № 6. - P. 2077 - 2083.

24. Vallee B. L. Zinc: biochemistry, physiology, toxicology and clinical patho-logy // Biofactors. - 1988. - Vol.1, № 1. - P.31 - 36.

25. Vallee B. L., Auld D. S. Zinc coordination, function and structure of zinc enzymes and other proteins // Biochemistry. - 1990.-Vol.29, № 24. - P.5647-5659.

26. Webby C. I., Patchett M. L., Parker E. I. Characterization of a recombinant type II 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Helicobacter pylori // Biochem. I. - 2005.-Vol.390, № 1. - P.223-230.

27. Williams R. J. Metallo-enzyme catalysis // Chem. Commun.(Camb.). - 2003. - № 10. - P.1109 - 1113.

Приложение

Таблица 1.

Гликемия, интенсивность цитохимических реакций 8-ТСХ и АФ в В-инсулоцитах, а также ДТО и ЛК в клетках поджелудочной железы у стрессированных мышей (± m)

Таблица 2.

Гликемия, интенсивность цитохимических реакций 8-ТСХ и АФ в В-инсулоцитах, а также ДТО и ЛК в клетках поджелудочной железы у мышей, получивших адреналин, преднизолон, пилокарпин (± m)

Размещено на Allbest.ru