Размещено на http://www.allbest.ru/

Московский Госудаственный Университет

им. М.В. Ломоносова.

Факультет Биоинженерии и Биоинформатики.

Анализ видоспецифичных генов Bacillus subtilis

Тютор: Меркеев Игорь Валентинович

Супервайзер: Миронов Андрей Александрович

Работа студента второго курса

Панчина Александра Юрьевича

Москва 2004

Для подсчета числа ВГ в геноме Bacillus subtilis изначально использовалась TOG-процедура [0]. TOG-процедура заключается в том, что для двух близких видов находят все такие гены, которые относительно друг друга имеют наибольшее сходство. Такую пару называют BBH (bilateral best hit). Эту пару, а также паралогов (паралогами называют такие гены одного организма, которые больше похожи друг на друга, чем один из них на свою пару по BBH, если таковая имеется) этих генов объединяют в ортологическую группу или TOG (Tree-based ortologous group, см. картинку ниже). Такую процедуру проводят с несколькими близкими видами. Те белки, которые не вошли ни в одну ортологическую группу, стали претендентами на звание видоспецифичных генов. Более точный подсчет числа ВГ шел с использованием программы Blastp (база данных NR, порог поиска е-04), однако в данной работе проверялась только случайно отобранная пятая часть претендентов (200 белков). Отдельное внимание уделялось тем аминокислотным последовательностям, которые из-за ошибок, допущенных в ходе TOG-процедуры, не попали в ортологические группы (хотя должны были попасть). На основе результатов проверки числа ВГ с помощью Blastp аппроксимировалось количество ВГ методом экстраполяции по длине. Этот метод заключается в том, что все белки претенденты разбиваются на 4 группы в зависимости от их длинны: <101, 101-200, 201-400, >400. Для проверенных двухсот белков рассчитывается процент ВГ в каждой группе, и этот результат умножается на суммарное число белков в данной группе среди всех претендентов. Сумма ВГ по всем группам дает суммарное количество ВГ в геноме Bacillus subtilis. Следует отметить, что в ходе TOG-процедуры не один ВГ не должен был попасть в ортологическую группу и, следовательно, не должен был отсеяться.

В ходе работы сравнивался средний аминокислотный состав белков ВГ и белков Bacillus subtilis, которые имеют ортологов у других видов. Средний аминокислотный состав белков ВГ также сравнивался со средним аминокислотным составом белков, полученных из случайного генома, имеющего нуклеотидный состав такой же, как и у Bacillus subtilis.

С помощью программы TMHMM (9) пакета Expasy Tools были получены данные по наличию трансмембранных доменов у пяти групп белков: соответствующих реальным ВГ, соответствующих реальным не видоспецифичным генам, случайные белки (полученные программой RandSeq пакета Expasy tools), имеющий тот же аминокислотный состав, что и 2 предыдущие группы, а также белки, амнокислотный состав которых такой же как у белка, ген которого был создан случайным образом на основе нуклеотидного состава генома Bacillus subtilis.

Ниже приведена картинка с изображением дерева дупликации гена, создающееся для TOG-процедуры. N1, N2, N3 - узлы, в которых произошла дупликацмя гена. Гены A3 и A5 являютя ортологами относительно узла ветвления N3, но паралогами относительно узла N2. В ходе TOG процедуры, начиная с листьев дерева, гены объединяются в ортологические группы относительно данного узла дерева. На каждом узле ортологическая группа представлена консенсусной последовательностью, полученнной в ходе множественного выравнивания генов этой группы. Таким образом, в каждом узле дерева образуется “супергеном”. Те гены, которые на самом верхнем узле дерева (в примере это узел N1) не нашли себе пары, считались притендентами на видоспецифичные гены. Глядя на дерево можно заметить, что эволюционное расстояние между паралогами меньше эволюционного расстояния между ортологами.

Результаты

В результате TOG-процедуры 1010 белков (примерно 25% от общего числа белков Bacillus subtilis) не попали ни в одну ортологическую группу и стали претендентами на звание видоспецифичных белков. 200 из полученных претендентов были сравнены с последовательностями из базы данных NR в NCBI через программу Blastp (порог поиска е-04).

Результаты проверки 200 белков представлены в таблице 1.

В колонке "protein name" указаны названия белков.

В колонке "size (aminoacids)" указаны размеры данного белка (число аминокислот).

В колонке "search results" указаны результаты поис ка. (“Orphan” означает, что данный белок кодируется ВГ. "No significent similarity found" означает, что в базе данных нет ничего похожего на данный белок. В остальных случаях в этой колонке указывается название одного из организмов, у которого был найден похожий белок.)

B колонке “e-value” приведены e-value, с которым у соответствующего организма из предыдущей колонки был найден похожий белок.

В ходе анализа результатов были установлено следующее:

1.) Для 63 белков (31.5% из изучаемых) были найдены похожие белки среди организмов, относящихся к исходной выборке. Это и есть результаты ошибок в ходе TOG-процедуры. В таблице эти случаи отмечены *.

На данный момент 75 (37.5%) среди двухсот изученных белков можно считать видоспецифичными.

5 белков оказались не похожими ни на что в базе данных, включая белки Bacillus subtilis.

По результатам анализа в геноме Bacillus subtilis 10.9% ВГ.

Таблица 1.

Результаты поиска похожих белков.

Изученные белки были рассортированы по размеру, и был рассчитан процент белков, кодирумых ВГ среди первых 78 белков (число аминокислот от 20 до 145) и последующих 122 (число аминокислот от 148 до 1289). Среди коротких белков таких получилось примерно 68% , а среди более длинных около 18%. В выборке по этому принципу результаты отличаются почти в 4 раза. Можно предположить, что среди более мелких белков больше артефактов (соответствующие ORF не кодируют белкового продукта или РНК). Также примерно 17% из первых 78 белков и 41% из остальных более крупных белков имеют сходство с белками организмов, геномы которых использовались в TOG-процедуре. Выборки по данному признаку отличаются примерно в 2.5 раза. Это означает, что TOG-процедура чаще ошибается при работе с крупными белками.

В ходе исследований находились белки не похожие ни на один белок в базе данных, включая белки из генома Bacillus subtilis. Можно предположить, что это белки, которые были удалены из базы данных по причине их неправильной аннотации. Такие белки обладают небольшими размерами (до 67 аминокислот). Были подсчитаны аминокислотные составы четырех групп белков (результаты представлены в таблице 2). Первая группа - не видоспецифичные белки. Это белки, имеющие хорошее сходство с белками из организмов отличных от Bacillus subtilis. Вторая группа белков - видоспецифичные. Это белки, не имеющие сходства с белками из организмов отличных от Bacillus subtilis. Третья группа - белки смоделированного генома, имеющего нуклеотидный состав генома Bacillus subtils, но случайно-сгенерированные последовательности. Последняя группа - протеом Bacillus subtilis.

видоспецифичный геном белок аминокислота

Таблица 2.

Аминокислотный состав различных групп белков.

Сравнивая эти аминокислотные составы, можно сделать следующие наблюдения:

1.) По содержанию большинства аминокислот видоспецифичные белки не занимают промежуточного положения между группой не видоспецифичных белков и белков соответсвующих генам смоделированного генома.

2.) Аминокислотный состав видоспецифичных белков меньше похож на суммарный состав протеома, чем состав не видоспецифичных белков.

3.) Можно заметить, что группа видоспецифичных белков содержит больший процент гидрофобных аминокислот. Видоспецифичные белки в среднем сильно гидрофобнее других групп белков, что видно из таблицы 3. В колонке “Показатель гидрофобности” эти значения были подсчитаны , как равные сумме по всем аминокислотам произведения процента содержания данной аминокислоты в выборке на ее показатель гидрофобности.

С помощью программы TMHMM пакета Expasy Tools было подсчитано число трансмембранных доменов в каждой из пяти групп белков, представленных в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты анализа пяти групп белков.

* Белки, полученные с помощью программы RandSeq пакета Expasy Tools, имеющие аминокислотный состав такой же, как в одной из соответствующих групп, но со случайной последовательностью.

** Белки, полученные за счет применения программы RandSeq к аминокислотному составу белков, смоделированного генома (имеющего нуклеотидный состав такой же, как и геном Bacillus subtilis).

Количество предсказанных трансмембранных доменов нормировано на суммарную длинну белков в 300 аминокислот. Показатель гидрофобности подсчитывался, как сумма произведений процента каждой аминокислоты на значение ее гидрофобности. Чем выше этот показатель, тем белок гидрофобней.

Реальные видоспецифичные белки - белки с пометкой orphan, взятые из таблицы 1. Это аннотированные белки Bacillus subtilis, не похожие на белки других организмов.

Реальные невидоспецифичные белки - белки взятые из таблицы 1, имеющие хорошее сходство с белками других организмов.

Исходя из результатов взятых из таблице 3, можно сделать следующие выводы:

1.) Вероятность случайного возникновения трансмембранного домена очень мала.

2.) Среди реальных видоспецифичных и не видоспецифичных белков транмембранных доменов встречается намного больше, чем среди случайно-сгенерированных.

3.) Трансмембранных доменов в видоспецифичных белках больше, чем в не видоспецифичных.

Отдельно можно отметить, что процент трансмембранных белков среди видоспецифичных белков очень высок : 45% имеют один и более трансмембранных доменов, тогда как для всего протеома эта цифра близка к 24% (9).

Обсуждение результатов

Результаты, полученные в данной работе свидетельствуют о том, что TOG-процедура может успешно применяться для поиска ВГ.

Результаты аппроксимации процента ВГ в Bacillus subtilis, составлющие 10.9%, довольно близки к 12.7% - средним для прокариот по исправленным результам из статьи [2], что представляется вполне логичным. Можно заметить, что процент ВГ наибольший среди коротких фрагментов. Это можно объяснить тем, что короткие открытые рамки считывания часто возникают случайно и нередко представляют из себя некодирующую часть ДНК. Такие рамки считывания могут являться артефактами, возникшими из-за неправильной аннотации генов. Действительно, 5 коротких аминокислотных последовательностей из проверенных были удалены из базы данных, что подтверждает сказанное выше.

Исходя из предположения, что среди ВГ большой процент артефактных генов, мы предложили гипотезу, что аминокислотный состав видоспецифичных белков будет чем-то средним между аминокислотным составом смоделированного генома и аминокислотным составом невидоспецифичных белков (которые вероятнее всего действительно синтезируются в организме и участвуют в метаболизме). Однако, судя по результатам сравнения аминокислотых составов, приведенных в таблице 2, это предположение было ошибочным. В действительности процент содержания лишь 8ми аминокилот в видоспецифичных белках занимает промежуточное значение между процентом ее содержания в двух других групп. Более того, судя по результатам подсчета числа трансмембранных доменов, приведенных в таблице 3, можно сказать, что в целом видоспецефичные белки менее “случайны”, чем невидоспецифичные. Принимая во внимание то, что вероятность случайного возникновения трансмембранного домена в результате серии мутаций очень низка (не более 15 доменов на 10000 аминокислотных остатков), тот факт, что среди видоспецифичных генов их больше всего свидетельствует против гипотезы их случайного возникновения.

Высокая гидрофобность группы видоспецифичных белков объясняется наличием у них большого числа трансмембранных доменов, скорее, чем наоборот.

Еще одно объяснение большого числа трансмембранных доменов у видоспецифичных белков состоит в том, что использованная нами программа по поиску гомологичных белков (BLASTP) не достаточно хорошо приспособлена для поиска сходства белков с трансмембранными доменами. Возможно многие из “видоспецифичных белков” на самом деле таковыми не являются, а просто их сходство с другими белками плохо узнается поисковой программой.

Ранее было сказано, что существенную погрешность в точность подсчета ВГ в геноме вносят неполнота базы данных и наличие в ней неправильных аннотаций. В связи с тем, что недавно был опубликован проект массового сиквенирования ДНК микроорганизмов из саргасового моря [8], вследствии чего с момента проведенной проверки белков на видоспецифичность число последовательностей в базе данных NCBI возросло почти в два раза, имеет смысл сравнить последовательности ВГ с последовательностями из некультивированных организмов из природных источников (Environmental Samples).

Это может привести к отсеву некоторых ВГ, а также может подтвердить правильность аннотации некоторых ВГ, которые найдут очень близких гомологов, возможно из других штаммов Bacillus subtilis. Предварительная проверка уже была проведена и по ее результатам, действительно, для некоторых ВГ были найдены похожие последовательности, однако эта задача не являлась существенной и не была выполнена до концa.

На основе проведенной работы можно сделать следубщие выводы: число ВГ в геномaх различных организмов довольно существенно. Характерными свойсвами кодируемых ими белков являются их довольно короткая длина, относительно высокая гидрофобность и завышенные показатели по числу содержащихся в них трансмембранных доменов.

В среднем эта группа белков довольно сильно отличается от группы не видоспецифичных белков, однако нет веских аргументов в пользу того, что эти различия связаны с наличием среди первых существенного числа ложных белков. Видоспецичные белки представляют из себя интересную группу белков, заслуживающую более тщательного и глубокого изучения.

Список использованной литературы

I. V. Merkeev, P. S. Novichkov, A. A. Mironov. TOGs vs COGs: a Database of Supergenomes Built from Proteome Complements. (unpublished).

J. Alimi, O. Poirot, F. Lopez, J. Claverie. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction Validation of 25 "Orphan" Genes from Escherichia coli K-12 MG1655. Genome Research,Vol.10, 959-966, 2000.

S. Fukuchi, K. Nishikawa. Estimation of the number of Orphan Genes in the Genome Sequences. Genome informatics 14:468-469, 2003.

A. J. Simpson et all. The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Nature, 151-157, 2000.

J. F. Heidelberg, J. A. Eisen, W. C. Nelson. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathoge Vibrio Cholerae. Nature, 477-485, 2000.

The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 791-826, 2000.

R. H. Waterston et all. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature, 509-573, 2002.