Механизмы и роль атерогенной модификации липопротеидов в атерогенезе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Механизмы и роль атерогенной модификации липопротеидов в атерогенезе

14.03.03- патологическая физиология

Мельниченко Александра

МОСКВА - 2013

Работа выполнена в лаборатории клеточных механизмов атерогенеза отдела молекулярной и клеточной патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Научный консультант:

Бобрышев Юрий Вениаминович

Доктор биологических наук

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Ведущий научный сотрудник лаборатории клеточных механизмов атерогенеза отдела молекулярной и клеточной патофизиологии

Официальные оппоненты:

Кухарчук Валерий Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической кардиологии имени А.Л. Мясникова, Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Руководитель отдела проблем атеросклероза

Манухина Евгения Борисовна

Доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Главный научный сотрудник группы регуляторных механизмов адаптации атеросклероз липопротеид артериальный

Архипенко Юрий Владимирович

Доктор биологических наук, профессор

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

заведующий лабораторией адаптационной медицины

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Сердечно-сосудистые заболевания стоят на первом месте в качестве причины смерти в России, США и Европе (Windecker S., 2013; Quarles L.D., 2013). Подавляющая часть сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных сосудов (Pranavchand R., 2013). Еще в 1947 году Н. Н. Аничковым было продемонстровано, что накопление холестерина в интиме артерий является одним из первых проявлений атеросклероза (Аничков Н.Н., 1947; Cianciola N.L., 2011). Транспорт холестерина в организме осуществляется липопротеидами. Источником липидов в интиме сосудов являются липопротеиды низкой плотности (ЛНП) (Vukovic I., 2006; Alaupovic, 1971 P.; Cookson F.B., 1971). Нативные ЛНП (нЛНП), выделенные из крови здоровых людей, не вызвают накопления липидов в культуре клеток (Badimуn L., 2009). С другой стороны, многими исследователями (Soran H., 2011; Orsу E., 2011) было показано, что почти любая модификация (окисление, дегликозилирование, вортексирование, протеолиз, липолиз и др.) нЛНП приводит к их усиленному захвату как субэндотелиальными, так и другими видами клеток.

Возникает вопрос, почему столь различные изменения в ЛНП приводят к одному и тому же эффекту - внутриклеточному накоплениию липидов. При изучении внутриклеточного накопления холестерина, вызванного ЛНП, модифицированными нейраминидазой, липолитическими, протеолитическими ферментами в нашей лаборатории (Orekhov A.N., 1989; Sobenin I.A., 1996; Tertov V.V., 1998) было показано, что все эти модификации приводят к самоассоциации ЛНП. Также было продемонстрировано, что именно ассоциаты модифицированных ЛНП обладают атерогенными свойствами, то есть вызывают накопление холестерина в клетках. Другими исследователями также были получены аналогичные данные о том, что интенсивное встряхивание или вортексирование (Walters M.J., 2010), окисление медью и железом (Satchell L., 2012; Saputri F.C., 2012), обработка гипохлоритом (Guha M., 2010), миелопероксидазой (Панасенко О.М., 2004), фосфолипазой А2 (Yamamoto K., 2011), сфингомиелиназой (Sneck M., 2012), протеазами (Piha M., 1995), гликозидазами (Панасенко О.М., 2006) приводит к самоассоциации ЛНП и их последующему внутриклеточному накоплению.

В крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями не были обнаружены ЛНП, совпадающие по строению с модифицированными in vitro. Нашей группой были выделены из крови и изучены циркулирующие множествено-модифицированные ЛНП (цммЛНП) (Orekhov A.N. et al., 1989; Tertov V.V. et al., 1990), которые характеризовались пониженным содержанием сиаловой кислоты, маннозы и других сахаров. Эти же частицы были обнаружены другими исследователями - так называемые мелкие, плотные ЛНП (La Belle M. et al., 1990; Avogaro P. et al., 1991) и электроотрицательные (Avogaro P. et al., 1988) ЛНП. Циркулирующие в крови модифицированные ЛНП, как и модифицированные in vitro ЛНП обладали двумя общими свойствами: вызывали внутриклеточное накопление липидов и обладали склонностью к самоассоциации. При этом было показано, что существует прямая зависимость между размером ассоциатов и их атерогенными свойствами (Orekhov A.N. et al., 1991 а; Tertov V.V. et al., 1990; Tertov V.V. et al., 1992).

Однако оставались не вполне понятными механизмы атерогенной модификации ЛНП и её роль в атерогенезе. Оставались без ответа и другие вопросы. Каков механизм ассоциации ЛНП? Можно ли повлиять на этот процесс?

Известно, что ЛНП способны не только к самоассоциации, но и к ассоциации с компонентами внеклеточного матрикса (Soto Y, 2012) и образованию циркулирующих иммунных комплексов (Lopes-Virella M.F., 2013; Tertov V.V., 1996). Но как сам процесс ассоциации, так и атерогенные свойства ассоциатов изучены недостаточно. Циркулирующие иммунные комплексы могут служить маркерами предрасположенности к инфаркту миокарда (Lopes-Virella M.F., и др., 2012), но неизвестно, насколько велика прогностическая и диагностическая роль этого параметра. Не разработаны тест-системы для оценки атерогенного потенциала крови больного на основе измерения показателей атерогенной модификации ЛНП, которые могли бы применяться в клинической практике.

Цель настоящей работы

Целью настоящей работы явилось углублённое изучение механизмов атерогенной модификации липопротеидов низкой плотности (ЛНП), циркулирующих в крови пациентов; исследование роли этой модификации в атерогенезе; разработка на основе накопленных знаний инновационных подходов к диагностике и терапии атеросклероза, в том числе:

- способов диагностики бессимптомного атеросклероза на основе принципиально новых атерогенных показателей,

- средств, имеющих антиатеросклеротический терапевтический потенциал, проявляющийся в предотвращению самоассоциации ЛНП, которая ведёт к инициации атеросклероза на уровне клеток сосудистой стенки.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

Основные задачи исследования:

с помощью морфологических методов изучить локализацию липидов в начальных атеросклеротических поражениях;

исследовать механизмы устойчивости к ассоциации циркулирующих в крови человека множественно модифицированных ЛНП;

разработать клеточную модель липоидоза для изучения клеточных проявлений атеросклероза и оценки атерогенности компонентов крови;

изучить роль самоассоциации ЛНП в усилении атерогенного потенциала липопротеидов;

найти эффективные ингибиторы ассоциации ЛНП и накопления ассоциатов в артериальных клетках;

оценить диагностическую и прогностическую значимость таких показателей атерогенности липопротеидов, как уровень цммЛНП в крови и уровень холестерина в циркулирующих иммунных комплексах, создать на их основе диагноститческую тест-систему.

Научная новизна

Разработана новая клеточная модель на основе макрофагов моноцитарного происхождения, выделенных из крови человека. Данная модель, проще, доступнее и экономичнее используемой ранее клеточной модели на основе субэндотелиальных клеток аорты человека. Результаты экспериментов, проведённых на разработанной модели, аналогичны результатам, полученным на культивируемых субэндотелиальных клетках. Показано, что для изучения атерогенеза на клеточном уровне и оценки атерогенного потенциала ЛНП данная модель является информативной и адекватной.

Продемонстрировано, что липопротеиды низкой плотности образуют крупные нерастворимые комплексы (ассоциаты). Изучено три варианта ассоциации - самоассоциация ЛНП, ассоциация с компонентами внеклеточого матрикса и образование циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), содержащих цммЛНП. Во всех трех случаях образуются ассоциаты, которые стимулируют захват липопротеидов клетками и подавляют деградацию липидов цммЛНП, и, тем самым, вызывают накопление внутриклеточных липидов, то есть усиливают атерогенный потенциал цммЛНП.

Исследованы возможности модуляции самоассоциации ЛНП. Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностью останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.

В новых экспериментальных условиях подтверждены ранее полученные данные о том, что иммунные комплексы, состоящие из модифицированных ЛНП и аутоантител против модифицированных ЛНП, обладают высоким атерогенным потенциалом на уровне артериальных клеток. Разработаны оптимизированные методики для определения в крови уровня цммЛНП и холестерина ЦИК (Х-ЦИК), которые являются маркерами развития атеросклероза. Выявлена диагностическая значимость в отношении раннего атеросклероза двух параметров: уровня цммЛНП и Х-ЦИК. Проведено сравнение данных параметров. Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.

Теоретическая и практическая значимость

Впервые установлена прогностическая значимость ЛНП-содержащих ЦИК, определяемых по уровню Х-ЦИК, в отношении прогрессирования раннего атеросклероза. По диагностической и прогностической значимости цммЛНП и Х-ЦИК значительно превосходят широко применяемые для диагностики атеросклеротических болезней показатели липидного обмена.

Выявлены амфифильные полимеры (полаксамеры), которые в зависимости от их гидрофобных свойств влияют на самопроизвольную ассоциацию ЛНП. Показано, что полаксамеры с большей гидрофобностью останавливают процесс ассоциации ЛНП, но не вызывают диссоциацию образовавшихся комплексов. Эти вещества можно рассматривать как перспективные агенты с точки зрения прямой антиатеросклеротической терапии.

В результате проведенной работы было продемонстрировано, что уровень Х-ЦИК коррелирует со степенью выраженности и распространенностью атеросклеротических поражений и обладает высокой диагностической и прогностической значимостью. Разработан макет аналитической тест-системы (мАТС) для одновременного определения контролируемых специфических биомаркеров, в частности, Х-ЦИК, общего холестерина, холестерина ЛНП и ЛВП, а также триглицеридов. Созданный мАТС предназначен для применения в практической медицине в целях экспрессной диагностики сердечно-сосудистых патологий.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На начальных стадиях атерогенеза существенная часть липидов накапливается в клетках сосудистой стенки, а не только вне клеток, и инициация атерогенеза сопровождается накоплением внутриклеточных липидов (клеточным липоидозом).

2. Для воспроизведения клеточного липоидоза - ключевого процесса атерогенеза на клеточном уровне - разработана модель на основе первичной культуры моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Разработанная клеточная модель адекватна задачам изучения механизмов липоидоза и может быть использована для оценки атерогенного потенциала плазмы (сыворотки) крови, липидных и нелипидных компонентов крови.

3. На разработанной клеточной модели липоидоза показано, что ассоциация ЛНП усиливает атерогенный потенциал липопротеидов, стимулируя захват ЛНП макрофагами.

4. Самоассоциация ЛНП подавляется амфифильными блок-сополимерами окиси пропилена и окиси этилена, так называемыми полаксамерами. Способность полаксамеров ингибировать ассоциацию зависит от гидрофильно-липофильного баланса и критической концентрации мицеллообразования, что свидетельствует об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в ассоциации ЛНП.

5. Результаты клинического исследования бессимптомного атеросклероза позволили установить, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов и уровень цммЛНП в сыворотке, являющиеся маркерами атеросклероза, обладают высокой диагностической значимостью.

6. Результаты клинического исследования показали, что уровень холестерина циркулирующих иммунных комплексов имеет высокую прогностическую значимость для оценки развития бессимптомного атеросклероза

Реализация результатов работы

Материалы диссертации были представлены в виде докладов и тезисов докладов на следующих научных мероприятиях: 78th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Hamburg, Germany, June 20-23, 2010; 79th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Gothenburg, Sweden, 26-29 June, 2011; 80th European Atherosclerosis Society Congress (EAS), Milan, Italy, May 25 -28 , 2012; Arteriosclerosis, Thromdosis and Vascular Biology. 2011 Scientific Sessions. April 28-30, 2011, Chicago, Illinois; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology Scientific Sessions 2013. May 1-3, 2013, Lake Buena Vista, Florida.

На основе полученных в работе данных зарегистрирован 1 патент: Орехов АН, Собенин ИА, Кириченко ТВ, Мясоедова ВА, Мельниченко АА, Орехова ВА. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент на изобретение № 2455016 от 07 октября 2012 г.

На основе полученных в работе данных зарегистрированы 9 патентных заявок, представленных в списке опубликованных работ по теме диссертации.

На основе результатов проведённых исследований разработан лабораторный регламент макета аналитической тест-системы для применения в медицине при экспрессной диагностике атерогенных дислипидемий при сердечно сосудистых патологиях.

Работа апробирована 25 сентября 2013 года в ФГБУ “НИИ ОПП” РАМН на межлабораторной конференции с участием лаборатории клеточных механизмов атерогенеза, лаборатории молекулярной физиологии, лаборатории регуляции репаративных процессов, лаборатории общей патологии микроциркуляции.

Личный вклад автора.

Автор принимала непосредственное участие в получении исходных данных и их обработке, представляла полученные результаты на международных конференциях, принимала активное участие в подготовке публикаций по выполненной работе. К защите представлены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей.

Публикации по теме диссертации.

По результатам исследований опубликовано 29 научных работ, в том числе 9 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях, 6 статей в научно-практических рецензируемых сборниках и 11 статей в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, одна глава в книге и две монографии.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 252 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Библиографический список использованной литературы содержит 213 источников, в том числе 13 отечественных и 200 иностранных. Текст иллюстрирован 50 рисунками и 12 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аутопсийный материал

Грудную аорту человека извлекали через 1.5--3 ч после внезапной смерти у 7 мужчин в возрасте 30--60 лет. Сосуды вскрывали продольно и промывали изотоническим фосфатным буферным раствором (ИФБ). Внешне непораженные участки и участки с атеросклеротическими изменениями обнаруживали макроскопически согласно классификации Совета по атеросклерозу Американской ассоциации сердца (Velican C, 1978). Макроскопически непораженные участки имели гладкую поверхность просвета. Микроскопически они классифицировались как интимальное утолщение с двумя структурированными субслоями: протеогликановым слоем и мышечно-эластическим слоем. После макроскопической идентификации участки образцов размером 5Ч10 мм2 вырезали перпендикулярно длинной оси сосуда. Нефиксированные образцы погружали в OCT compound (Miles Inc., Elkhart, IN, США), замораживали в жидком азоте и готовили криостатные срезы толщиной 5 мкм.

Гистохимическое выявление липидов

Для гистохимического выявления липидов масляным красным О срезы фиксировали 4%-ным формальдегидом в течение 4 мин, а затем окрашивали (Pearse, 1969).

Исследование посредством трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ)

Из различных зон каждой исследуемого тканевого образца сосудов вырезали, как правило, по 4-5 1 мм3 кусочков, которые фиксировали в 1- 2,5%. глутаровом альдегиде, на фосфатном буфере (РН 7,2). Затем тканевые образцы постфиксировали в 1% OsO4, как правило, на том же буфере, проводили через спирты возрастающей концентрации, окись пропилена (или ацетон) и заливали в аралдит, Ультратонкие срезы получали на ультрамикротомах LКВ-111. Ультратонкие срезы обрабатывали цитратом свинца и уранилацетатом, а затем изучали под электронным микроскопом Hitachi H7000.

Электронно-микроскопический гистохимический анализ.

Визуализацию нейтральных липидов выполняли, используя OsO4, (Guyton JR, 1988). Идентификацию неэтерифицированного холестерина проводили с использованием филипина по описанному протоколу (Kruth, 1984). В ряде опытов окрашивание филипином комбинировали с обработкой образцов OsO4 для визуализации нейтральных липидов. Далее образцы заключали в аралдит согласно рутинному протоколу. Ультратонкие срезы изучали с помощью электронного микроскопа Hitachi H7000.

Хроматографическое определение липидов на криостатном срезе

Для хроматографического определения липидов на криостатном срезе интимальный слой отделяли от медии под бинокулярным контролем с помощью микродиссекционного пинцета. Фосфолипиды, триглицериды, холестерин и эфиры холестерина разделяли тонкослойной хроматографией на силикагеле с последующим количественным измерением (Mukhin et al., 1991).

Первичная культура субэндотелиальных клеток аорты человека

Выделение и культивирование клеток производили из грудного отдела аорт мужчин и женщин в возрасте 40-65 лет в течение 1.5-3 часов после внезапной смерти. Причиной смерти в подавляющем большинстве случаев была острая сердечно-сосудистая недостаточность. Субэндотелиальные клетки выделяли из различных участков интимы аорты, различавшихся по степени атеросклеротического поражения, путем обработки коллагеназой и культивировали в соответствии с методом Орехова и соавторов (Orekhov A. N., 1987). Обработку аутопсийного материала проводили в стерильных условиях. После механического удаления адвентиции аорту рассекали вдоль и промывали в среде 199, содержащей по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина и 2,5 мкг/мл фунгизона. Из лоскута аорты вырезали участки, не пораженные атеросклерозом, а также участки, соответствующие жировой полосе или липофиброзной бляшке, в соответствии с классификацией Stary (693,694,696). Затем с помощью пинцетов интиму отделяли от медии, при этом разделение слоев происходило по внутренней пограничной эластической мембране (548). Полученный материал пинцетами разделяли на волокна. К измельченной интиме добавляли 0,15% раствор коллагеназы II типа (Worthington Diagnostic System, США) в среде 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Flow, Великобритания), 2 мМ L-глутамин, 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл фунгизона (все реактивы Grand Island Biological Company - GIBCO, США) из расчета 10 мл раствора фермента на 1 г сырой ткани. Инкубацию интимы с коллагеназой проводили на водяной бане при 37єС с постоянным перемешиванием со скоростью 50 об/мин (Aquaterm, New Brunswick Scientific Company, США) до практически полного растворения ткани, что обычно занимало 2-3 часа. Эффективность растворения ткани оценивали визуально. Полученную суспензию клеток фильтровали через стерильную нейлоновую сетку и центрифугировали при 4єС в течение 20 мин при 1800 g на низкоскоростной центрифуге (Beckman TJ-6, Beckman Division, США). Осажденные клетки промывали в 10 мл ростовой среды 199, содержащей антибиотики и 10% эмбриональную телячью сыворотку, и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в 10 мл ростовой среды и производили подсчет полученного количества клеток в счетной камере. Клетки рассаживали в пластиковый стерильный 96-гнездный микротест для тканевых культур (Nunclon, Дания) из расчета 2-4х104 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки культивировали при 37єС в насыщенной водяными парами атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа в увлажняемом СО2-инкубаторе (Forma Scientific, США). Смену среды проводили через день. Для экспериментов использовали 7-10-дневную первичную культуру клеток. Такая культура представляет собой смешанную клеточную популяцию, состоящую преимущественно из типичных и модифицированных гладкомышечных клеток (13,14,548). Клетки, полученные из непораженных и атеросклеротических участков интимы аорты человека, культивировали раздельно и использовали в экспериментах различных типов, что позволяло в дальнейшем использовать две клеточных модели, различающихся по своим свойствам. Первичную культуру клеток, выделенных из непораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для воспроизведения процессов атерогенеза на клеточном уровне и оценки антиатерогенных свойств исследуемых веществ. Антиатерогенным действием называли эффекты, препятствующие основным проявлениям атерогенеза на клеточном уровне, и, прежде всего, накоплению внутриклеточного холестерина. Первичную культуру клеток, выделенных из пораженных атеросклерозом участков интимы аорты, использовали для оценки антиатеросклеротических свойств исследуемых веществ. Антиатеросклеротическим действием называли эффекты, проявляющиеся в уменьшении содержания внутриклеточного холестерина по сравнению с исходным уровнем.

Культура моноцитов-макрофагов крови человека

Моноциты крови человека выделяли из крови здоровых добровольцев и культивировали до их созревания в макрофаги. Из локтевой вены здорового донора утром натощак брали 50 мл крови в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл стерильного 3,8% цитрата натрия в 0,15 М изотоническом фосфатном буфере (ИФБ) (рН=7,35). Кровь центрифугировали в течение 20 мин при 1800 g на центрифуге Beckman TJ-6. Плазму крови удаляли, а клеточный осадок, содержащий форменные элементы крови, доводили до первоначального объема стерильным ФИБ. В стерильную пластиковую пробирку вносили фиколл (Flow Labolatories, США) из расчета 0,5 мл на 1 мл полученной суспензии форменных элементов крови. На фиколл наслаивали суспензию форменных элементов крови и центрифугировали в течение 30 мин. при 1800 g. В стерильных условиях пипеткой с границы раздела плотности отбирали фракцию лейкоцитов. Полученные клетки ресуспендировали в 1 мл стерильного ИФБ, доводили стерильным ИФБ до 50 мл и центрифугировали в течение 15 мин при 1800 g. Последнюю процедуру отмывки клеток проводили трижды. Затем осадок лейкоцитов ресуспендировали в 1 мл среды 199 (GIBCO Europe, UK), содержащей 2 мM L-глютамина, 100 Ед/мл пенициллина, 2,5 мкг/мл фунгизона и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, USA). Количество полученных клеток подсчитывали под микроскопом Amplival (Carl Zeiss, Германия) в гемоцитометре. Клетки рассаживали в стерильные 48-луночные планшеты для клеточных культур (Nunc, Denmark) с плотностью 105 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37єС в течение 1 часа, после чего неприкрепившиеся клетки (грагулоциты) удаляли путем трехкратного промывания средой 199. К прикрепившимся клеткам (агранулоцитам) добавляли по 250 мкл среды 199, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики (преднизолон, стрептомицин и фунгизон), а также глютамин. Полученную чистую культуру моноцитов культивировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37єС в течение 14 суток до превращения их в макрофаги (784). Смену инкубационной среды проводили каждые 48 часов. В экспериментах использовали культуру на 14-й день культивирования. Полученнyю таким образом культуру моноцитов-макрофагов крови человека использовали в клинических исследованиях при серийных измерениях атерогенных свойств сыворотки крови (ее способности вызывать накопление внутриклеточного холестерина).

Получение сыворотки крови

Кровь из локтевой вены в количестве 5-7 мл забирали стерильным одноразовым пластиковым шприцом в сухую пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл. Пробирку с кровью выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа для образования сгустка, затем в холодильнике при +4єС в течение 1 часа для ретракции сгустка. Сгусток отделяли стеклянной палочной от стенок пробирки. Пробирку центрифугировали в настольной центрифуге Beckman TJ-6 при 1800 g в течение 15 мин. Полученную сыворотку крови (без примеси эритроцитов) разливали в пластиковые пробирки типа «Эппендорф» по 1 мл. Образцы сыворотки крови хранили в замороженном состоянии (при -18єС) до проведения измерения атерогенности и других биохимических параметров.

Оценка антиатерогенного эффекта в модели in vitro

Накопление внутриклеточного холестерина в первичной культуре субэндотелиальных клеток из непораженной интимы аорты человека индуцировали с помощью атерогенной сыворотки крови, как описано выше. Одновременно с атерогенной сывороткой крови человека в инкубационную среду добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях. Обычно использовали логарифмический диапазон концентраций исследуемого вещества. Инкубацию, экстракцию липидов из клеток, определение клеточного белка и расчет атерогенного эффекта проводили, как описано выше. Базовый атерогенный эффект сыворотки крови рассчитывали как разницу между содержанием внутриклеточного холестерина в контроле и в клетках, инкубированных в присутствии атерогенной сыворотки без добавления исследуемого вещества, и принимали за 100%. Антиатерогенный эффект исследуемых веществ определяли как их способность статистически достоверно препятствовать накоплению внутриклеточного холестерина, индуцированному атерогенной сывороткой крови.

Определение пролиферативной активности

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл [3H]-тимидина. По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали, как описано выше, а фиксированные на пластике клетки растворяли в в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов. После растворения радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Определение синтеза клеточного белка

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл [14С]-лейцина. По окончании инкубации липиды из клеток экстрагировали, как описано выше, а фиксированные на пластике клетки растворяли в в 50 мкл 0,2 н. NaOH при комнатной температуре в течение 12-16 часов. После растворения радиоактивность измеряли на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Определение синтеза коллагена

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 5 мкКи/мл [3H]-пролина. По окончании инкубации включение меченого пролина в обработанную коллагеназой фракцию культуральной среды определяли по методу Peterkofsky и Diegelmann (571). Из культуры отбирали 500 мкл среды и переносили в стеклянные пробирки. Клетки промывали 2 раза по 250 мкл ФИБ и смывы переносили в те же пробирки. Пробы нагревали в течение 15 мин при 80єС для инактивации протеиназ. После охлаждения до +4єС в пробы добавляли 1 мл 20% ледяной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), содержащей 2 мМ пролина. Спустя 10 мин пробы центрифугировали (10 мин, 3500 g). Супернатант отбрасывали, а осадок промывали трижды 1 мл 5% ТХУ, содержащей 1 мМ пролина. Промытый осадок растворяли в 0,4 мл 0,1 N NaOH, разделяли на аликвоты по 200 мкл и нейтрализовали равным объемом 0,08 N HCl. К одной из аликвот добавляли 80 мкл 60 mM HEPES, содержащего 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,25 мМ CaCl2, 1,25 мМ N-этиленамида, и 20 мкл раствора коллагеназы (1 мг/мл) (Worthington Diagnostic System, США). К другой аликвоте, служившей бланком, добавляли те же вещества за исключением коллагеназы. Пробы инкубировали 4 часа при 37єС. Инкубацию остановливали добавлением 0,5 мл 10% ТХУ, содержащей 0,5% таниновой кислоты. После центрифугирования в течение 10 мин при 1800 g определяли радиоактивность супернатанта на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция). Синтез коллагена определяли по формуле 2*([dpm]образца - [dpm]бланка)/(клеточный белок, мкг).

Изучение внутриклеточного метаболизма эфиров холестерина

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии ЛНП, меченых [3H]-холестериллинолеатом. После инкубации липиды из клеток экстрагировали по методу Hara и Radin, как описано выше (256), а из культуральной среды - по методу Bligh и Dyer смесью хлороформ - метанол в объемном соотношении 1:2 (80). Нейтральные липиды хроматографировали на силикагеле в системе n-гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота в объемном соотношении 75:23:2. Сканирование хроматограммы проводили при длине волны 200 нм на сканнере Shimadzu CS-930 (Shimadzu Corporation, Япония). Участки силикагеля, соответствующие свободному холестерину и эфирам холестерина соскребали и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Изучение внутриклеточного синтеза липидов

Клетки, выделенные из нормальных или пораженных атеросклерозом участков интимы аорты человека, инкубировали в течение 24 ч в присутствии 10 мкКи/мл меченого [14C]-олеата (225). После инкубации липиды из клеток экстрагировали по методу Hara и Radin, как описано выше (256). Хроматографию и денситометрию липидов проводили, как описано выше. Участки силикагеля, соответствующие фосфолипидам, триглицеридам и эфирам холестерина соскребали и измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике 1215 Rackbeta II (LKB, Швеция).

Выделение и фракционирование липопротеидов низкой плотности.

Доноры.

В работе была использована плазма и сыворотка крови мужчин и женщин в возрасте от 30 до 60 лет, больных ишемической болезнью сердца (ИБС), и здоровых лиц (25-55 лет), у которых отсутствовали признаки ИБС в анамнезе и при медицинском обследовании. Содержание холестерина и триглицеридов в плазме крови не превышало 200 мг/дл и 150 мг/дл, соответственно.

Получение плазмы и сыворотки крови

Для получения плазмы кровь забирали утром натощак в пробирку с цитратом натрия (конечная концентрация - 0,38%). Препараты центрифугировали 10 мин при 800хg (2500 об/мин) на цетрифуге TJ-6 (Beckman Instruments, Inc., США). Для предотвращения окисления ЛНП в ходе выделения к полученной плазме добавляли 10 мМ ионола.

Для получения сыворотки кровь забирали из локтевой вены в пластиковую пробирку и инкубировали 1 час при 37оС. Образовавшийся сгусток отделяли от стенок пробирки, после чего сыворотку центрифугировали в течении 15 мин при 800хg (2500 об/мин).

Выделение суммарной фракции липопротеидов низкой плотности из плазмы крови

К плазме добавляли бромид натрия (NaBr) из расчета 0,5 г соли на 1 мл, разливали по 5 мл в 16х76-мм поликарбоновые центрифужные пробирки (Beckman Instruments, Palo Alto, CA) и наслаивали сверху по 5 мл раствора NaBr с плотностью 1,019 г/мл. Пробы центрифугировали в течение 2 часов при 41000 об./мин на центрифуге L8-55 (ротор 65Ti; Beckman Instuments, Inc., США). После ультрацентрифугирования отбирали зону, содержащую ЛНП. В образцы ЛНП снова добавляли NaBr из расчета 0,3 г соли на 1 мл пробы, повторно центрифугировали в тех же условиях и отбирали зону ЛНП. Полученные липопротеиды диализовали при 4оС в течение ночи против 4000 объемов ИФБ рН 7,4 и после этого стерилизовали фильтрацией (диаметр пор 0,45 мкм).

Определение концентрации белка в препаратах ЛНП

Концентрацию белка в препаратах липопротеидов определяли по методу Lowry et al. (1956) c модификациями. К пробе объемом 5-20 мкл добавляли 200 мкл свежеприготовленного 0,2 N раствора NaOH, содержащего 0,01% тартрата калия-натрия, 0,005% сульфата меди и 0,02% карбоната натрия, 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия (Boehringer Mannheim, Германия), затем 20 мкл 1 N реактива Фолина (Sigma Chemical Company, США), перемешивали и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут, после чего измеряли оптическую плотность проб на спектрофотометре "Multiscan MCC" при длине волны 690 нм и рассчитывали концентрацию белка в препарате. В качестве стандарта использовали раствор БСА.

Получение фракций нативных и циркулирующих множественно модифицированных липопротеидов низкой плотности

ЛНП разделяли на нативные и циркулирующие модифицированные методом лектин-хроматографии на Ricinus communis агглютинин (РКA120) агарозе, как описано ранее (Tertov et al., 1990). Для разделения липопротеидов колонки, содержащие 1 мл РКА120-сефарозы (Sigma-Aldrich, США), уравновешивали 10 мл ИФБ, рН 7,2. Наносили 0,5-1 мл препарата липопротеидов, содержащего от 0,2 до 2 мг белка. Колонку промывали тремя миллилитрами ИФБ. При этом на выходе получали фракцию липопротеидов с нормальным содержанием сиаловой кислоты - нативные липопротеиды низкой плотности. Для удаления неспецифически связавшихся с сорбентом липопротеидов колонку промывали десятью миллилитрами ИФБ. Фракцию липопротеидов с низким содержанием сиаловой кислоты - циркулирующие множественно модифицированные липопротеиды - элюировали тремя миллилитрами 50 мМ галактозы.

К полученным липопротеидам добавляли бромид натрия из расчета 0,3 г на 1 мл образца и концентрировали методом ультрацентрифугирования, затем диализовали против 4000 объемов ИФБ, как описано выше.

Анализ ЛНП

Экстракция липидов из ЛНП. Суммарные липиды ЛНП экстрагировали по методу Bligh and Dyer, 1967. Для этого к 25 мкл ЛНП, содержащим 20-35 мкг белка добавляли 450 мкл смеси хлороформ-метанол 1:2 (объем-объем), встряхивали и инкубировали при комнатной температуре 2 часа в закрытых пробирках. Далее смесь центрифугировали (4500 об/мин, 15 мин) и супернатант переносили в другую пробирку. Осадок ресуспендировали в 120 мкл дистиллированной воды и повторяли экстракцию хлороформ-метанолом, описанную выше. Супернатанты объединяли и добавляли 600мкл смеси хлороформа и воды в объемном соотношении 1:1, интенсивно встряхивали и центрифугировали 10 минут при 4500 об/мин. Затем тонкой пастеровской пипеткой отбирали хлороформную фазу, упаривали ее до сухого остатка, который растворяли в 50 мкл смеси хлороформ-метанола 2:1 (объем-объем).

Анализ липидов ЛНП при помощи тонкослойной хроматографии. Изменения липидного состава ферментативно модифицированных липротеидов оценивались при помощи тонкослойной хроматографии. На пластины для тонкослойной хроматографии (Merck, Германия) наносили полученный экстракт липидов ЛНП, а также стандарты липидов. Нейтральные липиды отделяли при помощи хроматографии в системе гексан-ацетон 1:3 (объем-объем). Состав фосфолипидов анализировали при помощи тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 25:15:4:2 (объем-объем-объем-объем). Для визуализации пиков фосфолипидов пластину погружали в раствор CuSO4(3%)/H3PO4(8%) и затем осуществляли нагревание пластины до 150оС. Далее пластины сканировались при помощи денситометра Shimadzu CS-930 (Shimadzu, Япония) при длине волны 200 нм.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Анализ фрагментации апоВ белка ферментативно модифицированных ЛНП проводили при помощи фореза в полиакриламидном геле (ПААГ), используя буферную систему Laemmly (Laemmly et al., 1970). Гели с концентрацией полиакриламида 3 и 7% готовили на основе исходного 30% акриламида и 0,8% N,N-бис-акриламида. Концентрирующий гель - 4% полиакриламид в 0,125 М Трис-HCl, рН 6,8, 0,1% додецилсульфат натрия. Разделяющий гель - 7% полиакриламид в 0,375 М Трис-HCl, рН 8,8, 0,1 % додецилсульфат натрия.

Электрофоретический буфер - 0,05 М Трис, 0,384 М глицин, рН 8,3, Исследуемые образцы (5-10 мкг белка) растворяли в 0,01М Трис-HCl, рН 8,0, 0,001 М ЭДТА, 1% додецилсульфат натрия и нагревали 5 минут при 100оС. При проведении электрофореза поддерживалось напряжение 60 вольт, после вхождения белков в разделяющий гель напряжение поднимали до 120 вольт. Использовали прибор для вертикального электрофореза с пластинами размером 10х10 см, толщина геля 1 мм. Окрашивание геля производили 0,1 25% раствором Coomasie Blue R-250 (Sigma, США).

Электрофорез в агарозном геле. Суммарный поверхностный заряд частиц ЛНП определяли с помощью электрофореза в агарозном геле (Schalkwijk C. et al., 1998). Агарозный гель - 1% агароза в 40 мМ вероналовом буфере, рН 8,5 (40 мМ 5,5-диэтибарбитуровая кислота, 4 мМ ЭДТА). Буфер для электрофореза - 10 мМ Трис-глицин, рН 8,0. Исследуемые образцы белка (5 мкг) растворяли в 10 мМ Трис-глициновом буфере, рН 8,0, содержащем 10% глицерин. Электрофорез проводили в течение 45 минут при напряжении 90 В. Для анализа ЛНП использовали 1 % агарозный гель. Гель фиксировали 100 % метанолом (30 сек), окрашивали при помощи красителя Fat Red 7B. От избытка красителя избавлялись 70 % метанолом. Электрофоретическую подвижность модифицированных ЛНП сравнивали с нативными ЛНП.

Определение тиобарбитуровая кислота (ТБК)-реактивных продуктов. К образцу ЛНП концентрацией 0,4 мг/мл по белку объемом 0,5 мл добавляли 25 мкл 20 мМ ионола (для предотвращения окисления во время теста), перемешивали, добавляли 1,5 мл 1,5% H3PO4 и 0,5 мл 0,5% ТБК, перемешивали, неплотно прикрывали пробирки пробками, выдерживали при 100ОС в течение 45 минут, охлаждали до комнатной температуры, добавляли по 2 мл н-бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 20 минут при 3000 об./мин для достижения расслоения фаз. Далее отбирали верхнюю бутанольную фазу и определяли спектр ее поглощения в области от 515 нм до 550 нм относительно бутанола. Рассчитывали оптическую плотность при 532 нм относительно двух базовых длин волн - 515 нм и 550 нм.

D532/515/550=D532-0,5*(D515+D550)

Содержание ТБК-реактивных продуктов выражали через эквивалентное количество МДА, считая мольный коэффициент экстинкции МДА при 532 нм равным 1,56*105 М-1см-1:

(МДА), мкМ=6,41* D532/515/550*(2000/(объем образца в мл) )

(МДА), нмоль/мг белка = ((МДА), мкМ/ (белок, мг/мл) (Uchiyama et al 1978)

Определение содержания сиаловой кислоты в ЛНП. Использовались по 4 аликвоты из каждого препарата (2 - опытные, 2- контрольные для определения поправки на содержание ТБК-реактивных продуктов). К образцу, содержащему 50-100 мкг ЛНП (по белку), добавляли равный объем трихлоруксусной кислоты, после чего перемешивали и инкубировали 20 минут при 40С. Пробы центрифугировали при 4500 об./мин в течение 10 минут; к осадку добавляли 200 мкл 0,1Н H2SO4 и перемешивали. Образцы гидролизовали при 800С в течение 1 часа. После охлаждения к опытным образцам добавляли 10 мкл 0,2М NaIO4 в 9 М H3PO4, к контрольным - 10 мкл 9М H3PO4; образцы тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Далее к опытным образцам добавляли 100 мкл 10% NaAsO2 в 0,5М Na2SO4 и 0,1N H2SO4, к контрольным 100 мкл 0,5М Na2SO4; образцы тщательно перемешивали до исчезновения желто-коричневого окрашивания. Сразу после этого к пробам добавляли 250 мкл 0,6% раствор тиобарбитуровой кислоты в 0,5М Na2SO4, перемешивали. Далее образцы инкубировали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. В охлажденные пробы добавляли 400 мкл трет-бутанола. Образцы интенсивно перемешивали на вортексе в течение 5 секунд дважды с интервалом 5 минут. Пробы центрифугировали при 4500 об./мин в течение 10 минут для разделения фаз. Из органической фазы отбирали 250 мкл и переносили в 96-луночную планшету и измеряли оптическую плотность при 540 нм (Multiskan Bichromatic (Labsystems OY, Helsinki, Финляндия)). Среднее значение, полученное в контрольных пробах, характеризует содержание ТБК-реактивных продуктов. Его вычитали из среднего значения, полученного в опытных образцах. В качестве стандарта использовался раствор водный сиаловой кислоты 1мг/мл.

Определение степени ассоциации ЛНП и размера ассоциатов

Определение относительного размера ЛНП (метод флуктуации светопропускания). Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания луча лазерного света длинной волны 780 нм на двухканальном агрегометре (модель LA220, НПФ БИОЛА, Россия) (Tertov et al., 1989; 1992). Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации. Увеличение флуктуации светопропускания свидетельствует об увеличении взвешенного среднего оптического радиуса частиц. Это дает возможность оценить изменения среднего размера частиц ЛНП в условных единицах. Данный метод дает качественно схожие результаты с результатами, полученными методом квазиупругого светорассеяния, позволяющего непосредственно определять размер частиц ЛНП (Tertov et al., 1992).

Для изучения ассоциационной способности ЛНП их, как правило, предварительно освобождали от имеющихся ассоциатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и инкубировали при 37оС в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ; GIBCO, Paisley, Великобритания; KCl 0,2 г/л, KH2PO4 0,2 г/л, NaCl 8 г/л, Na2HPO4 1,15 г/л, рН 7,2), содержащем 1 мг/мл ЭДТА.

Определение размера ассоциатов ЛНП. Размеры частиц ЛНП и ассоциатов липопротеидов определяляи методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Autosizer 2 (Malvern Instrument, Великобритания).

Основные характеристики использованных в работе полаксамеров. В работе использованы полаксамеры P85, L61, L81, L64 и F68 (BASF, США), Основные характеристики полаксамеров приведены в таблице 1.

Ультразвуковое сканирование сосудов

Протокол ультразвукового обследования включал сканирование обеих сонных артерий в В-режиме в трех проекциях до области каротидного синуса с помощью линейного датчика 7,5 МГц. Толщину интимомедиального слоя измеряли по видеозаписи с помощью компьютерной программы Prosound (R.Seltzer, США). Измерения проводили на участке общей сонной артерии длиной 10 мм, непосредственно прилегающему к каротидному синусу.

Статистическая обработка данных

Статистическую оценку достоверности различий проводили с использованием пакета SPSS версии 12.0 (SPSS Inc., США). Графическую обработку данных проводили с использованием пакета SigmaPlot версии 7.0 (SPSS Inc., США). Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза. Характер распределения признака определяли с помощью F-теста и теста Колмогорова-Смирнова. После оценки вариабельности признака в отношении нормальности распределения для межгрупповых сравнений использовали тест Манна-Уитни или групповой t-тест, для оценки изменений показателей в динамике использовали тест Уилкоксона или парный t-тест. Для сравнения распределений номинальных показателей и категорийных величин использовали показатель хи-квадрат по Пирсону с поправкой по Йетсу. Для оценки связи клинико-биохимических показателей и их изменений использовали корреляционный анализ по Пирсону с поправкой Бонферрони и регрессионный анализ. В окончательном виде данные для непрерывных величин представляли в виде среднего арифметического значения с указанием стандартной ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфологическая визуализация и анализ распределения липидов в атеросклеротических поражениях человека.

Электронномикроскопический анализ артериальных тканевых образцов обнаружил присутствие клеток, содержащих в цитоплазме липидные включения. В непораженных атеросклерозом образцах интимы липидные включения («липидные капли») встречались достаточно редко, однако в атеросклеротических поражения присутствие липидов интиме являлось характерным явлением. В некоторых интимальных клетках липидные включения были многочисленными, что позволяло классифицировать такие клетки как пенистые клетки.

Электронномикроскопический гистохимический анализ обнаружил присутствие нейтральных липидов и неэтерифицированного холестерина как в прилюминальном, так и в примедиальном субслое интимы. В отличие от прилюминального субслоя, где присутствие нейтральных липидов и неэтерифицированного холестерина было зафиксировано во внеклеточном матриксе, отложение этих компонентов в примедиальном субслое ассоциировалось в основном с измененными эластическими волокнами. В примедиальном субслое 10--15 % эластических волокон имели признаки изменений в результате вакуолизации матрикса этих волокон.

Вакуолизация эластических волокон является, видимо, результатом образования безэластиновых полостей внутри относительно гомогенного эластинового матрикса волокон. Такие полости в эластических волокнах наблюдались как в периферических, так и в центральных частях волокон. Полости в матриксе эластических волокон часто соединялись. Нейтральные липиды преимущественно были локализованы в зонах расположения таких полостей в эластичных волокнах (рис. 2, а, б). При гистохимическом окрашивании с использованием филипина, комплексы филипин-стерол, представлящие собой ламеллярные структуры с расстоянием между ламеллами 10--20 нм, наблюдались в ассоциации с разрушающимися эластическими волокнами (рис. 2, в). В примедиальном субслое комплексы филипин-стерол были обнаружены также во внеклеточном матриксе интимы, где они примыкали к внешней границе эластических волокон. Использование комбинации действия OsO4 и гистохимического окрашивания филипином показало, что некоторые полости в эластических волокнах были заполнены нейтральными липидами и неэтерифицированным холестерином.

Рисунок 2 - Одновременная визуализация нейтральных липидов (по методу: Guyton, Klemp, 1988) и неэтерифицированного холестерина (с использованием филипина (по протоколу: Kruth, 1984), локализованных внутри поврежденного эластического волокна в интиме аорты (а-в).

б - деталь рисунка, а; стрелки показывают зоны локализации нейтральных липидов (а) и на кристаллы неэтерифицированного холестерина (в), выявленного посредством реакции с филипином; э - эластин; масштабная линейка: 1 (а), 0.2 (б) и 0.1 (в) мкм.

В работе мы также проверили, совпадают ли данные по определению количества разных классов липидов, определенных с помощью химического анализа после экстрагирования из криостатных зон интимы аорты и последующим хроматографическим разделением, с содержанием липидов, определенным гистохимически в последовательных срезах тех же образцов ткани. Морфометрический метод использовали для оценки количества липидов, наблюдаемых с помощью окрашивания масляным красным O, тогда как с помощью химического анализа идентифицировали триглицериды, холестерин, эфиры холестерина и фосфолипиды в одних и тех же локусах интимы.

Установили, что между общим количеством липидов, обнаруженных с помощью окрашивания, и количеством эфиров холестерина, свободным холестерином и фосфолипидами существует положительная корреляция (r = 0.72--0.95). Положительная корреляция существовала и между вне- и внутриклеточными липидами (окрашивание масляным красным O) и количеством свободного холестерина, эфиров холестерина и фосфолипидами (r = 0.68--0.95). Не обнаружили значимой корреляции между количеством триглицеридов, идентифицированных химическим способом, и количеством липидов, определенных морфометрически после окрашивания.

Оптимизация клеточной модели для оценки атерогенности ЛНП

Ранее в нашей лаборатории было показано (Супрун, 2000), что адекватной моделью для изучения накопления внутриклеточного холестерина является культура субэндотелиальных клеток, выделенных из непораженной интимы аорты человека. Было продемонстрировано, что первичная культура клеток, выделенных из непораженных участков интимы аорты человека, может считаться адекватной моделью для воспроизведения ключевых проявлений атеросклероза in vitro.

В данном исследовании был рассмотрен вопрос о возможности использования для исследования накопления внутриклеточных липидов более простой в применении и однородной культуры клеток моноцитов-макрофагов, выделенных из крови человека. Для этого сравнили внутриклеточное накопление липидов, вызванное добавлением в культуру моноцитов-макрофагов и в культуру клеток, выделенных из интимы аорты человека сывороток, полученных от 20 больных ишемической болезнью сердца.

Коэффициент корреляции между данными, полученными на этих моделях, составил 0,95 (p=0,012). В настоящем исследовании мы применяли модель моноцитов-макрофагов, так как она не менее информативна, чем более сложная модель клеток, выделенных из интимы аотры человека, но гораздо более доступна.

Ассоциация ЛНП - ключевой фактор их атерогенности

Самоассоциация ЛНП

Под самоассоциацией ЛНП мы понимаем самопроизвольное слияние или слипание липопротеидов между собой. Нативные липопротеиды низкой плотности, выделенные из крови здоровых людей не подвержены самоассоциации (Tertov VV, 1992 ), в то время как модифицированные любым способом ЛНП агрегируют между собой, одновременно они вызывают накопление липидов в культуре гладкомышечных клеток.

Ранее было продемонстрировано (Аксенов, 2007), что дегликозилирование, протеолитическая и липолитическая модификация приводит к самоассоциации ЛНП. Циркулирующие множественно модифицированные ЛНП также склонны к самопроизвольной ассоциации и проявляют атерогенные свойства.

В работе мы использовали два разных подхода для определения степени ассоциации липопротеидов низкой плотности: метод регистрации флуктуации светопропускания и метод квазиупругого лазерного рассеивания. В первом случае мы определяем относительное изменение размера частиц, во втором - абсолютный размер.

...