Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса Maculipennis

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 575.2:575.8:576.875.771

Молекулярногенетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса Maculipennis

Г.Н. Артемов,

В.Н. Стегний

Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск)

С помощью микродиссекции политенных хромосом была выделена ДНК района прикрепления XL хромосомы к оболочке ядра трофоцитов яичников Anopheles messeae Fall. (района 2bc), получена библиотека клонов в плазмидном векторе и проведен анализ первичной последовательности ДНК этого района. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК показал, что район 2bc содержит мобильные элементы, тандемные повторы и гены. Проведен поиск общих последовательностей ДНК, характерных для районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus van Thiel. Большая часть этих последовательностей, способна связывать белки ядерного матрикса. Полученные результаты необходимы для оценки роли последовательности ДНК в реорганизации архитектуры хромосом в ядрах трофоцитов малярийных комаров в процессе видообразования.

Ключевые слова: Anopheles; пространственная организация ядра; политенные хромосомы; мобильные элементы; повторенные последовательности ДНК. хромосома клон яичник

Nuclear envelope attachment DNA region from nurse cells XL chromosome of Anopheles messeae Fall (2b c region) was isolated by microdissection procedure. This DNA was cloned in plasmid vector and sequenced. The analysis in database TBLASTX VectorBase, BLASTN EnsemblMetazoa, FlyBase RepeatMasker, Censor and TandemRepeatsFinder soft reveals that this region consists of transposable elements, tandem repeats and genes. LTRretrotransposons, LINE, described in An. gambiae Giles were found among transposable elements. In 2bc region transposable elements typical of other dipterans, protozoa, vertebrates, plants and other organisms were detected. However, MITE SINE and helitrons typical of dipterous were not found in this region. Tandem repeats are only represented by microsatellites and minisatellites with a small number of copies. Repeats with AAAAG motifs characteristic for DNA nuclear lamina of mice hepatocytes and conservative in evolution were found among tandem repeats. The predomination of repetitive DNA in nuclear envelope attachment region of An. messeae XL chromosome signifies the similarity of this region sequences and constitutive heterochromatin.

Similar sequences that characterize nuclear envelope attachment regions of An. messeae XL and 3R chromosomes and An. atroparvus van Thiel. XL chromosome were searched. Nuclear envelope attachment regions of An. messeae 3R chromosome and An. atroparvus XL chromosome were microdissected. DNA from this regions was used for clone library screening by dotblot hybridization. Homologous sequences were analyzed with ChrClass soft to find their potential capacity to bind intranuclear proteins. It was shown that the major part of these sequences is capable to bind nuclear matrix proteins including nuclear lamina proteins and synaptonemic complex proteins or contain SAR/MAR sequences. Twelve clones from An. messeae 2bc region clones library are homologous with the sequences from An. messeae 3R chromosome nuclear envelope attachment region and eleven clones - with An. atroparvus XL chromosome one. Three clones were identical to all investigated regions. On the basis of the analysis multiplex nuclear envelope attachment regions organization was supposed possible. Probably, nuclear envelope attachment regions consist of the following elements: 1) chromosomspecific and evolutionary conservative; 2) specific for every attachment region; 3) universal for all attachment regions. The obtained results are necessary for estimating DNA sequences significance in chromosome architecture reorganization in malaria mosquitoes nurse cells during speciation.

Key words: Anopheles; malaria mosquitoes; nucleus spatial organization; polytene chromosomes; transposable elements; repetitive DNA.

Проблема организации генома в пространстве ядра в настоящее время является чрезвычайно актуальной. Выделяют три иерархических уровня контроля генетической экспрессии - последовательность ДНК, структуру хроматина и внутриядерную организацию генетического материала [1, 2].

Контроль экспрессии генов на первом уровне довольно хорошо изучен - он связан с работой цисрегуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры, сайленсеры, и трансрегуляторных факторов, включающих ДНКсвязывающие транскрипционные факторы и аппарат транскрипции. Второй уровень регуляции генетической экспрессии связан с представлениями о нуклеосомном коде, когда, главным образом, посттрансляционные модификации гистонов определяют транскрипционный статус последовательности ДНК. Наиболее сложная система контроля работы генома осуществляется на третьем уровне.

Оказывается, что все процессы в ядре происходят в определенной области ядра. Так, было отмечено, что гетерохроматин, который представляет собой в основном повторенные последовательности, небольшое количество генов либо участки генома, в которых транскрипция репрессирована, локализован, прежде всего, на периферии ядра, в то время как активно экспрессирующиеся участки расположены в центре ядра [3]. Позиционирование хромосом в пространстве ядра происходит за счет взаимодействия хроматина с белками ядерного матрикса и, прежде всего, с белками ядерной ламины, которая расположена между внутренней ядерной мембраной и периферическим хроматином . В состав ядерной ламины входят фибриллярные белки - ламины и белки внутри ядерной мембраны, которые с ними ассоциированы [4]. С этими белками взаимодействуют как белки хроматина, так и ДНК. За контакт с белками ядерного матрикса отвечают последовательности SAR/MAR (scaffold associated region/matrix attached region) [5].

Изучение районов хромосом, осуществляющих контакт с ядерной оболочкой, имеет большое значение, т.к. неизвестны механизмы формирования их организации в пространстве в разных тканях и у разных видов . Интересным объектом для исследования районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке являются малярийные комары Anopheles комплекса maculipennis.

В клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов, трофоцитов яичников этих насекомых формируются политенные хромосомы.

Ранее было отмечено [6], что близкородственные виды малярийных комаров комплекса maculipennis отличаются по пространственной организации хромосом в ядрах трофоцитов, а именно - по наличию либо отсутствию контактов с оболочкой ядра, районам локализации этих контактов на хромосомах и морфологическим особенностям районов прикрепления. Так, например, у An. messeae Fall. Ххромосома взаимодействует c ядерной оболочкой районом 2bc, который находится в середине плеча, хромосома 2 не образует контакта с ядерной оболочкой, а хромосома 3 крепится к оболочке ядра при центромерным районом. Пространственная организация хромосом An. atroparvus van Thiel. отличается от An. messeae только по Ххромосоме, которая образует контакт с оболочкой ядра прицентромерным районом. Следует отметить, что несмотря на сходство взаимоотношения хромосом 2 и 3 с ядерной оболочкой, у этих видов морфологические особенности районов прикрепления являются специфичными.

Целью настоящего исследования было определить первичную последовательность ДНК района прикрепления XLхромосомы An. messeae (района 2bc), а также провести сравнительный анализ этой последовательности с последовательностями ДНК районов прикрепления хромосом 3R An. messeae (района 32d) и XL An. atroparvus (района 5а). Результаты данной работы позволят определить последовательности ДНК, которые характеризуют районы прикрепления, а также выявить межвидовые особенности и различия последовательностей этих районов разных хромосом одного вида.

Микродиссекция хромосом. В качестве материала для исследования использовали малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis. Самки An. messeae были собраны в природных популяциях, а самки An. atroparvus были взяты из лабораторной культуры. Препараты готовили по стандартной методике [7]. Проводили микродиссекцию трех районов политенных хромосом - района 2b c XLхромосомы An. messeae (рис. 1, А), 5 а XL An. atroparvus (рис. 1, Б) и 32d An. messeae (рис. 1, В) - как описано в [8].

Рис. 1. Хромосомы XL An. messeae (А), XL An. atroparvus (Б), 3R An. messeae (В): контуром выделены микродиссектированные районы 2bc An. messeae, 5а An. atroparvus и 32d An. messeae; масштабная линейка 20 мкм

Получение библиотеки клонов ДНК района 2bc An. messeae в плазмиде pJET 1.2/blunt. Библиотеку клонов ДНК района 2bc An. messeae получали в плазмиде pJET 1.2/blunt с использованием наборов реактивов CloneJet PCR Cloning Kit (Fermentas), TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas), GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) согласно предложенным протоколам. Было получено 485 колоний E. coli несущих плазмиды со встройками, и выделено 323 образца плазмидной ДНК.

Определение первичной последовательности ДНК района 2bc An. messeae. Определение первичной последовательности в настоящей работе осуществляли с помощью четырехкапиллярного автоматического анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Была получена первичная последовательность для 300 фрагментов ДНК изучаемого района.

Анализ последовательности ДНК района 2bc An. messeae in silico. Полученные после секвенирования последовательности ДНК клонов анализировали in silico. Последовательность клонов проверяли на гомологию с геномами An. gambiae в TBLASTX VectorBase (vectorbase.org/Tools/BLAST/), с геномами видов Drosophila в BLASTN Ensembl Metazoa (metazoan.ensembl.org/ Anopheles_gambiae/blastview/) и FlyBase (flybase.org/blast). Кроме того, был проведен поиск мобильных генетических элементов (МГЭ) с помощью программ RepeatMasker (repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker) и Censor (girinst.org/censor). Полученные последовательности анализировали на наличие тандемных повторов в TandemRepeatsFinder (tandem.bu.edu/trf/trf.html). Была проведена оценка фрагментов на потенциальное сродство с белками ядра с использованием программы ChrClass [9].

Дотблотгибридизация ДНК проб районов 32d An. messeae и 5a An. atroparvus с библиотекой клонов района 2bc An. messeae. Для приготовления зонда использовали реакцию никтрансляции в присутствии биотин11дУТФ. Около 50 нг ДНК клонов библиотеки района 2bc An. messeae после амплификации плазмидной ДНК наносили на положительно заряженную нитроцеллюлозную мембрану (Fermentas). Гибридизацию, отмывку и детекцию проводили с помощью Biotin detection kit (Fermentas) по предложенному протоколу.

Результаты исследования и обсуждение

Общая протяженность области, первичная последовательность которой около 72 тыс. п. н. 58% ATпар нуклеотидов, позволяет утверждать, что район 2bc представляют АТбогатые последовательности. Последовательность ДНК этого района анализировали на предмет МГЭ, тандемных повторов и генов. В изучаемом районе были выявлены все классы нуклеотидных последовательностей. Тандемных повторов обнаружено мало (табл. 1). Среди них выявлены микросателлиты (Mes2bc_273, Mes2bc_426, Mes2bc_430) и минисателлиты (Mes2bc_2, Mes2bc_157, Mes2bc_229, Mes2bc_273, Mes2bc_353) с небольшим числом копий.

Таблица 1. Тандемные повторы района 2bc An. messeae

Сателлитов обнаружить не удалось, видимо, по той причине, что анализу подвергались фрагменты, по длине не превышающие в среднем 250 п . н. Следует обратить внимание, что тандемные повторы, которые входят в состав клонов Mes2bc_2, Mes2bc_157, Mes2bc_175, Mes2bc_229 и Mes2bc_273, имеют мотивы AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG. Эти мотивы гомологичны консенсусу AAAAG, описанному для ДНК ядерной ламины гепатоцитов мыши [10]. Анализ показал большое разнообразие МГЭ в районе 2bc An. messeae (табл. 2). Были обнаружены LTRретротранспозоны и LINEэлементы, а также транспозоны , однако SINE, MITE и гелитроны в районе 2bc не найдены. Были выявлены МГЭ, характерные для An. gambiae, а также МГЭ, описанные у представителей одноклеточных, позвоночных, растений и других таксонов. Эти МГЭ имеют довольно низкий процент дивергенции с обнаруженными у An. messeae даже по сравнению с МГЭ семейства Gypsy An. gambiae. Поиск уникальных последовательностей в районе 2bc An. messeae позволил выявить пять генов (табл. 3). Найденные уникальные последовательности оказались гомологичны генам An. gambiae, функция которых неизвестна. Однако для большинства генов были определены ортологи у D. melanogaster.

Т а б л и ц а 2. Мобильные элементы района 2bc XL хромосомы An. messeae

Таблица 3. Генетический состав района 2bc An. messeae

С целью поиска последовательностей гомологичных для районов прикрепления хромосом An. messeae был проведен скрининг библиотеки клонов района 2bc An. messeae с использованием ДНК района прикрепления хромосомы 3R An. messeae (район 32d). В результате эксперимента было показано, что общими для районов 2bc и 32d An. messeae являются последовательности МГЭ типа DOC6_DM, ретротранспозоны семейств L1 и Erv (табл. 4). Последовательность клона Mes2bc_403, которая представлена в прицентромерных районах хромосом X, 2L, 2R и некартированных сайтах An. gambiae, имеет свойство образовывать контакт с ядерной ламиной. Однако с большей достоверностью ДНК ядерной ламины выявлялась в клонах, содержащих МГЭ L1MC4_5end и HARLEQUIN. Все клоны , кроме Mes2bc_417, обладают свойствами потенциального взаимодействия с ядерными структурами.

Т а б л и ц а 4. Характеристика гомологичных последовательностей районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae

Примечание. СК - синаптонемальный комплекс.

Для поиска эволюционноконсервативных элементов, которые характеризуют районы прикрепления XLхромосом видов An. messeae и An. atroparvus, был проведен скрининг библиотеки клонов 2bc An. messeae с помощью ДНКпробы района 5а An. atroparvus (табл. 5). В результате скрининга было выявлено 11 последовательностей, среди которых отсутствовали кодирующие белки. Около половины выявленных клонов представляли собой ретротранспозоны, и лишь в одном клоне (Mes2bc_ 199) был найден тандемный повтор. Большинство фрагментов после анализа в программе ChrClass было отнесено к классу взаимодействующих с белками розеткоподобных структур и внутриядерным матриксом фибриллярногранулярной сети. В ходе анализа были найдены клоны, характерные для 2bc An. messeae, 32d An. messeae и 5а An. atroparvus, - LINEэлементы (Mes2bc_390 и Mes2bc_417), и последовательность клона Mes2bc_395, которая способна потенциально взаимодействовать с белками ядерного матрикса.

Таким образом, было установлено, что в состав района 2bc XLхромосомы An. messeae входят в основном повторенные последовательности - тандемные повторы и мобильные элементы, тогда как генов в данном районе обнаружено мало. Эти данные свидельствуют о сходстве первичной последовательности района 2bc с гетерохроматиновыми районами хромосом. В результате сравнения последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом разных видов были выявлены гомологичные последовательности, большая часть которых способна взаимодействовать с белками внутриядерных структур.

Т а б л и ц а 5. Характеристика последовательностей, общих для районов прикрепления хромосомы XL An. messeae и An. atroparvus

Эти данные свидетельствуют о функциональном сходстве этих районов, которое является отражением их свойства взаимодействовать со структурными элементами ядра. Однако районы прикрепления разных хромосом должны иметь различия в организации, которые определяют специфику их взаимоотношения с ядерной оболочкой. Результаты сравнения последовательностей ДНК хромосом позволили выявить эти различия.

Предположено, что районы прикрепления хромосом составляют следующие элементы: 1) эволюционно консервативные (обнаруженные в результате сравнения 2bc An. messeae и 5а An. atroparvus); 2) специфичные для каждого района прикрепления (последовательности района 2b c, не выявленные при скрининге библиотеки клонов); 3) консервативные для всех районов прикрепления хромосом (гомологичные последовательности трех сравниваемых районов прикрепления). Гипотеза подтверждается данными анализа последовательности ДНК прицентромерного района хромосомы 2 An. atroparvus [11], в котором авторы выявили хромосомоспецифичные и универсальные последовательности.

Полученные результаты указывают на сложную организацию районов прикрепления хромосом. Необходимо определить причины разнообразия МГЭ в этих районах. Возможно, что перемещения МГЭ и ассоциированных с ними SAR/MAR способны изменять локализацию районов прикрепления на хромосомах либо приводить к возникновению новых сочетаний ассоциированных с ядерной оболочкой последовательностей и тем самым изменять пространственную организацию ядра.

Литература

1. Van Driel R., Fransz P.F., Verschure P.J. The eukaryotic genome: a system regulated at different hierarchical levels // Journal Cell Science. 2003. Vol. 116. P. 4067-4075.

2. Misteli T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function // Cell. 2007. Vol. 128. P. 787-800.

3. Cremer M., Kupper K., Wagler B. et al. Inheritance of gene densityrelated higher order chromatin arrangements in normal and tumor cell nuclei // Journal Cell Biology. 2003. Vol. 162. P. 809-820.

4. Gruenbaum Y., Margalit A., Shumaker D.K., Wilson K.L. The nuclear lamina comes of age // Molecular Cell Biology. 2005. № 6. P. 21-31.

5. Wang T.Y., Chai Y.R., Yuan B.M. Effects and the mechanism of nuclear matrix attachment regions on transgene expression // Chinen Journal Cell Biology. 2004. Vol. 26, № 6. P. 587-590.

6. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто и филогенезе малярийных комаров // Доклады AН СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231.

7. Kumar V., Cornel A.J., Mukabayire O. In situ hybridization to Anopheles polytene chromosomes // Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. London: Chapman and Hall, 1997. P. 337-345.

8. Рубцов Н.Б., Алексеенко А.А., Беляева Е.С. и др. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster // Генетика. 1999. Т. 35, № 1. С. 55-61.

9. Rogozin I.B., Glazko G.V., Glazkov M.V. Computer prediction of sitesassociated with various elements of the nuclear matrix // Briefings in bioinformatics. 1999. Vol. 1, № 1. P. 33-44.

10. Шабарина А.Н., Прилепа Е.И., Глазков М.В. Необычная нуклеотидная последовательность ДНК, выделенная из ядерных оболочек гепатоцитов мыши // Генетика. 2006. Т. 42, № 7. С. 879-886.

11. Grushko O.G., Sharakhova M.V., Stegnii V.N., Sharakhov I.V. Molecular organization of heterochromatin in malaria mosquitoes of Anopheles maculipennis subgroup // Gene. 2009. Vol. 448. P. 192-197.

Размещено на Allbest.ru